Name: Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen für kardiovaskuläre Forschung mit CD31-Puffer und magnetischen Perlen. Diese Methode liefert hochreine Zellen für Bildgebung und molekularbiologische Experimente.

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Diese Arbeit wurde durch die Gewährung von den National Institutes of Health (HL115578 A. Makino) unterstützt.

Die Forschung an Mäusen wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der University of Arizona genehmigt und wurde nach dem National Institute of Health (NIH) Richtlinien durchgeführt. HINWEIS: Die Ziffern 1, 2 und 3 sollte am Tag vor dem Experiment als Setup durchgeführt werden. 1. Vorbereiten Lösungen <ol><li> CD31-Puffer (50 ml) <ol><li> 50 ml 1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in ein 50 ml Röhrchen. Man wiegt 0,05 g Rinderserumalbumin (BSA) und 0,037 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und zu der 50-ml-Röhrchen und setzen Sie den Schlauch für etwa 1 h bis das Pulver löst sich zu drehen. PH-Wert auf 7,4, filtriert durch ein 0,2 um-Filter in ein neues 50 ml Rohr und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit HEPES (500 ml) <ol><li> In 1,1915 g HEPES bis 10 mM HEPES in HBSS-Lösung zu machen und gut mischen. Messung des pH-Wertes und Einstellen auf 7,4. Filter und lagern bei 4˚C. </li></ol></li><li> 1x Kreb-Lösung (1 l) <ol><li> In 100 ml 10 × Kreb-Lösung [Tabelle 1] destilliertem Wasser in einem 1 - Liter - Kolben zu verdoppeln. Man wiegt 2,1 g Natriumbikarbonat und 2 g D-Glucose und fügen Sie in den Kolben. Mischen Sie und passen Sie das Gesamtvolumen auf 1 L. </li><li> Bubble - Lösung mit 95% O 2/5% CO &amp; sub2 ; -Gas für 30 min und Filterlösung im Innern der Haube. Lagerung bei 4 ° C und halten auf dem Eis während Experiment. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung der Magnetic Beads <ol><li> 1 ml CD31-Puffer in jede 1,5-ml-Röhrchen (ein Röhrchen pro Probe). Mischen Sie die Schaf - Anti-Ratten - IgG - Perlen und fügen Sie die entsprechende Menge zu jeder Probe [Tabelle 1]. Schütteln Sie die Röhrchen kräftig 30 Mal und legen Sie sie in der magnetischen Platte für 1 min schütteln. Öffnen Sie die Rohre während auf der Platte und Dump-Lösungen in einen Eimer. </li><li> 1 ml CD31 Puffer in jedes Röhrchen. Hinzufügen 2 &amp; mgr; l Ratten-anti-Maus-CD31 AntiKörper in jedes Röhrchen und drehen Rohre O / N bei 4 ºC. </li></ol> 3. Autoklavierung <ol><li> Autoclave alle chirurgische Werkzeuge und Pipettenspitzen. Schneiden Sie die Enden der Pipettenspitzen, so dass es Spitzen mit 4 verschiedenen Durchmessern, von breitesten engste. Ungefähren Durchmesser für die Spitzen sind 3 mm, 2,5 mm, 2 mm und 1,5 mm. Schneiden Sie die Spitzen und Autoklaven am Tag vor der mit 30 Minuten der Sterilisation bei einer Temperatur von 121 ° C. HINWEIS: Sections 4-11 sollte am Tag des Experiments durchgeführt werden. </li></ol> 4. Vorbereitung Lösungen <ol><li> Bereiten Waschpuffer mit 2% Eisen angereicherte Kälberserum (IFCS) in M199. Für die Bildgebung, Herstellung von 30 ml / Maus. </li><li> Bereiten Enzymlösung (10 ml / Probe). Wiegen 0,6 Einheiten / ml Dispase und 1 mg / ml Kollagenase Typ II in ein 50 ml Röhrchen. In M199 und drehen Sie das Rohr bei 4 ° C für 15 min. Man filtriert durch 0,2 um Filter in eine neue 50-ml-Tube inside die Haube und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie HBSS / HEPES mit Heparin. 10 ml HBSS mit 10 mM HEPES in 15-ml-Tube. 100 l Heparin auf das Rohr und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 5. Waschen Sie die Perlen <ol><li> Nehmen Sie die Röhrchen mit Perlen aus dem Rotor bei 4 ° C und an der Haube zu bringen. Die Röhrchen in der magnetischen Platte und schütteln für 1 min. Sichern Sie die Lösung und 1 ml CD31 Puffer in jedes Röhrchen. </li><li> Nehmen Sie die Rohre aus der Magnetplatte und kräftig schütteln, 30-mal. Setzen Sie die Rohre in der magnetischen Platte zurück und wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen. Nach der Fertigstellung setzen die Rohre 4 ° C zurück und halten bis zur Verwendung drehen. </li></ol> 6. Dissection <ol><li> Injizieren die Mäuse intraperitoneal mit 0,1 ml Heparin Blutgerinnungs zu verhindern. Warten Sie 10 Minuten, dann betäuben die Mäuse intraperitoneale Injektion von 0,01 ml Pentobarbital verwendet. Überprüfen Sie, ob die Maus fühltSchmerzen, die durch den Fuß einklemmen. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einer Polystyrolplatte mit Kopf nach oben und halten Sie die Arme mit Stiften. Verwenden einer Pinzette und zäh-cut-Schere die Haut an der oberen Brustbereich zu schneiden bis zum Hals. </li><li> Machen Sie einen Schnitt in der Mitte des Brustkorbs knapp über der Membran. Schneiden Sie den Knochen seitlich und nach oben in Richtung der Kehle ein Dreieck zu machen Aussetzen des Herzens und der Lunge. Schneiden Sie die Aorta knapp über der Membran. </li><li> Halten Sie die Thymusdrüse mit einer Pinzette, ohne zu ziehen und mit einer Schere jede Bindegewebe zu schneiden sorgfältig Lunge und Herz zusammen zu entfernen. Platz Gewebe in einem Becherglas mit 1 × Kreb, schütteln mit einer Pinzette und Transfer zu 6 cm Schale mit 1 × Kreb. </li><li> Entfernen Sie die Lungenlappen mit einer Schere und Pinzette. Legen Sie eine 20 G sterile Katheter in die Aorta. Spülen Sie das Blut in das Herz-Kreislauf-System mit HBSS / Heparin. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Ventrikel, schütteln das Herz und Transfer in ein Probenröhrchen von M199. Halten Sie Röhrchen auf Eis. </li></ol><p<html> class = &quot;jove_title&quot;&gt; 7. Tissue Verdauung <ol><li> Übertragen Sie das Herz auf eine 6 cm Schale mit 10 ml Enzymlösung gefüllt und Hackfleisch in kleine Stücke mit einer Schere. Die Schalen werden in den 37 ° C Inkubator für 15 min. Rühre verdauten Materialien durch Auf- und Abpipettieren 30 mal durch eine Spitze mit einem abgeschnittenen Ende das Gewebe zu ermöglichen, durch leichter zu passieren. </li><li> Legen Sie es für weitere 15 Minuten im 37 ° C-Inkubator zurück. Wiederholen Aufregung drei Mal, jedes Mal mit Pipettenspitzen von größten Öffnungen engste und 15 min Inkubation zwischen den einzelnen. </li><li> Nach letzten 15 min Inkubation Proben zu nehmen und in die Haube. Pipettieren Lösung nach oben und unten 30-mal mit Pipettenspitze mit der engsten Öffnung und durch ein 40 &amp; mgr; m Zelle Sieb in eine neue 50-ml-Tube. </li><li> Waschen Sie die Schale mit 10 ml Waschpuffer eine 10 ml Pipette und übertragen auf Zellsieb verwenden. Stellen die 50-ml-Röhrchen in der Zentrifuge und Schleudern bei 400 g für 10 min bei RT. </li></ol>itle &quot;&gt; 8. Waschen und Konjugation mit Perlen <ol><li> Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören. Wash-Zellen mit 5 ml Waschpuffer zweimal. </li><li> Holen Sie sich eines der zuvor 1,5 ml Röhrchen hergestellt mit Perlen und die Arbeit an einem Rohr zu einem Zeitpunkt. Setzen Sie ein 1,5-ml-Röhrchen in der magnetischen Platte, schütteln 3-mal und öffnen. </li><li> Nach dem letzten Zentrifuge, entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören. Distanziere die Zellklumpen durch kräftiges Ausklopfen. </li><li> 1 ml Waschpuffer zu den 50-ml-Röhrchen und Mischen der Zellen mit einer 1 ml Pipette. Sichern Sie die Lösung aus dem 1,5-ml-Röhrchen und 1 ml Zellsuspension aus dem 50-ml-Röhrchen an die Kügelchen. Flick die Rohre 30-mal drehen dann bei 4 ° C für 30 min. </li></ol> 9. Vorbereitung für Zellkultur / Imaging <ol><li> Bereiten Kammern für Zellen Plattierung. In Gelatinelösung (5% w / v, 300 &amp; mgr; l) in die Kammer und die Oberfläche zu beschichten und Inkubation bei 37 ° C für 30 min. Nach der Inkubation remove Gelatine und trocken die Oberfläche. </li><li> Nehmen Sie die Röhrchen mit Perlen / Zellen nach 30 min Dreh und in der Magnetplatte im Inneren der Kapuze setzen. Schütteln für 2 min, dump und 1 ml Waschpuffer. </li><li> Nehmen Sie Rohre aus der Platte, kräftig schütteln, 30-mal dann flick 30 mal. Setzen Sie sie in Magnetplatte zurück und schütteln für 1 min. Wiederholen 4 mal für insgesamt 5 Wäschen, jedoch mit 1 min auf der Platte ausgeschüttelt. </li><li> Nach der letzten Waschung, nehmen Sie einen Schlauch heraus und zu einer Zeit, an jedem Rohr ein arbeiten. Schütteln Sie 30-mal dann 30-mal Flick. Legen Sie es auf der Magnetplatte und schütteln für 1 min. Dump und 1 ml 20% IFCS EG-Medien (vorgewärmt auf 37 ° C). </li><li> Kräftig schütteln 30 mal Flick dann 30-mal. Stellen Sie pipettieren bis 500 &amp; mgr; l und pipettieren nach oben und unten 10-mal. Übertragen Sie 500 ul zu jeder Kammer. </li><li> Setzen Sie bei 37 ºC-Inkubator und lassen O / N. Am nächsten Tag, waschen Sie die Zellen mit 10% FBS EG-Medien. </li></ol> 10. Vorbereitungen für die Western Blot (WB) Proben <ol><li> Take aus der Röhrchen mit Perlen / Zellen nach 1 Stunde der Rotation. Setzen Sie sie in der magnetischen Platte und schütteln für 2 min. Dump Überstand und 1 ml kaltem HBSS. Kräftig schütteln 30 mal Flick dann 30-mal. Wiederholen Sie zweimal für 3 Waschungen, aber mit 1 min auf der Platte schütteln. </li><li> Nach dem letzten Waschen, legen Rohre auf Magnetplatte und schütteln für 1 min. Entfernen Pufferpipette und Lyse der Zellen für WB unter Verwendung eines Verfahrens zuvor 11,12 beschrieben. Gesammelte Lysat enthält in der Regel etwa 30 ug Protein. </li></ol> 11. Imaging <ol><li> Waschen Sie die Zellen 3 mal mit Medien, mit der endgültigen Volumen von 250 &amp; mgr; l für eine Kammer. Fügen 1,5 ul Dil-acLDL zu den Zellen. Von diesem Punkt halten die Zellen im Dunkeln. </li><li> Inkubieren für 3,5 Stunden bei 37 ° C. In 1,5 ul Hoechst, gut mischen und Inkubation für 30 min bei 37 ˚C.Wash Zellen mit PBS und fixieren mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei RT. </li><li> Zweimal waschen mit PBS und Block mit 5% BSA-PBS für 30 min bei RT. Wasche zweimal mit 1% BSA-PBS. Verdünnte BS-Lectin-FITC unter Verwendung von 1% BSA-PBS auf eine Konzentration von 2 ug / ml und 300 &amp; mgr; l zu jeder Kammer. </li><li> Setzen Sie die Kammer auf dem Orbitalschüttler bei RT für 30 min. Waschen mit PBS 3 mal. </li><li> Visualisieren Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop mit Belichtungszeit von 200 ms für FITC (Lektin-Färbung, eine EG-Marker, Anregung / Emission 488 nm / 519 nm), 30 ms für DAPI (Hoechst, eine Kernfärbung, Anregung / Emission bei 358 nm / 461 nm) und 300 ms für TRITC (acLDL Färbung, eine EG-Marker, Anregung / Emission bei 557 nm / 576 nm). Erwerben Sie Bilder mit einem 20X Objektiv verwendet wird. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die am häufigsten verwendeten Endothelzellen in Forschung sind menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) wegen ihrer Bequemlichkeit und Leichtigkeit der Kultivierung. Jedoch erfordert eine Menge Forschung die Verfügbarkeit eines physiologischen Modells durch die Isolierung von Endothelzellen aus anderen spezifischen Organen 10 erreicht. Endothelial-Zellen machen einen sehr geringen Population von Zellen in dem Herzgewebe auf; ihre Isolation und Kultivierung kann sich als sehr schwierig erwiesen. </...

Mausmodelle verschiedener kardiovaskulärer Erkrankungen und Stoffwechselstörungen tragen physiologischen und molekularen Veränderungen, die mit denen in Patienten gefunden ähnlich sind. Weiterhin ist die genetische Veränderung von Mäusen ein leistungsfähiges Werkzeug, das uns die pathogene Rolle spezifischer Gene bei der Entwicklung und dem Fortschreiten der Krankheiten zu untersuchen erlaubt. Heutzutage zelltypspezifische Gen-Knock-in oder -out Mäuse werden in vielen Labors und die Messung von mRNA und Protein-Ebene in spezifischen Zelltypen ist der erste Schritt bei der Bestimmung, ob die Mäuse wurden wirklich genetisch veränderten leicht erzeugt. Das Endothel ist eine dünne einzelne Schicht aus Endothelzellen (ECs), die Linien der inneren Gefäßwand. Endothelial - Zellen spielen eine entscheidende Rolle 1,2 Gefäßspannung, die vaskuläre Permeabilität und neue Gefäßbildung bei der Regulierung. Endotheliale Dysfunktion ist ein Markenzeichen vieler pathologischer Zustände und Veränderungen in der Endothelfunktion zu verschiedenen Auto führen kannKreislauf- Erkrankungen 3,4. Es ist somit signifikant die Funktion von Endothelzellen unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu studieren. Es gibt mehrere Möglichkeiten , um ECs isolieren 5-8 und die Isolierungsmethode muss optimiert werden , abhängig von dem Gewebe und Arten verwendet. Dies liegt daran , ECs aus verschiedenen Geweben hinsichtlich ihrer Oberflächenmarker und Proteinexpression 9 eine hohe Heterogenität anzuzeigen. Erfolgreiche Isolierung von Endothelzellen kann oft schwierig sein und erfordert ein gewisses Maß an Ausbildung und Praxis. Einmal erreicht, erweist sich die Methode der Isolierung in diesem Protokoll vorgeschlagen, stabil und effizient zu sein. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, Maus koronarer ECs (MCECs) von hoher Qualität und Quantität zu erhalten. Auch wenn die Menge der Zellen, die aus einem Herzen gesammelt weniger als aus anderen Geweben gesammelten Zellen unter Verwendung anderer Techniken, diese Technik bietet noch better Qualität. Die Reinheit von Endothelzellen in der resultierenden Population größer ist als 90%. Somit wäre diese Technik ideal für Anwendungen, die auf rein isolierten Endothelzellen verlassen wie Cell Imaging.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311-10G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>SH3026801</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads Pan Maus IgG Perlen&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-CD31-Antikörper für Ratten</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>IFCS&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>SH30072.04</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Fisher</td><td>MT10060-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (neutrale Protease)</td><td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td><td>LS02109</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ II&nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021-50 ml</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase-Hemmer-Cocktail</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ml</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Hemmer-Cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340-1 ml</td><td></td></tr><tr><td>Heparin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Fisher/Mediatech</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>D-Valin</td><td>Sigma</td><td>V1255-5G</td><td></td></tr><tr><td>EGS</td><td>Corning 356006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Fisher/Mediatech</td><td>MT-30-002-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von maus-koronar-endothelzellen

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelzellen kleiden die Innenwand der Blutgefäße und eine wichtige Rolle bei der Regulation des Gefäßtonus, vaskuläre Permeabilität spielen und neue Gefäßbildung. Endothelzelldysfunktion ist in der Entwicklung und dem Fortschreiten vieler kardiovaskulärer Erkrankungen, einschließlich ischämischer Herzkrankheit beteiligt ist. Um die Funktion und Charakterisierung von koronaren Endothelzellen untersuchen, Zellisolierung ist der erste Schritt, und es erfordert eine hohe Reinheit und Menge zur nachfolgenden Experimenten durchzuführen. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes Verfahren adulten Maus-Koronar-Endothelzellen zu isolieren. Die Maus Herz wird in kleine Stücke zerschnitten und zerkleinert. Nach der Verdauung des Herzens unter Verwendung Dispase und Kollagenase II werden die Zellen gewaschen und mit magnetischen Kügelchen inkubiert, die mit Anti-CD31-Antikörper konjugiert sind. Die Kügelchen mit Endothelzellen sind mehrmals gewaschen und bereit sind, in verschiedenen Anwendungen zu verwenden, einschließlich Bildgebung und molekularbiologische Experiments. Effiziente Isolierung ergibt etwa 10 4 Zellen pro ein Herz mit über 90% Reinheit.

Die erfolgreiche Isolierung von koronaren Endothelzellen aus einer Maus Herz ergibt typischerweise etwa 10 4 Zellen mit über 90% Reinheit mit einer gepflasterten Form. Für eine reine Population von Endothelzellen, Vorsicht sollte im gesamten Protokoll genommen werden, um eine sterile Umgebung, die frei von jeglicher Verunreinigung zu gewährleisten. Das Auftreten von länglichen Zellen oder vergrößerten Zellen innerhalb der Population zeigt an Kontamination mit anderen Zelltypen...

Dieses Protokoll wurde erstellt, um unsere Methode zur Isolierung von koronaren Endothelzellen von Mäusen zum Zwecke der Bildgebung oder zur Durchführung molekularbiologischer Experimente zu teilen.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, große Mengen hochreiner, qualitativ hochwertiger endothelialer Zellen aus der Mauskoronararterie zu gewinnen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der kardiovaskulären Forschung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Gewinnung einer hohen Ausbeute an endothelialen Zellen guter Qualität erleichtert.Demonstration dieses Verfahrens wird Shizhen Luo, eine wissenschaftliche Spezialistin, und Dr. Ayako Makino, unsere leitende Wissenschaftlerin, übernehmen. Bis zu einer Woche vor dem Verfahren je Probe ein Milliliter CD31-Puffer in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben. Anschließend die Schaf-antiratt-IgG-Kügelchen durch vorsichtiges Pipettieren mischen und das entsprechende Volumen der Kügelchen zu jedem Röhrchen hinzufügen.Nachdem alle Kügelchen hinzugefügt wurden, die Röhrchen kräftig 30 Mal schütteln und sie für eine Minute auf eine Magnetplatte stellen, währenddessen sie geschüttelt werden. Danach, während die Röhrchen noch an der Platte befestigt sind, den Puffer verwerfen und jedem Röhrchen ein Milliliter frischen CD31-Puffer hinzufügen. Zwei Mikroliter Anti-Maus-CD31-Antikörper hinzufügen und die Röhrchen über Nacht auf einem Rotator bei vier Grad Celsius lagern.Am nächsten Tag die Röhrchen unter einer laminaren Luftströmhaube transferieren und sie erneut für eine Minute mit Schütteln auf die magnetische Platte stellen. Anschließend den Überstand durch ein Milliliter frisches CD31-Puffer ersetzen und die Röhrchen per Hand kräftig 30-mal schütteln. Nach der dritten Wäsche die Röhrchen wieder auf den Rotator bei vier Grad Celsius zurückstellen.Am Tag des Eingriffs beginnen Sie mit der intraperitonealen Injektion von 0,1 Milliliter Heparin in das Versuchstier, um eine Blutgerinn游戏副本Nachdem Herz- und Lungengewebe gemeinsam entfernt wurden, geben Sie sie in ein Becherglas mit Krebs-Puffer und spülen Sie das Gewebe durch vorsichtiges Schütteln. Überführen Sie anschließend das Gewebe in eine 6 cm große Petrischale mit frischem Krebs-Puffer und entfernen Sie mithilfe von Schere und Pinzette die Lungenlappen. Führen Sie nun einen Katheter mit 20 Gauge in die Aorta ein und spülen Sie das koronare Kreislaufsystem mit HBSS, der mit Heparin angereichert ist, durch.Wenn das gesamte Blut entfernt wurde, einen kleinen Schnitt im Ventrikel vornehmen, das Herz durch vorsichtiges Schütteln spülen und das Herztissue in ein Probenröhrchen auf Eis geben. Nach der Verdauung des Gewebes zur Freisetzung der koronaren Endothelzellen die Zellen zweimal mit je fünf Milliliter Waschpuffer pelletieren und waschen. Danach ein Röhrchen mit den zuvor vorbereiteten Perlen auf die Magnetplatte stellen und das Röhrchen dreimal schütteln, um die Perlen gleichmäßig zu verteilen.Nach der zweiten Waschung so viel Überstand wie möglich entfernen, ohne das Pellet zu stören, und die Zellen durch kräftiges Schwenken lösen. Anschließend die Zellen in einem Milliliter Waschpuffer unter vorsichtigem Mischen resuspendieren und den CD31-Puffer von den Perlen verwerfen. Die Zellen mit den Perlen kombinieren und das Gefäß 30-mal schwenken.Danach die Zell- und Perlenlösung auf den Rotator bei vier Grad Celsius für 30 Minuten geben. Während die Zellen inkubieren, die Oberfläche eines Plattenkammerbrunnens pro Probe mit Gelatinelösung beschichten und die Kammern für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius platzieren. Sobald die Gelatine erstarrt ist, überschüssige Gelatine entfernen und die Oberfläche des Kammerbrunnens trocknen.Überführen Sie die mit Perlen konjugierten Zellen dann unter dem Abzug für zwei Minuten auf die Magnetplatte mit Schütteln und entsorgen Sie den Waschpuffer. Geben Sie ein Milliliter frischen Waschpuffer zu den Zellen hinzu und nehmen Sie das Röhrchen von der Platte, um es 30-mal kräftig zu schütteln und anschließend 30-mal flink zu bewegen. Stellen Sie das Röhrchen anschließend für eine weitere Minute auf die Platte zum Schütteln zurück.Nach der letzten Agitation das Gefäß erneut eine Minute lang auf die Magnetplatte stellen und den Waschpuffer durch ein Milliliter Endothelzellmedium mit 37 Grad Celsius ersetzen, das mit 20 Prozent eisenangereichertem Kalbserum ergänzt wurde. Die Gefäße abschließend 30 Mal schütteln und schwenken. Anschließend die konjugierten Zellen zehnmal mit einem Ein-Milliliter-Pipettiergerät, das auf 500 Mikroliter eingestellt ist, agitieren und 500-Mikroliter-Aliquote von koronaren Endothelzellen in jede Probennahmekammer des Plattenbrunnens überführen, um sie über Nacht bei 37 Grad Celsius zu inkubieren.Am nächsten Tag die Zellen in Endothelzellmedium, ergänzt mit zehn Prozent FBS, waschen. Die Reinheit der mit dieser Methode isolierten koronaren Endothelzellen kann durch immunhistochematische Färbung gegen die Oberflächenmarker der Endothelzellen, BS-Lektin und AC-LDL, bestätigt werden, wobei über 90 Prozent der Zellen in einer typischen Maus-koronaren Endothelzellkultur einen doppelpositiven Ausdruck beider Marker aufweisen. Im Anschluss an dieses Verfahren können als Methode verschiedene Blut-, Immunrezeptions- und Fluoreszenzbildgebungsverfahren durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, welches Protein in verschiedenen Krankheitszuständen modifiziert werden kann.Nach ihrer Entwicklung bietet diese Technik den Forschern die notwendigen Werkzeuge, um ihre Untersuchungen auf den Bereich der koronaren Endothelzellen auszuweiten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man murine koronare Endothelzellen in hoher Menge und Qualität isoliert. Während dieses Verfahrens gibt es mehrere Schlüsselpunkte.Das Wichtigste ist, während der Isolation eine sterile Umgebung aufrechtzuerhalten. Zweitens muss das Blut vollständig und so schnell wie möglich ausgespült werden, um eine Blutgerinnung im Kapillarnetzwerk zu vermeiden. Drittens ist es wichtig, den pH-Wert aller Puffer, insbesondere des CD31-Puffers, zu messen.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von murinen pulmonalen Endothelzellen. Dieses Verfahren umfasst mechanische und enzymatische Lungengewebe Dissoziation sowie eine 2-Schritt-Reinigungsverfahren mit anti-PECAM-1 und anti-ICAM-2-Antikörper, konjugiert an magnetische Kügelchen, die eine reine Endothelzellen Bevölkerung meist mikrovaskuläre Herkunft produziert.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Die Fähigkeit, Herzklappen-Endothelzellen (VECs) zu isolieren, ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen der Klappenentwicklung, -erhaltung und -erkrankung.  Hier beschreiben wir die Isolierung von VECs aus embryonalen und adulten Tie2-GFP-Mäusen mittels FACS, die Studien zur Bestimmung des Beitrags von VECs zu Entwicklungs- und Krankheitsprozessen ermöglichen wird.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Die vaskulären Endothelzellen spielen eine bedeutende Rolle bei vielen wichtigen Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode, um Endothelzellen aus der Aorta der Maus zu isolieren und zu erweitern, ohne spezielle Geräte zu verwenden. Unser Protokoll bietet ein wirksames Mittel zur Identifizierung von Mechanismen in der Physiopathologie von Endothelzellen.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Isolierung und Kulturtechniken von murinen primären vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) aus dem koronaren Kreislauf zu demonstrieren. Sobald VSMCs isoliert wurden, können sie für viele Standardkulturtechniken verwendet werden.

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

Mikrovaskuläre Endothelzellen der Skelettmuskulatur (MMEC) prägen die Innenwand des Muskels Kapillaren und regulieren, Austausch von Flüssigkeiten/Moleküle und Migration (Immunzellen) zwischen Blut und Muskelgewebe. Isolierung der primären murinen MMEC, ermöglicht wie hier beschrieben umfassende in-vitro-Untersuchungen des Referats"Myovascular".

Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen

Wir präsentieren ein Protokoll zur Isolierung von endokardialen und koronaren Endothelzellen aus Rattenherzen durch sequentielle Gewebeverdauung in einem Verdauungspuffer, Zellsammlung aus rezidivierenden Zentrifugenzyklen und Zellreinigung mit rattenfeindlichen CD31-Mikroperlen.

Isolierung von Endokardialen und koronaren Endothelzellen aus der ventrikulären freien Wand des Rattenherzes

Hier skizzieren und demonstrieren wir ein Protokoll für die Isolierung primärer Lebersinuszellen (LSEC) in der Mausleber. Das Protokoll basiert auf der Perfusion der Leberkollagenase, der nichtparenchymalen Zellreinigung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und der Auswahl magnetischer CD146-Perlen. Wir phänotypisieren und charakterisieren diese isolierten LSECs auch mittels Durchflusszytometrie und Rasterelektronenmikroskopie.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Wir stellen eine Methode zur Isolierung von Endothelzellen und -kernen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern vor, die stabilen oder gestörten Strömungsbedingungen ausgesetzt sind, um Einzelzell-Omics-Experimente durchzuführen.

Isolierung von Endothelzellen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern für Einzelzell-Multi-Omics-Experimente

In diesem Artikel wurden primäre Lungenendothelzellen aus neonatalen Mäusen isoliert und kultiviert.

Isolierung von primären Lungenendothelzellen der Maus

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Endothelzellen der Maus aus der gesamten Bauchspeicheldrüse.

Isolierung von Endothelzellen der Bauchspeicheldrüse der Maus

Lernen Sie die Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen für kardiovaskuläre Forschung mit CD31-Puffer und magnetischen Perlen. Diese Methode liefert hochreine Zellen für Bildgebung und molekularbiologische Experimente.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

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