Name: Die Untersuchung der Funktion von Coronin A in der frühen Starvation Reaktion von Dictyostelium discoideum Durch Aggregationstests (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Aggregationsassays zur Untersuchung der Coronin-A-abhängigen frühen Hungerreaktion von Dictyostelium discoideum durchführen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von Signalwegen und Entwicklungsfaktoren.

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Wir danken dem Dictyostelium Stock Center für die Stämme und Reagenzien. Diese Studie wurde durch Beiträge des Schweizerischen Nationalfonds und des Kantons Basel finanziert.

<ol><li> Beachten Sie die frühen Hunger Reaktion von Dictyostelium discoideum durch Zeitraffer-Mikroskopie. <ol><li> Wachsen DH1.10 Zellen oder CORA - defizienten Zellen in einem Erlenmeyerkolben, der HL-5 - Medium (für 1 L: 5 g Proteosepepton, 5 g thiotone E Pepton, 10 g Glucose, 5 g Hefeextrakt, 0,35 g Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0,35 g KH 2 PO 4, 0,05 g Dihydrostreptomycin-Sulfat, pH 6,6) bei 22 ° C in einem Schüttelinkubator mit einer Rotation von 160 Umdrehungen pro Minute. Halten Zellen mit einer Dichte zwischen 0,01 x 10 6 Zellen / ml und 2 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Untersuchen Zellaggregation durch Ernte log-Phase wachsende Zellen DH1.10 21 oder CORA - defizienten Zellen 10 im Hintergrund DH1.10 erzeugt wird , bei 22 ° C in Schüttelkultur mit HL-5 - Medium gezüchtet. Um dies zu tun, nehmen Sie entsprechende Menge an Zellen (in der Regel zwischen 10 und 50 ml), Zentrifuge 3 min bei 400 xg und waschen Sie die zweimal Zellen in BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, pH 6.5). </li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Anschließend Platten Zellen bei einer Dichte von (5, 10, 20 oder 40) x 10 4 Zellen / cm 2 in eine 24-Well - Platte. Damit sie für 1 h bei 22 ° C in BSS zu haften. </li><li> Visualisieren Sie die Aggregation von Zeitraffer-Mikroskopie wie vor 10 beschrieben, Bilder alle 135 sec nehmen. unter Verwendung der entsprechenden Software automatisiert eine Live - Cell - Imaging eingerichtet , ausgestattet mit 5X Objektiv und einer Elektronenvervielfachungs charge-coupled device - Kamera (siehe Materialien Tabelle). </li></ol></li><li> cAMP Pulsieren von Dictyostelium discoideum Zellen während der Hungertod. <ol><li> Untersuchen die Wirkung von außen aufgebrachten cAMP Impulse auf die Entwicklung von Zellen DH1.10 21 oder DH1.10 CORA - defizienten Zellen 10, durch die Zellen zu ernten. Um dies zu tun, nehmen Sie entsprechende Menge an Zellen (in der Regel zwischen 10 und 50 ml), Zentrifuge 3 min bei 400 xg und waschen zweimal in BSS. </li><li> count - Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Resuspendieren der Zellen zu einer Dichte von 1 x 10 7 Zellen / ml in BSS. Schütteln der Kulturen (160 rpm) bei 22 ° C für 2 Stunden vor der Anwendung von Impulsen. In cAMP Impulse mit einer Zeitschaltuhr gesteuert peristaltische Pumpe. alle 6,5 Minuten von 15 ul 50 nM cAMP (Endkonzentration) über einen Zeitraum von 5 Stunden zu liefern Programmieren Sie die Pumpe mit einem 5 s Puls. </li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Anschließend wird die Platte , die Zellen in einer Dichte von (5, 10, 20 oder 40) x 10 4 Zellen / cm 2 in eine 24-Well - Platte. Lassen Sie für 1 Stunde in BSS einzuhalten. </li><li> Visualisieren Aggregation nach 16 Stunden bei 22 ° C von Hellfeld-Mikroskopie ein 5fach Ziel verwenden. </li></ol></li><li> Die Induktion von Dictyostelium discoideum Entwicklung durch den Zugang zu konditionierten Medium. <ol><li> Bereiten Sie frisch konditioniertes Medium als 22 beschrieben. Sammeln Sie log-Phase DH1.10 Zellen 21 oder DH1.10 CORA - defizienten Zellen 10, von Kult Schüttelnmen mit HL-5 - Medium bei 22 ° C mit einer Pipette, Zentrifuge für 3 min bei 400 xg und wasche die Zellen dreimal in PBM (0,02 M Kaliumphosphat, 10 &amp; mgr; M CaCl 2 und 1 mM MgCl 2, pH 6.1) verwendet wird . </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers resuspendieren diese in PBM in einer Dichte von 1 x 10 7 Zellen / ml und schüttle 20 Stunden bei 110 rpm / 22 ° C. </li><li> Sammeln konditionierten Medium nach der Zentrifugation bei 400 × g für 3 min und Klärung durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Filter konditionierte Medium durch ein 0,45 - um - Filter (siehe Materialien Tabelle) und dreifach in PBM verdünnen. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Platte bei einer Dichte von (5, 10, 20 oder 40) x 10 4 Zellen / cm 2 in eine 24-Well - Platte. Damit sie für 1 h bei 22 ° C zu halten. </li><li> Wechselüberstand der Zellen mit dem vorher konditionierten Medium hergestellt. </li><li> Visualisieren Aggregation einN ach 16 Stunden von Hellfeld-Mikroskopie ein 5fach Ziel verwenden. </li></ol></li></ol>

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<li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Dev Biol. 391, 1-16 (2014).</li>
</ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Die Coronin Proteine ​​werden in den meisten Taxa der eukaryotischen Klade. Dictyostelium discoideum Coronin A, das Homolog von Säuger Coronin 1, gefunden wird im frühen Verhungern Antwort beteiligt, da Coronin A-defizienten Zellen Aggregationsstellen nicht in der Lage sind , während der frühen Entwicklungs zu bilden Zyklus 10. Um in der Lage sein, um quantitativ und genau die Verzögerung in der Entwicklung zwischen den Stämmen beurteilen zu können, ein Mikroskop Live Cell Imaging Set-up mit dem auto...

Die Coronin Familie von Proteinen ist stark in ganz Eukaryoten konserviert. Diese Proteine ​​werden durch die Gegenwart eines Amino-terminalen Tryptophan-aspartat (WD) wiederholen haltigen Bereich , gefolgt von einer einzigartigen Region verbunden mit einem carboxy-terminalen coiled-coil Domäne 13,14 (Figur 1) charakterisiert. Coronine wurden in einer Vielzahl von zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich der Zytoskelett - Regulation und Signaltransduktion 12. Bei Säugetieren bis zu sechs kurze Coronin Moleküle (Coronin 1-6) sowie ein &quot;Tandem&quot; Coronin 7 können coexprimiert 12,15 werden. Coronin 1 ist das am intensivsten untersuchten Familienmitglied und wurde pathogen Zerstörung, T-Zell-Überleben und die neuronalen Signalübertragung beteiligt werden gezeigt. Wie genau Coronin 1 trägt diese Aktivitäten aus, bleibt unklar. Während Coronin 1 wurde gezeigt , Ca 2+ und cAMP-abhängige Signalgebung sowie F-Aktin - Zytoskelett Modulation 16-18, das Potential co zu regulieren-Ausdruck von bis zu 7 Familienmitglieder in Säugetieren hat es schwierig, das Molekular Funktion Coronine in diesen Systemen zu untersuchen, aufgrund potentieller Redundanzen. Im Gegensatz zu Säugetierorganismen exprimiert die niederen Eukaryoten Dictyostelium discoideum nur zwei Coronin Familienmitglieder (Coronin A, das Ortholog von Säugetier Coronin 1 und Coronin B, das Ortholog von Säugetier Coronin 7) mit scheinbar nicht-redundante Funktionen 15,19,20. Diese Tatsache macht Dictyostelium discoideum ein starkes Modell , um die Funktion von Coronine zu studieren. Um die Rolle von Coronin A in Dictyostelium discoideum studieren, induziert wir den Entwicklungszyklus durch Verhungern in Gewebekulturplatten mit ausgeglichener Salzlösung (BSS) Puffer entweder Wildtyp - Zellen oder Zellen mit fehlenden A 10 Coronin. Wir fanden heraus, dass Zellen ohne Coronin A waren nicht in der Lage mehrzelligen Aggregate auf Hunger zu bilden. Für eine genaue quantitative Beurteilung dieser Phänotyp derautomatisierte Live Cell Imaging in diesem Protokoll beschrieben ist ein wichtiges Instrument. Der Defekt in der Einleitung des frühen Verhungern Reaktion in Zellen Coronin A fehlt, kann durch Zuführen von Pulsen von cAMP gerettet werden, was darauf hindeutet, dass eine Akte vor der cAMP-Kaskade Coronin. Die exogene Applikation von cAMP Impulse für die Einleitung der Entwicklung zu simulieren wurde von mehreren Laboratorien in der Vergangenheit 8,9 verwendet worden. Jedoch ist dieses Verfahren auch in hohem Maße von Zelldichten und den Zeitpunkt bekannt sein. Daher beschrieben das Protokoll hier zum Ziel, diese Variabilitäten zu reduzieren, um ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Zusammengenommen sind die verwendeten Techniken in diesen Studien liefern robuste Werkzeuge Funktionen von Proteinen während der frühen Phasen des Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum zu untersuchen und haben das Potenzial , zu identifizieren Up- sowie Downstream - Effektoren einer Funktion Coronin.

<table><tbody><tr><td>HL-5 Medien (für 1 L: 5 g Proteose-Pepton, 5 g Thioton E Pepton, 10 g Glukose, 5 g Hefeextrakt, 0,35 g Na2HPO4*2H2O, 0,35 g KH2PO4, 0,05 g Dihydrostreptomycin-sulfat, pH 6,6)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteose Pepton</td><td>BD Bioscience</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>Thioton E Pepton</td><td>BD Bioscience 211684</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>BD Bioscience</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>AppliChem</td><td>A3666</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4*2H2O</td><td>Fluka</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1043</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrostreptomycin-sulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1954000</td><td></td></tr><tr><td>PBM (0,02 M Kaliumphosphat, 10 &mu; M CaCl2 und l mM MgCl2, pH 6,1)</td><td></td><td></td><td>selbst hergestelltes</td></tr><tr><td>BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, pH 6,5)</td><td></td><td></td><td>selbst hergestellt</td></tr><tr><td>0,45-&mu; m Filtropure S Filter</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1H</td><td></td></tr><tr><td>Cellobserver Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>kundenspezifische</td></tr><tr><td>AxioVision Software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPC Mikroprozessor gesteuerte Dosierpumpe</td><td>ISMATEC</td><td>ISM 931</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 135M Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>491237-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Inkubationsschüttler</td><td>Inforst HT Minitron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

die untersuchung der funktion von coronin a in der frühen starvation reaktion von<em&gt; dictyostelium discoideum</em&gt; durch aggregationstests

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum Amöbe sind im Boden und ernähren sich von Bakterien gefunden. Wenn Nahrungsquellen knapp werden, sie Faktoren absondern einen vielzelligen Entwicklungsprogramm zu initiieren, in denen 1-4 einzelne Zellen chemotax zur Aggregation Zentren. Dieser Prozess ist abhängig von der Freisetzung von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) 5. cAMP wird in Wellen durch die konzertierte Aktion der Adenylatcyclase und Phosphodiesterasen produziert und bindet an G - Protein-gekoppelten Rezeptoren cAMP 6,7. Ein weit verbreiteter Test die Mechanismen in dem Entwicklungszyklus des niederen Eukaryoten Dictyostelium discoideum beteiligt zu analysieren ist in submersen Bedingungen 8,9 auf der Beobachtung der Zellaggregation basiert. Dieses Protokoll beschreibt die Analyse der Rolle von Coronin A im Entwicklungszyklus durch Verhungern in Gewebekulturplatten unter Wasser in ausgewogener Salzlösung (BSS) 10. Coronin A ist ein Mitglied der weitgehend konservierten protein Familie von Coronine , die 11,12 in einer Vielzahl von Aktivitäten eine Rolle spielen . Dictyostelium Zellen ohne A Coronin sind unfähig mehrzelligen Aggregate zu bilden, und dieser Fehler kann durch Zuführen von Pulsen von cAMP gerettet werden, was darauf hindeutet , dass eine Akte stromaufwärts von der Coronin cAMP Kaskade 10. Die Techniken , die in diesen Studien beschriebenen liefern robuste Werkzeuge Funktionen von Proteinen während der Anfangsstadien des Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum stromauf der cAMP - Kaskade zu untersuchen. Daher erlauben die weitere Untersuchung der Coronin Eine Funktion und unser Verständnis der Biologie Coronin kann diese Aggregation Assay verwendet.

Die Zellen einen Mangel an einer Show einen Defekt in der frühen Entwicklung Coronin (Abbildung 2). In Abwesenheit von A - Zellen nicht in der Lage Coronin mehrzellige Aggregate zu bilden, die der erste Schritt während des Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum ist. Daher erscheint Coronin A eine Rolle während der frühen Hungerantwort und / oder cAMP-Signalisierung zu spielen. Tatsächlich ist das Fehlen von mehrzelligen Aggregatbildung in Abwesenheit vo...

Die soziale Amöbe Dictyostelium discoideum durchläuft einen Entwicklungsübergang zu einem mehrzelligen Organismus, wenn sie hungert. Das evolutionär konservierte Protein Coronin A spielt eine entscheidende Rolle bei der Initiierung der Entwicklung. Mit Hilfe von Aggregationsassays als Hauptmethode wollen wir die Rolle von Coronin A in der frühen Entwicklung aufklären.

Die Untersuchung der Funktion von Coronin A in der frühen Starvation Reaktion von<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Durch Aggregationstests

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens besteht darin, die von Coronin-A abhängige frühe Hungerantwort von Dictyostelium discoideum zu untersuchen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung von Signalwegen und Faktoren, die an der frühen Entwicklung von Dictyostelium discoideum beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein Werkzeug für die automatisierte und hochdurchsatzfähige Analyse von Entwicklungs auslösenden Faktoren und Proteinen bieten kann, die an der frühen Entwicklungs-Signalübertragung beteiligt sind.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten aufgrund der zahlreichen Variablen, die dem Assay inhärent sind, wie Zelldichten, Adhärenzzeit und Entwicklungsdauer. Um dieses Verfahren zu beginnen, kultivieren Sie DH1.10-Zellen oder corA-defiziente Zellen in einem Erlenmeyerkolben mit HL-5-Medium bei 22 Grad Celsius in einem schüttelnden Inkubator mit 160 U/min. Halten Sie die Zellen bei einer Dichte zwischen 1 × 10⁴ und 2 × 10⁶ Zellen pro Milliliter.Um die Zellaggregation zu untersuchen, gewinnen Sie 10 bis 50 Milliliter log-phase wachsender DH1.10-Zellen oder in diesem Hintergrund erzeugter corA-defizienter Zellen. Zentrifugieren Sie sie drei Minuten bei 400 × g. Anschließend waschen Sie die Zellen zweimal in BSS.Anschließend die Zellen mit einem Hämozytometer zählen. Danach die Zellen in einer 24-Well-Platte ausplattieren. Sie eine Stunde bei 22 Grad Celsius in BSS anhaften lassen.Danach die Zellaggregation mittels Zeitraffermikroskopie visualisieren und alle 135 Sekunden Bilder aufnehmen. Um den Einfluss extern zugeführter cAMP-Pulse auf die Entwicklung von DH1.10-Zellen oder DH1.10 corA-defizienten Zellen zu untersuchen, 10 bis 50 Milliliter der Zellen ernten und drei Minuten bei 400 × g zentrifugieren. Anschließend die Zellen zweimal in BSS waschen.Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Suspendieren Sie die Zellen anschließend erneut mit einer Dichte von 1 × 10⁷ Zellen pro Milliliter in BSS. Schütteln Sie die Kulturen dann für zwei Stunden bei 22 °C mit 160 U/min, bevor Sie die Pulse anwenden.Als Nächstes werden zyklische AMP-Pulse mithilfe einer zeitgesteuerten peristaltischen Pumpe appliziert. Programmieren Sie die Pumpe so, dass sie alle sechs Minuten und dreißig Sekunden über einen Zeitraum von fünf Stunden jeweils einen fünfsekündigen Puls von zyklischem AMP abgibt. Ein kritischer Schritt besteht darin sicherzustellen, dass die Spitze der zyklischen AMP-Injektion nicht kontinuierlich in der Lösung eingetaucht ist, sondern nur periodisch in die vom Schüttler erzeugten Wellen eintaucht.Nach der Applikation von cyclischem AMP zählen Sie die Zellen erneut mithilfe eines Hämozytometers. Anschließend geben Sie die Zellen in eine 24-Well-Platte und lassen sie sich eine Stunde lang in BSS anheften. Nach 16 Stunden visualisieren Sie die Zellaggregation bei 22 Grad Celsius mittels Hellfeldmikroskopie mit einem 5x-Objektiv.Bereiten Sie bei diesem Verfahren frisches konditioniertes Medium vor, indem Sie log-phase DH1.10-Zellen oder DH1.10 corA-defiziente Zellen aus schüttelnden Kulturen mit HL5-Medium bei 22 Grad Celsius sammeln. Zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 400 × g. Waschen Sie sie danach dreimal in PBM.Anschließend die Zellen mit einem Hämozytometer zählen. Danach in PBM erneut suspendieren, sodass eine Dichte von 1 × 10⁷ Zellen pro Milliliter vorliegt, und 20 Stunden lang bei 22 °C mit 110 U/min schütteln. Danach die Zellen bei 400 × g für drei Minuten zentrifugieren und anschließend das konditionierte Medium sammeln. Danach das Medium durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C klären.Danach filtrieren Sie das konditionierte Medium über einen 0,45-Mikrometer-Filter und verdünnen es im Verhältnis 1:3 in PBM. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, geben Sie sie in eine 24-Well-Platte und lassen Sie sie eine Stunde lang bei 22 Grad Celsius anhaften. Danach tauschen Sie das Überstandmedium der Zellen gegen zuvor hergestelltes konditioniertes Medium aus.Nach 16 Stunden visualisieren Sie die Zellaggregation mit Hellfeldmikroskopie unter Verwendung eines 5x-Objektivs. Hier zeigen die Zellen, die an Coronin-A defizient sind, einen Defekt in der frühen Entwicklung und waren nicht in der Lage, vielzellige Aggregate zu bilden, was der erste Schritt im Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum ist. In dieser Abbildung wurden die vegetativen Wildtyp- und corA-defizienten Zellen gewaschen und zwei Stunden lang hungern gelassen, bevor sie fünf Stunden lang alle sechs Minuten und dreißig Sekunden mit oder ohne 15 nmol cAMP in Suspension gepulst wurden.Die Anwendung exogener cAMP-Pulse stellte das Wildtyp-Phänotyp vollständig wieder her. In dieser Abbildung wurden exponentiell wachsende Wildtyp- und corA-defiziente Zellen in PBM gewaschen, in Mehrfach-Platten ausgesät und in konditioniertem Medium inkubiert, das von Wildtyp- oder corA-defizienten hungernden Zellen stammte. Die Aufnahmen wurden 16 Stunden nach der Aussaat der Zellen angefertigt.corA-defiziente Dictyostelium discoideum konnten alle für die Entwicklungsinduktion erforderlichen Faktoren produzieren, waren jedoch nicht in der Lage, darauf zu reagieren. Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann sie in 20 Stunden durchgeführt werden, einschließlich der Inkubationszeit, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass für verschiedene Stämme eine Anpassung mehrerer Variablen des Assays erforderlich sein wird, wie beispielsweise der Zelldichten, der Adhärenzzeit und der Entwicklungszeit.Nach Durchführung dieses Verfahrens können biochemische Fraktionierung und anschließende proteomische Analyse durchgeführt werden, um Faktoren zu identifizieren, die an der frühen Hungerantwort von Dictyostelium discoideum beteiligt sind. Nach dem Anschauen dieses Videos sollte man ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die frühe Entwicklung von Dictyostelium discoideum unter versenkten Bedingungen induziert, wobei entweder konditioniertes Medium oder zyklisches AMP-Pulse verwendet werden.

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