Die Untersuchung der Funktion von Coronin A in der frühen Starvation Reaktion von Dictyostelium discoideum Durch Aggregationstests
June 18th, 2016
Die soziale Amöbe Dictyostelium discoideum durchläuft einen Entwicklungsübergang zu einem mehrzelligen Organismus, wenn sie hungert. Das evolutionär konservierte Protein Coronin A spielt eine entscheidende Rolle bei der Initiierung der Entwicklung. Mit Hilfe von Aggregationsassays als Hauptmethode wollen wir die Rolle von Coronin A in der frühen Entwicklung aufklären.
Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, die Coronin-A-abhängige frühe Hungerreaktion von Dictyostelium discoideum zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung von Signalwegen und Faktoren, die an der frühen Entwicklung von Dictyostelium discoideum beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das Potenzial hat, ein Werkzeug für das automatisierte Hochdurchsatz-Screening von entwicklungsinduzierenden Faktoren und Proteinen bereitzustellen, die an der frühen Entwicklungssignalübertragung beteiligt sind.
Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund mehrerer Variablen, die dem Assay inhärent sind, wie z. B. Zelldichten, Adhärenzzeit und Entwicklungszeit, Schwierigkeiten haben. Um dieses Verfahren zu beginnen, züchten Sie DH1,10-Zellen oder corA-defiziente Zellen in einem Erlenmeyerkolben, der HL-5-Medium enthält, bei 22 Grad Celsius in einem Schüttelinkubator bei 160 U/min. Halten Sie die Zellen bei einer Dichte zwischen eins mal 10 zu den vier und zweimal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter.
Um die Zellaggregation zu untersuchen, ernten Sie 10 bis 50 Milliliter logarithmisch wachsender DH1.10-Zellen oder corA-defizienter Zellen, die im DH1.10-Hintergrund erzeugt wurden. Zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei 400 mal g. Dann waren die Zellen zweimal in BSS.
Anschließend werden die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt. Anschließend plattieren Sie die Zellen in einer 24-Well-Platte. Lassen Sie sie eine Stunde lang bei 22 Grad Celsius in BSS haften.
Visualisieren Sie dann die Zellaggregation mit Zeitraffermikroskopie und nehmen Sie alle 135 Sekunden Bilder auf. Um den Einfluss der extern applizierten zyklischen AMP-Impulse auf die Entwicklung von DH1.10-Zellen oder DH1.10-corA-defizienten Zellen zu untersuchen, ernten Sie 10 bis 50 Milliliter der Zellen und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei 400-fachem g. Danach waschen Sie sie zweimal in BSS.
Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen auf eine Dichte von eins mal 10 zu den sieben Zellen pro Milliliter in BSS. Schütteln Sie dann die Kulturen zwei Stunden lang bei 22 Grad Celsius bei 160 U/min, bevor Sie Pulse anwenden.
Legen Sie anschließend zyklische AMP-Impulse mit einer zeitgesteuerten Peristaltikpumpe an. Programmieren Sie die Pumpe so, dass sie über einen Zeitraum von fünf Stunden alle sechseinhalb Minuten einen zyklischen AMP-Impuls von fünf Sekunden abgibt. Ein kritischer Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass die Spitze der zyklischen AMP-Injektion nicht kontinuierlich in die Lösung eingetaucht wird, sondern nur periodisch in die vom Shaker erzeugten Wellen eingetaucht wird.
Nach zyklischer AMP-Anwendung werden die Zellen erneut mit einem Hämozytometer gezählt. Plattieren Sie dann die Zellen in einer 24-Well-Platte und lassen Sie sie eine Stunde lang in BSS haften. Nach 16 Stunden visualisieren Sie die Zellaggregation bei 22 Grad Celsius mit Hellfeldmikroskopie unter Verwendung einer Fünf-fach-Subjektive.
Bei diesem Verfahren wird frisches konditioniertes Medium hergestellt, indem DH1.10-Zellen in der logarithmischen Phase oder DH1.10 corA-defiziente Zellen aus den Schüttelkulturen mit HL5-Medium bei 22 Grad Celsius entnommen werden. Zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 400 mal g. Danach waschen Sie sie dreimal in PBM.
Anschließend zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, suspendieren sie dann in PBM bei einer Dichte von eins mal 10 auf die sieben Zellen pro Milliliter und schütteln sie 20 Stunden lang bei 22 Grad Celsius bei 110 U/min. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 400 g und sammeln anschließend das konditionierte Medium. Anschließend wird das Medium durch Zentrifugieren bei 8.000 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius geklärt.
Anschließend filtrieren Sie das konditionierte Medium durch einen 0,45-Mikrometer-Filter und verdünnen es in PBM dreifach. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, legen Sie sie in eine 24-Well-Platte und lassen Sie sie eine Stunde lang bei 22 Grad Celsius haften. Als nächstes tauschen Sie den Überstand der Zellen gegen ein zuvor vorbereitetes konditioniertes Medium aus.
Nach 16 Stunden visualisieren Sie die Zellaggregation mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie mit einem Fünf-fach-Subjektiven. Hier zeigen die Zellen, denen Coronin-A fehlte, einen Defekt in der frühen Entwicklung und waren nicht in der Lage, mehrzellige Aggregate zu bilden, was der erste Schritt während des Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum ist. In dieser Abbildung wurden die vegetativen Wild-Typ- und corA-defizienten Zellen gewaschen und zwei Stunden lang ausgehungert, bevor sie mit oder ohne 15 tierische oder zyklische AMP alle sechseinhalb Minuten für fünf Stunden in Suspension gepulst wurden.
Durch die Anwendung von exogenen zyklischen AMP-Impulsen wurde der Phänotyp des Wildtyps vollständig wiederhergestellt. In dieser Abbildung wurden exponentiell wachsende Wildtyp- und corA-defiziente Zellen in PBM gewaschen, in Multi-Well-Platten ausgesät und in konditioniertem Medium inkubiert, das aus Wildtyp- oder corA-defizienten hungernden Zellen gewonnen wurde. Die Bilder wurden 16 Stunden nach der Aussaat der Zellen aufgenommen.
corA-defiziente Dictyostelium discoideum, waren in der Lage, alle für die Entwicklungsinduktion erforderlichen Faktoren zu produzieren, waren aber nicht in der Lage, auf diese zu reagieren. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 20 Stunden durchgeführt werden, einschließlich Inkubationszeit, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist zu beachten, dass für verschiedene Stämme eine Anpassung mehrerer Variablen des Assays erforderlich ist, wie z.B. Zelldichte, Adhärenzzeit, Entwicklungszeit.
Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine biochemische Fraktionierung und eine anschließende proteomische Analyse durchgeführt werden, um Faktoren zu identifizieren, die an der frühen Hungerreaktion von Dictyostelium discoideum beteiligt sind. Nach dem Anschauen dieses Videos sollte man ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine frühe Entwicklung in Dictyostelium discoideum unter getauchten Bedingungen induziert, entweder mit konditionierten Medien sowie mit zyklischen AMP-Impulsen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Übersicht
Diese Studie untersucht die Rolle von Coronin A in der frühen Hungerreaktion der sozialen Amöbe Dictyostelium discoideum. Die Forschung zielt darauf ab, die Signalwege zu klären, die am Übergang des Organismus zur Multizellularität während des Hungers beteiligt sind.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Entwicklungsbiologie
- Zellbiologie
- Mikrobiologie
Hintergrund
- Dictyostelium discoideum ist ein Modellorganismus für die Untersuchung der zellulären Entwicklung.
- Coronin A ist ein evolutionär konserviertes Protein, das für die Einleitung der Entwicklung entscheidend ist.
- Der Organismus durchläuft unter Hungerbedingungen einen bedeutenden Übergang von einzelligen zu mehrzelligen Formen.
- Das Verständnis dieses Prozesses kann Einblicke in entwicklungsbiologische Signalmechanismen liefern.
Zweck der Studie
- Um die Coronin-A-abhängige frühe Hungerreaktion in Dictyostelium discoideum zu untersuchen.
- Um wichtige Signalwege und Faktoren zu identifizieren, die an der frühen Entwicklung beteiligt sind.
- Um eine Methode für das Hochdurchsatz-Screening von entwicklungsinduzierenden Faktoren zu entwickeln.
Verwendete Methoden
- Aggregationsassays zur Untersuchung von Entwicklungsübergängen.
- Wachstum von DH1.10 und corA-defizienten Zellen in HL-5-Medium.
- Aufrechterhaltung spezifischer Zelldichten während des Experiments.
- Nutzung eines Schüttelschranks für optimale Wachstumsbedingungen.
Hauptergebnisse
- Coronin A spielt eine bedeutende Rolle in der frühen Entwicklung von Dictyostelium discoideum.
- Wichtige Faktoren und Signalwege, die an der Hungerreaktion beteiligt sind, wurden identifiziert.
- Das Potenzial für ein automatisiertes Screening von Entwicklungsfaktoren wurde demonstriert.
- Herausforderungen, denen sich Neueinsteiger bei der Methode gegenübersehen, wurden angegangen.
Schlussfolgerungen
- Die Studie verbessert das Verständnis der Entwicklungsbiologie in Dictyostelium discoideum.
- Coronin A ist essentiell für die Einleitung der mehrzelligen Entwicklung.
- Die Erkenntnisse können zu weiteren Forschungen über entwicklungsbiologische Signalwege führen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Early-stage aggregation assays in Dictyostelium discoideum enable mechanistic de-risking of protein function upstream of key signaling cascades. This approach supports predictive confidence in target validation by isolating the role of coronin A in multicellular development initiation. The method provides a robust platform for functional interrogation of signaling components relevant to developmental and cell signaling research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional dissection of protein roles in early developmental signaling.
- Supports biological de-risking by clarifying upstream pathway dependencies.
- Facilitates predictive confidence in target selection for further study.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for high-throughput screening of development-inducing factors.
- Standardizes aggregation readouts for reproducibility and quantitative comparison.
- Enables scalable evaluation of protein function in multicellular transition models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early mechanistic findings with downstream pathway analysis in disease-relevant systems.
- Provides continuity from discovery-stage functional assays to preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying pathway bottlenecks.
Pipeline & Workflow Integration
This aggregation assay positions upstream of cAMP signaling, bridging early discovery biology with downstream screening and analytics in the developmental signaling workflow.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing for protein function in starvation-induced development.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative aggregation outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables measurement of aggregation phenotypes and response to exogenous factors.
- Translational Research: Provides mechanistic insights that inform preclinical model selection.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable assay platform for functional genomics and pathway interrogation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes assay conditions for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of signaling targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, aggregation assays, and time-lapse microscopy.
- Needs access to controlled incubators, peristaltic pumps, and quantitative imaging systems.
- Demands cross-team standardization of cell densities, adherence times, and development intervals.
- May require adaptation of assay variables for different genetic backgrounds or model systems.
- Dependent on precise control of exogenous factor delivery and environmental conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Observe the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Time-lapse Microscopy
2:14
cAMP Pulsing of Dictyostelium discoideum Cells During Starvation
3:54
Induction of Dictyostelium discoideum Development Through Exposure to Conditioned Medium
5:32
Results: cAMP Pulses Rescue the Early Developmental Defect of corA- Dictyostelium discoideum
6:45
Conclusion
