Die gleichzeitige Bewertung der Cardiomyocyte DNA-Synthese und Ploidy: Ein Verfahren zur Förderung des Quantifizierung von Cardiomyocyte Regeneration und Umsatz

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, den Kardiomyozytenumsatz unter Verwendung von Langzeit-Nukleosidmarkierung und Durchflusszytometrie zu quantifizieren, um die Neokardiomyozytenkerne zu quantifizieren und gleichzeitig die Polyploidisierung der Zellkerne zu berücksichtigen. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Kardiomyozytenregeneration zu beantworten, und sie kann als Screening-Instrument zur Quantifizierung von Veränderungen in der Dynamik der Kardiomyozytenbildung verwendet werden. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es eine empfindliche und genaue Quantifizierung der Erzeugung von Neokardiomyozyten ermöglicht, unabhängig von der zellulären Quelle und unter Kontrolle der Polyploidierung.

24 Stunden nach der sechsten EdU-Injektion bringen Sie das behandelte Tier in Rückenlage und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen Hautschnitt vom Mittelbauch bis zum Zwerchfell vorzunehmen. Halten Sie dann das Brustbein von der Körperhöhle weg und schneiden Sie das Zwerchfell beidseitig durch, um das Herz freizulegen. Heben Sie dann das Herz leicht an und durchtrennen Sie die großen Blutgefäße des Ausflusstrakts, um das Herz aus der Brusthöhle zu präparieren.

Unmittelbar nach der Ernte werden die Herzen in einzelne 15-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben, die 10 ml PBS enthalten, das auf vier Grad Celsius gekühlt ist. Übertragen Sie dann die Proben in einzelne 10 cm große Petrischalen und schneiden Sie mit einem Skalpell jedes Herz in sagittaler Ausrichtung in zwei Stücke. Drücken Sie anschließend die Herzstücke vorsichtig mit einer Pinzette zusammen.

Entfernen Sie beide Herzstücke und geben Sie sie in eine Petrischale mit 20 ml frischem PBS. Wiederholen Sie dies erneut mit einer neuen Petrischale und 20 ml frischem PBS. Legen Sie beide Teile des Herzens in dasselbe 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und bohren Sie mit einer 25-Gauge-Nadel ein kleines Loch in den Deckel jedes Röhrchens, um zu verhindern, dass sich der Deckel öffnet, wenn das Herz verarbeitet wurde.

Beschriften Sie dann jedes Röhrchen und frieren Sie das Herzgewebe in einem Behälter mit flüssigem Stickstoff ein. Für jedes zu analysierende Herz werden 36 ml mit einem Prozent BSA und PBS in einem Ultra-Zentrifugenröhrchen inkubiert. Entsorgen Sie die Lösung nach 30 Minuten.

Wenn die Röhrchen an der Luft getrocknet sind, geben Sie 10 ml Saccharosegradientenlösung in jedes Röhrchen. Nachdem Sie die gefrorenen Herzproben mit flüssigem Stickstoff einzeln mit dem Skalpell zerkleinert haben, werden die Gewebefragmente von jedem Herzen in einzelne konische 50-ml-Röhrchen mit 15 ml Zelllysepuffer überführt. Homogenisieren Sie die Proben 15 Sekunden lang bei 25.000 U/min mit einem Sonden-Homogenisator bei Raumtemperatur.

Geben Sie dann 15 weitere mL Lysepuffer in jedes Röhrchen und überführen Sie die Proben nacheinander mit einem großen Clearance-Stößel in einen 40 mL Dounce. Führen Sie 10 Hübe mit dem Stößel durch und filtrieren Sie die Zellschlämme durch ein 100-Mikron-Sieb, gefolgt von einem 40-Mikron-Zellsieb in einzelne 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Sammeln Sie dann die nuklearen Herzpellets durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Zellen in jeweils 25 ml Saccharose-Gradientenlösung.

Schichten Sie die Zellen auf den kernfreien Saccharosegradienten in den vorbereiteten Ultrazentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Schichten mit einem Ausschwingrohrrotor. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Kernpellets in 1.300 Mikrolitern Zellkernspeicherpuffer und überführen Sie die Kerne in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung PCM1. Übertragen Sie 300 Mikroliter jeder Suspension aus den PCM1-Röhrchen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 700 Mikroliter frischen Kernlagerpuffer hinzu und markieren Sie die ISO-Kontrolle.

Als nächstes markieren Sie die PCM1-Kerne mit einem Anti-PCM1-Antikörper und die ISO-Kontrollkerne mit einem Schnell-IGG-Isotyp-Kontrollantikörper über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag schleudern Sie die Proben herunter und resuspendieren Sie die Pellets in einem ml frischem Kernpuffer für eine zweite Zentrifugation unter denselben Bedingungen. Nach dem zweiten Spin resuspendieren Sie die Pellets in einem ml frischem Zellkern-Speicherpuffer und inkubieren Sie die Zellkerne mit einem Mikroliter eines fitzy-konjugierten F(ab'2-Fragments von einem Ziegen-Anti-tollwütigen IGG-Antikörper für eine Stunde bei vier Grad Celsius im Dunkeln.

Um den Grad des EdU-Einbaus zu bewerten, zentrifugieren Sie die PCM1- und ISO-kontrollierten markierten Kernsuspensionen und resuspendieren Sie die Pellets in einem ml 1%BSA PBS zweimal für zwei aufeinanderfolgende Wäschen. Ersetzen Sie nach dem zweiten Waschen den Überstand durch 100 Mikroliter EdU-Fixiermittel und inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Am Ende der Fixierung waschen Sie die Zellkerne zwei weitere Male in einem ml PBS BSA und inkubieren Sie die Proben mit 100 Mikrolitern Permeablisierungslösung auf Saponinbasis bei Raumtemperatur.

Geben Sie nach 15 Minuten 500 Mikroliter frisch zubereiteten EdU-Etikettiercocktail in jedes Röhrchen für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation schleudern Sie die Proben dreimal herunter und waschen Sie die Zellkerne in einem ml PBS BSA während der zweiten beiden Zentrifugationen. Zum Schluss beschriften Sie die Proben mit 400 Mikrolitern DNA-Färbelösung.

Die immunhistologische Analyse der gepulsten Herzen zeigt das Vorhandensein von PCM1-exprimierenden Kardiomyozyten, die EdU eingebaut haben. Die mit immunhistologischen Methoden gewonnenen Daten können jedoch falsch interpretiert werden, da andere Zelltypen, die EdU eingebaut haben, fälschlicherweise als Kardiomyozyten identifiziert werden können. In einer Studie an mdx- und Kontrollmäusen ermöglicht die in diesem Protokoll beschriebene Durchflusszytometrie-Analyse eine schnelle Quantifizierung der Zellkernbildung von Neokardiomyozyten, während gleichzeitig die Zellen, die EdU in die Depolyploidisierung eingebaut haben, ausgeschlossen werden.

Ähnlich wie bei zuvor veröffentlichten Daten wurde in diesem repräsentativen Experiment eine Zunahme der Raten der Neokardiomyozytenkernbildung in den mdx-Mausherzen im Vergleich zu altersangepassten Kontrollen beobachtet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden über einen Zeitraum von zwei Tagen absolviert werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sowohl die EdU- als auch die PCM1-Negativsteuerung zu beachten, damit die Gates während der Analyse genau eingestellt werden können.

Diese Technik ist auch mit einer Reihe zusätzlicher nachgeschalteter immunhistologischer Techniken kompatibel, die es ermöglichen, den Nukleozyteneinbau in eine Reihe verschiedener kardialer Zelltypen zu quantifizieren. Diese Technik wurde im Bereich der kardiovaskulären Forschung eingesetzt, um Veränderungen in der Kardiomyozytenregeneration im mdx-Modell der nicht-ischämischen Kardiomyopathie zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Neo-Kardiomyozyten-Kerne schnell quantifiziert, sehen Sie sich die Zählung für Polyploidation an, um nach Veränderungen in der Kardiomyozytenregeneration und dem Umsatz zu suchen.