Futter suchen Pfad-Länge-Protokoll für Drosophila melanogaster Larvae

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist es, die lokomotorische Komponente des Verhaltens von Drosophila-Larven zu quantifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Verhaltensgenetik über genetische und umweltbedingte Beiträge zu individuellen Unterschieden im Verhalten der Larven zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie schnell und reproduzierbar ist und die Entnahme großer Stichprobengrößen ermöglicht.

Im Allgemeinen könnten Menschen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da der Erfolg des Assays vom Entwicklungszeitpunkt und dem konsequenten, sorgfältigen Umgang mit den Versuchstieren abhängt. Das Verfahren wird von Ina Anreiter und Oscar Vasquez, Doktoranden in meinem Labor, demonstriert. Bereiten Sie die Halteflasche vor, indem Sie Löcher in eine Seite einer Fliegenkulturflasche aus Plastik schneiden.

Verwenden Sie anschließend eine Spritze, um die Deckel der Petrischale mit zuvor vorbereitetem Traubensaftmedium zu füllen, bis die Oberfläche des Traubensaftmediums eine Kuppel über dem Rand des Deckels bildet. Lagern Sie die Traubenplatten in einem feuchten und luftdichten Behälter bei vier Grad Celsius bis zu zwei Wochen. Gießen Sie 40 Milliliter zuvor zubereitetes Fliegenfutter in 100 x 15 Millimeter große Petrischale.

Besorgen Sie sich drei schwarze Plexiglasplatten mit zehn kreisförmigen Vertiefungen mit einem Durchmesser von zehn Zentimetern, die in einem Zwei-mal-Fünf-Design angeordnet sind, um die Larven zu testen, und einen schwarzen Plexiglasstreuer, mit dem die Hefepaste auf die Plexiglasplatten verteilt wird. Trennen Sie dann die Deckel von den Böden der Petrischale. Sammle 100 bis 150 Weibchen und 50 bis 75 Männchen.

Lassen Sie Weibchen und Männchen sich über Nacht in einer sechs Unzen schweren Fliegenkulturflasche mit Standard-Fliegenfutter paaren. Füllen Sie die Fliegen in eine Halteflasche und befestigen Sie mit Kreppband eine Traubenplatte mit einer kleinen Menge frischer Hefepaste über der Flasche. Lassen Sie die Flasche kopfüber stehen, mit der Traubenplatte nach unten, damit die Erwachsenen Eier auf die Traubenplatte legen können.

Entsorgen Sie die erste Traubenplatte nach 24 Stunden und legen Sie eine neue Traubenplatte in die Halteflasche. Nach 22 Stunden nehmen Sie die Traubenplatten aus den Flaschen und legen sie in eine 60 x 15 Millimeter große Petrischale. Als nächstes legst du eine neue Traubenplatte mit frischer Hefepaste auf die Halteflasche.

Entfernen Sie alle Larven von der entkernten Traubenplatte und entsorgen Sie sie mit einer Präpariersonde. Inkubieren Sie die geräumten Traubenplatten vier Stunden lang unter Standardbedingungen. Nach vier Stunden pflücken Sie 100 L1-Larven oder erste Larven pro Stamm von den Traubenplatten und legen Sie sie auf die Futterteller.

Legen Sie die Larven vorsichtig auf das Futter, ohne das Futter zu perforieren und ohne die Larven zu vergraben. Es können Gruppen von jeweils zehn Larven gepflückt und platziert werden. Vermeiden Sie Menschenansammlungen, indem Sie die Larven auf dem Futterteller verteilen.

Inkubieren Sie die Futterteller, bis die Versuchstiere zehn Stunden vor Beginn der Wanderung sind, wenn die Larven das Futter auf der Suche nach einer Verpuppungsstelle verlassen. Wenn die Larven begonnen haben zu wandern und sich auf dem Deckel der Petrischale bewegen, wie Sie hier sehen können, sind die Tiere zu alt für Tests und ihre Entwicklungszeit muss neu bewertet werden. Hefe in Wasser im Verhältnis eins zu zwei auflösen.

Achten Sie darauf, dass die fertige Paste tropft und Bänder auf der Oberfläche der Paste hinterlässt, die schnell wegschmelzen. Die Bewertung der richtigen Konsistenz der Hefepaste ist aufgrund der Variabilität zwischen Marken, Hefechargen und der Umgebung wichtiger als die Verwendung des genauen Verhältnisses. Zupfen Sie mit einem Pinsel vorsichtig die Larven des ersten Stammes aus dem Futterteller.

Sammeln Sie die Larven in einer Petrischale und waschen Sie die Larven vorsichtig mit Wasser, um das gesamte Futter zu entfernen. Waschen Sie die Larven schnell mit zwei Millilitern Wasser und tupfen Sie die Larven vorsichtig mit einem Labortuch trocken. Bewahren Sie die Larven in einer feuchten Umgebung auf, aber nicht in Wasser, um Stress zu vermeiden.

Ordnen Sie drei Testplatten nebeneinander an und stellen Sie für jede Testplatte einen Fünf-Minuten-Timer ein. Tragen Sie Hefepaste auf die Oberseite der Testplatten auf und verteilen Sie mit dem Streuer eine dünne Schicht Hefepaste auf jeder Testplatte, so dass alle Vertiefungen eine gleichmäßige Hefeschicht haben. Setze vorsichtig eine Larve in die Mitte jeder Vertiefung.

Starten Sie den Fünf-Minuten-Timer sofort, nachdem Sie die ersten Larven auf jeden Teller gelegt haben. Legen Sie dann den Rest der Larven in die restlichen Vertiefungen. Legen Sie einen Petrischalendeckel auf jede Vertiefung.

Wenn der Timer abgelaufen ist, beginnen Sie, die in der Hefe zurückgebliebenen Weglängen mit einem Permanentmarker zu verfolgen, ohne die Larven von der Platte zu entfernen. Spurenlängen in der gleichen Reihenfolge und Geschwindigkeit wie die Larven wurden auf die Platten gelegt. Wiederholen Sie abschließend die Testschritte zur Weglänge der Larve für jeden Stamm.

Daten, die an drei aufeinanderfolgenden Testtagen gesammelt wurden, zeigten einen signifikanten Belastungseffekt, wobei Rover weiter reisten als Sitter. Zusätzlich zum Stammeffekt hatten Larven, denen vor dem Test vier Stunden lang keine Nahrung entzogen wurde, signifikant niedrigere Weglängen als gefütterte Larven. Insgesamt waren die Weglängen länger, wenn beide Stämme mit nährstoffreichem Futter aufgezogen wurden, verglichen mit nährstoffarmem Futter.

Bei richtiger Durchführung ermöglicht dieser Assay einer einzelnen Person, bis zu 500 Larven in vier Stunden problemlos zu testen, was ihn für die Phänotypisierung in großem Maßstab wertvoll macht. Nach dem Verfahren, das wir gerade gezeigt haben, können andere Variablen wie Geschlecht, Nahrungsentzug oder Lebensmittelqualität getestet werden, um die Wirkung dieser Variablen auf nahrungsbezogene Bewegungsmuster zu zeigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die nahrungsbedingte Fortbewegung von Drosophila-Larven messen können, um die genetischen und umweltbedingten Beiträge zu individuellen Verhaltensunterschieden zu beurteilen.