Der Bau der Modelle für die zerstörungsfreie Vorhersage von Ingredient Inhalt in Heidelbeeren durch Nahinfrarotspektroskopie Basierend auf HPLC-Messungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Modelle für die zerstörungsfreie Vorhersage des Gesamtzuckergehalts, der gesamten organischen Säure und des Gesamt-Anti-Cyanin-Gehalts in einzelnen Heidelbeeren durch Nahinfrarotspektroskopie zu konstruieren und zu validieren. Diese Methode wird zentrale Probleme im Bereich der Bewertung von landwirtschaftlichen Erzeugnissen wie Obst und Gemüse lösen. Ein Vorteil dieser Technik ist für mich, dass viele unserer Produkte zerstörungsfrei durch Spektroskopie überprüft werden können.

Und die Modelle, die mit dem hier gezeigten Verfahren erstellt wurden. Die Nahinfrarotspektroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die zerstörungsfreie Bewertung von landwirtschaftlichen Produkten. Vorhersagemodelle werden erstellt, indem die Korrelation zwischen dem Spektrum und den durch chemische Analyse jedes Ziels bestimmten Inhalten untersucht wird.

Yusuke Kimura, ein Absolvent meines Labors, und Jingai Che von der Universität und einer der Autoren dieses Protokolls werden das Verfahren vorführen. Sammeln Sie eine ausreichende Anzahl und verschiedene Arten von Musterheidelbeeren von den Zielsorten. Sammeln Sie vorzugsweise 100 Heidelbeeren für den Bau des Kalibriermodells.

Und mindestens 10 für die Validierung des konstruierten Modells. Um robuste Modelle zu konstruieren, sammeln Sie Proben verschiedener Typen, z. B. mit verschiedenen Farben, Größen und unter verschiedenen Reifebedingungen. Wiegen Sie jede Blaubeere.

Die gemessenen Gewichte werden später für die Berechnung des prozentualen Gehalts der Inhaltsstoffe jeder Heidelbeere verwendet. Legen Sie dann eine Heidelbeerprobe in die Mitte des Fensters des Nahinfrarot-Spektrophotomoters für Messungen des diffusen Reflexions. Messen Sie mit dem Befehl sample single channel die Spektren jeder Blaubeere.

Am besten an mehreren Stellen in der Frucht. Bewahren Sie die Heidelbeeren in einem Gefrierschrank unter minus 30 Grad Celsius auf, wenn sie nicht gleich nach den Spektrumsmessungen analysiert werden sollen. Um mit der Vorbehandlung zu beginnen, schneiden Sie eine Heidelbeere in mehrere Stücke, damit sie sich leicht homogenisieren lässt.

Schneiden Sie die Heidelbeere ohne Auftauen, wenn sie gefroren ist. Die Stücke in ein 50 Milliliter Becherglas geben. Geben Sie etwa 10 Milliliter Reinstwasser in das Becherglas.

Erhitzen Sie die geschnittene Heidelbeere in ultrareinem Wasser in der Mikrowelle für 20 Sekunden, um die Enzyme zu deaktivieren, die während der Analysen Zucker zersetzen könnten. Geben Sie etwa 10 Milliliter Reinstwasser in das Becherglas. Homogenisieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei 12.000 U/min mit einem Homogenisator, der mit einer Standardwelle und einem Generator ausgestattet ist.

Zentrifugieren Sie die homogenisierte Mischung 10 Minuten lang bei 3.000 U/min. Anschließend wird das Filtrat durch Vakuumfiltration der zentrifugierten Probe mit einem Fünf-B-Papierfilter gesammelt. Nach zweimaliger Wiederholung der Homogenisierungsschritte wird der pH-Wert des Filtrats gemessen und mit verdünnter Salzsäure und verdünnten wässrigen Lösungen von Natriumhydroxid auf sieben eingestellt.

Verdünnen Sie das Filtrat auf 50 Milliliter mit Reinstwasser. Teilen Sie die Probe in zwei Teile. Einer für die Analyse von Zuckern und der andere für die Analyse organischer Säuren.

Führen Sie die erste Probenlösung durch die in Reihe geschalteten Säulen, um Pigmente, Kationen und Anionen auszuschließen. Werfen Sie den ersten Milliliter der Probenlösung aus den Säulen. Anschließend wird die Probenlösung aus den Säulen für die Analyse von Zuckern mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder HPLC verwendet.

Zentrifugieren Sie die Lösung bei 6.600 U/min für 10 Minuten in einem Mikroröhrchen, das mit einem 0,445-Mikron-Filter ausgestattet ist, mit einer Mini-Zentrifuge, bevor Sie die Analyse durch HPLC durchführen. Ordnen Sie das HPLC-System mit einer Gelpermeationssäule im Säulenofen bei 40 Grad Celsius an. Als Eluent verwenden Sie entgastes Reinstwasser mit einer Durchflussmenge von 0,1 Millilitern pro Minute.

Verwenden Sie auch einen Brechungsindex-Detektor. Messen Sie die HPLC-Spektrogramme von Standardlösungen, indem Sie für jede Messung ein Aliquot von 20 Mikrolitern injizieren. Hier wird eine Software für die Messung eingesetzt.

Ermitteln Sie die Flächenintensität der Zuckerbande auf dem Chromatogramm jeder Standardlösung, indem Sie mit der rechten Maustaste auf Erneute Analyse klicken. Verbinden Sie dann die Flächenintensitäten mit den entsprechenden Konzentrationen, um die Arbeitskurve für jeden Zucker durch lineare Regression zu erhalten. Aus der Kurve ergibt sich für jeden Zucker die Gleichung, die das Verhältnis zwischen der Flächenintensität und der Konzentration darstellt.

Nachdem Sie die Standardkurve erhalten haben, messen Sie die HPLC-Spektrogramme von Probenlösungen, indem Sie für jede Messung ein Aliquot von 20 Mikrolitern injizieren. Ermitteln Sie wie zuvor die Flächenintensitäten der Zuckerbanden auf dem Chromatogramm jeder Probenlösung. Im Textprotokoll finden Sie die Schritte zur Durchführung von HPLC-Messungen organischer Säuren.

Bewahren Sie die Heidelbeeren in einem Gefrierschrank unter minus 80 Grad Celsius auf, wenn sie nicht direkt nach den Spektralmessungen auf Anthocyane untersucht werden sollen. Um eine Vorbehandlung für HPLC-Messungen von Anthocyanen durchzuführen, trocknen Sie jede gefrorene Frucht 12 Stunden lang mit einem Vakuum-Lyophalysator. Extrahieren Sie Anthocyane aus der getrockneten Heidelbeere in einer einprozentigen Methanollösung von Trifluruozetinsäure, indem Sie die Mischung 12 Stunden lang bei vier Grad Celsius im Kühlschrank stehen lassen.

Zentrifugieren Sie den Extrakt 15 Minuten lang in einem Zwei-Milliliter-Mikroröhrchen mit einer Ultrazentrifuge bei minus acht Grad Celsius und 15.000 U/min. Filtrieren Sie dann den Extrakt durch einen 0,45-Mikron-Filter, um die Probe für HPLC-Messungen zu erhalten. Ordnen Sie das HPLC-System mit einer C18-Umkehrphasensäule in einem Säulenofen bei 40 Grad Celsius an.

Wenden Sie die Gradientenmethode mit einer 0,1-prozentigen wässrigen Trifluroessigsäure als LUNA an. Und 0,5 Prozent Trifluroessigsäure in Acetonitril als LUNB. Verwenden Sie eine Flussrate von 0,1 Millilitern pro Minute, wobei das Verhältnis von LUNB von null Prozent auf 15 % während null auf 50 Minuten nach der Injektion ansteigt.

Und von 15 % auf 75 % während 50 bis 60 Minuten nach der Injektion. Verwenden Sie einen Photodiodenarray-Detektor, der bei 520 Nanometern überwacht. Messen Sie die HPLC-Spektrogramme von Standardlösungen, indem Sie für jede Messung ein 10-Mikroliter-Aliquot durch den Autosampler injizieren.

Nutzen Sie für die Messung die LC Solution Software. Messen Sie abschließend die HPLC-Spektrogramme von Probenlösungen, indem Sie bei jeder Messung ein 10-Mikroliter-Aliquot durch den Autosampler injizieren. An dieser Stelle wird die Konstruktion von Kalibrierungsmodellen zur Vorhersage der Inhaltsstoffgehalte und die anschließende Validierung dieser konstruierten Modelle durchgeführt, wie im Textprotokoll beschrieben.

Aus den beobachteten Spektren und den mit dem hier gezeigten Verfahren ermittelten Inhaltsstoffgehalten werden Vorhersagemodelle erstellt. Ein Beispiel für das Ergebnis der Kreuzvalidierung des Modells, das für die Vorhersage des Gesamtzuckergehalts konstruiert wurde, ist hier dargestellt. Die Korrelation zwischen den durch die Nahinfrarotspektroskopie vorhergesagten Werten und den durch HPLC ermittelten Werten ist zufriedenstellend.

Ein ähnliches Ergebnis wird bei der Kreuzvalidierung des Modells für den Gesamtanthocyaningehalt beobachtet. Auch hier ist die Korrelation zwischen den vorhergesagten und den beobachteten Werten zufriedenstellend. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit HPLC frühere Werte des Gehalts von Heidelbeeren erhalten können.

Eine andere Bewertung ist nur möglich, wenn die Modelle verwendet werden, die auf der Grundlage des voreingestellten Inhalts, der durch die zerstörende chemische Analyse gemessen wird, richtig konstruiert sind. Das bedeutet, dass die vorherige chemische Analyse eines Ziels ein Rätsel ist, um Hochleistungsvorhersagemodelle zu erstellen. Bitte beachten Sie das Textprotokoll für die Vorgehensweise bei der Erstellung von Vorhersagemodellen, die in diesem Video nicht gezeigt werden.

Einmal richtig konstruiert, sind die Modelle für die Vorhersage für die Vorhersage von Zucker, organischen Säuren und jeglichen Gehalten von Heidelbeeren anwendbar. Es wird erwartet, dass die Nahinfrarotspektroskopie, wie sie hier gezeigt wird, für die Korrelation vieler Arten von landwirtschaftlichen Produkten anwendbar ist. Vergessen Sie nicht, dass es notwendig ist, durch chemische Analyse voreingestellte Inhaltsbarrieren zu erhalten, um ein gutes Modell zu erstellen, wenn die Nahinfrarotspektroskopie zur Bewertung eines landwirtschaftlichen Produkts angewendet wird.