Murine Prostata Micro-Dissektion und chirurgische Kastration

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, die Untersuchung der Prostata sowie der unterschiedlichen hormonellen Bedingungen bei der Maus zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet des Prostatakrebses zu beantworten, z. B. welche Auswirkungen der Hormonentzug auf die Prostatakarzinogenese hat. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Auswirkungen verschiedener pathologischer Prozesse und hormoneller Veränderungen in einzelnen Prostatadrüsen untersucht werden können.

Beginnen Sie damit, eine Maus in Rückenlage durch den Fußballen jeder Pfote an ein Sezierbrett zu heften und den Bauch mit 70% Ethanol zu besprühen. Halten Sie anschließend die Haut des Unterbauchs mit einer Pinzette fest und schneiden Sie mit einer Schere die Haut und das Bauchfell etwa einen Zentimeter vor der Öffnung des Penis durch. Schneiden Sie die Haut und das Bauchfell vom Unterbauch über beide Seiten des Bauches bis zum Brustkorb und legen Sie die Bauchhöhle frei.

Nachdem Sie die Position der Blase und des Urogenitaltrakts (UGT) identifiziert haben, bewegen Sie das Fett und andere Organe vorsichtig zur Seite, um das Harngewebe freizulegen. Fassen Sie dann mit einer Zange einen Samenleiter an seiner Basis in der Nähe der Harnröhre und reißen Sie das Gefäß weg. Nachdem Sie den anderen Gang entfernt haben, halten Sie die Blase vorsichtig mit einer Pinzette fest und ziehen Sie sie nach oben, während Sie gleichzeitig mit einer Schere die Harnröhre unterhalb der ventralen Prostata und etwa einen Zentimeter unterhalb der Blasenbasis durchschneiden.

Übertragen Sie das geerntete UGT in eine 60 bis 100 Millimeter große Petrischale, die etwa fünf bis 10 Milliliter PBS enthält, und stellen Sie die Schale unter ein Seziermikroskop. Nehmen Sie als Nächstes eine feine Pinzette in jede Hand, halten Sie die Instrumente wie Bleistifte und legen Sie die Unterarme auf die Tischplatte, auf beiden Seiten des Mikroskops, um sie ruhig zu halten. Positionieren Sie die UGT mit der Pinzette so, dass die Blase nach oben zeigt, die Harnröhre nach unten zeigt und die Samenbläschen auf beiden Seiten der Blase positioniert sind.

Fassen Sie die Harnröhre mit einer Pinzette und ziehen Sie mit der anderen Pinzette vorsichtig das Fett ab, ohne Prostatagewebe zu entfernen. Wenn das gesamte Fett entfernt wurde, reißen Sie das Bindegewebe zwischen den beiden Bauchlappen der Prostata ab, um sie zu trennen. Halten Sie dann mit einer Pinzette einen der Bauchlappen in der Nähe der Spitze und fassen Sie die Basis des Lappens so nah wie möglich an der Harnröhre.

Bewegen Sie nun das andere Pinzettenpaar, um die Harnröhre festzuhalten, während Sie den Lappen mit einer festen, gleichmäßigen Bewegung vom Gefäß wegziehen. Vergewissern Sie sich, dass kein Prostatagewebe an der Harnröhre haftet. Platzieren Sie dann den Lappen in das entsprechende Medium, entsprechend dem nächsten Versuchsschritt.

Nachdem Sie den anderen Bauchlappen auf die gleiche Weise isoliert haben, ziehen Sie mit einer Pinzette vorsichtig einen der vorderen Lappen von der Samenblase weg, wobei Sie darauf achten, dass die Samenblase nicht durchstochen wird. Sobald der Lappen unabhängig vom Samenbläschen ist, entfernen Sie ihn auf die gleiche Weise, wie gerade für den Bauchlappen gezeigt. Nach der Isolierung des zweiten Frontlappens den verbleibenden UGT umdrehen, so dass die dorsale Prostata sichtbar ist, und mit einer Pinzette das Bindegewebe zwischen den beiden dorsalen Seitenlappen sowie zwischen den Lappen und dem hinteren Bereich der Samenbläschen zerreißen.

Entfernen Sie dann die einzelnen dorsalen Seitenlappen, wie gerade gezeigt. Um die Kastration durchzuführen, legen Sie zunächst eine betäubte Maus in Rückenlage auf eine saubere, sterile Oberfläche und bestätigen Sie den entsprechenden Sedierungsgrad durch Zusammenkneifen der Zehen. Wenn die Maus nicht reagiert, rasieren Sie mit einem Elektrorasierer den Operationsbereich und sterilisieren Sie den Bauch.

Verwenden Sie als Nächstes eine sterile chirurgische Schere, um einen einen Zentimeter vertikalen Schnitt durch die Mittelhaut des Unterbauchs zu machen, etwa einen Punkt fünf Zentimeter vor dem Penis, gefolgt von einem kleineren Schnitt durch das Bauchfell, wobei Sie darauf achten, keine Organe zu schneiden. Heben Sie mit einer sterilen Pinzette vorsichtig die Schnittkante des Bauchfells an, um die Bauchhöhle sichtbar zu machen, und ziehen Sie mit einer weiteren sterilen Pinzette eines der Hodenfettpolster heraus, bis die Hoden sichtbar werden. Schneiden Sie dann mit einem Kauterstift langsam durch das Fettpolster und halten Sie die Hoden, bis die Hodenarterie durchtrennt ist.

Wenn die Arterie zu schnell durchtrennt wird, kann das Gefäß zu stark bluten, was eine Einschläferung der Maus erforderlich macht. Ich empfehle, den Kauterstift in Schüben zu erhitzen und nicht zu heiß werden zu lassen, und dann das Instrument langsam durch die Arterie zu bewegen, damit das Tier nicht ausblutet. Sobald das Fettpolster und die Arterie durchtrennt wurden, entsorgen Sie die Hoden und das Fettpolster und wiederholen Sie die Kastration für die anderen Hoden.

Nachdem der zweite Hoden entfernt wurde, verschließen Sie das Bauchfell mit sterilen Seidennähten und heften Sie die Haut mit chirurgischen Wundklammern ab. Verabreichen Sie dann eine Analgesie, um die Schmerzen zu lindern, und setzen Sie die Maus 5 bis 10 Minuten lang unter Überwachung in einen sauberen Käfig auf einen Käfigwärmer, bis sie sich vollständig erholt hat. Der komplette Urogenitaltrakt setzt sich aus allen sechs Prostatalappen, der Blase, den Samenbläschen und der Harnröhre zusammen.

Der Samenleiter setzt an der Harnröhre an, ist aber für die Prostata-Miro-Dissektion unnötig und kann somit vor der Entfernung des UGT abgelöst werden. Der Urogenitaltrakt bleibt intakt, wenn er aus dem Bauch entfernt wurde; bedeckt mit Fettgewebe, das entfernt werden muss, um Zugang zu den Prostatalappen zu erhalten. In diesem repräsentativen Experiment folgten auf die Kastration zwei Zyklen der hormonellen Regeneration und die Testosteronspiegel im Serum wurden mittels ELISA überwacht.

Erwartungsgemäß sind unter Kastrationsbedingungen die Testosteronspiegel praktisch verschwunden. In Gegenwart von Tamoxifen, einem selektiven Östrogenrezeptormodulator, wurde kein signifikanter Unterschied zum hormonell normalen Zustand beobachtet. Nach der Kastration führte die Wiedereinführung von Testosteron jedoch zu einem dramatischen Anstieg des Serumtestosteronspiegels.

Nach der Mikrodissektion sind die Prostatalappen kastrierter Mäuse deutlich verkleinert, während die Lappen von testosteronbehandelten Tieren wieder ihre ursprüngliche Größe erreichen. Darüber hinaus zeigen Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen des vorderen Prostatagewebes unter normalen, kastrierten und regenerierten Bedingungen eine dramatische Verringerung des robusten Gewebewachstums in den Schnitten der kastrierten Tiere. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Minuten pro Maus abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Während des Versuchs der Kastration ist es wichtig, daran zu denken, alles steril zu halten und sicherzustellen, dass die Schmerzen der Maus kontrolliert werden. Nach der Kastration können andere Methoden wie die Wiedereinführung von Androgenen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Auswirkungen von Testosteron auf Prostatatumoren zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Prostatakrebses, um die Karzinogenese, Entwicklung und Kastrationsresistenz bei Mäusen zu erforschen.