Entwicklung einer fibrotischen Leber Modell in Zebrabärbling Ethanol-induzierte zur Untersuchung Progenitor-vermittelte Zell Hepatozyten-Regeneration

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, ein ethanolinduziertes fibrotisches Lebermodell im Zebrafisch zu etablieren und mithilfe dieses Modells chemische Screens durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Leberregeneration zu beantworten, beispielsweise die molekularen und zellulären Mechanismen, durch die Hepatozyten sich in der fibrotischen Leber regenerieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine kostengünstige und zeitsparende Methode für die In-vivo-chemische Screening-Analyse darstellt. Außerdem kann eine detaillierte zeitliche Analyse durch die Visualisierung einer einzelnen Zelle durchgeführt werden. Die Durchführung der Prozedur demonstrieren Mianbo Huang, ein Postdoktorand, und Jin Xu, ein Doktorand aus dem Labor.

Nach der Zubereitung der Reagenzien gemäß dem schriftlichen Protokoll richten Sie Paarungstanks mit Trennwänden ein, die erwachsene transgene Zebrafische enthalten, die das Fettsäure-bindende Protein 10a:CFP-NTR mit Tp1:mCherry und Tg(hand2:EGFP) tragen. Am folgenden Morgen, zwei Stunden nach dem Entfernen der Trennwände, gewinnen Sie die Embryonen, indem Sie das Systemwasser abgießen und die Embryonen in 100 Millimeter Petrischalen mit Embryomedium überführen. Fügen Sie den Embryonen 56 Stunden nach der Befruchtung (hpf) 1,5 Prozent Ethanol hinzu.

Decken Sie die Platten mit Plastikfolie ab, um eine Verdunstung von Ethanol zu verhindern. Inkubieren Sie dann bei 28 Grad Celsius für 24 Stunden. Bereiten Sie frisches 15 Millimolar MTZ und Embryomedium mit 0,1 Prozent DMSO vor und geben Sie Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 1,5 Prozent hinzu.

Dann die sortierten Embryonen bei 80 HPF mit 20 Milliliter Ethanol-MTZ-Lösung pro Petrischale behandeln. Die Schalen mit Plastikfolie abdecken, um eine Verdunstung des Ethanol zu verhindern, und mit Aluminiumfolie abdecken, um sie vor Licht zu schützen. Anschließend 24 Stunden bei 28 Grad Celsius inkubieren.

Am folgenden Tag beobachten Sie die Embryonen unter einem epifluoreszierenden Mikroskop mit einem CFP-Filter und einer 80fachen Vergrößerung, um die Larven mit nahezu vollständiger Ablation der Hepatozyten auszusortieren. Für chemische Screens entfernen Sie die 96-Loch-Platten, die zehn Millimolar chemische Stämmlösungen in DMSO enthalten, aus dem minus 80 Grad kalten Gefrierschrank. Decken Sie die Platten mit Aluminiumfolie ab, um eine photokatalytische Zersetzung der Chemikalien zu verhindern, und lassen Sie sie bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Schwenken auftauen.

In 1,5-Milliliter-Röhrchen bereiten Sie chemische Lösungen vor, indem Sie fünf Mikroliter zehnmillimolarer Stammlösungen mit einem Milliliter Embryomedium auf eine Endkonzentration von 50 Mikromolar verdünnen. Danach überführen Sie jeweils fünf Larven pro Vertiefung mit nahezu vollständiger Hepatozytenablation in 24-Loch-Platten, die mit Embryomedium gefüllt sind. Entfernen Sie anschließend das Embryomedium und geben Sie 500 Mikroliter der chemischen Lösungen in jede Vertiefung.

Mit Aluminiumfolie abdecken und die Larven 50 Stunden bei 28 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Anzahl und/oder Intensität der CFP-exprimierenden Hepatozyten unter einem epifluoreszierenden Mikroskop bei 80facher Vergrößerung beobachten. Lebende Larven mit erhöhter oder verringerten Anzahl und/oder Intensität der CFP-exprimierenden Hepatozyten abbilden.

Richten Sie Paarungen transgener Zebrafische ein, die das Fettsäure-bindende Protein 10a:CFP-NTR sowie TP1:mCherry enthalten, und ziehen Sie die sortierten Larven sechs bis zwölf Monate lang auf. Überführen Sie die adulten transgenen Zebrafische mit einem Netz in Paarungstanks. Bereiten Sie frisch eine Prozent Ethanol in Systemwasser vor und ersetzen Sie das Systemwasser in den Paarungstanks durch 500 Milliliter dieser Lösung.

Die Behälter 72 Stunden lang bei 28 Grad Celsius inkubieren, dabei täglich die Fische in frische Ethanol-Lösung überführen und tote Fische entfernen. Eine frische 10-Millimolar-MTZ-Lösung in Systemwasser mit 0,1 Prozent DMSO herstellen und anschließend 500 Milliliter vorgewärmte MTZ-Lösung zu den Fischen in Ein-Liter-Paarungsbehältern hinzufügen. Die Behälter mit Aluminiumfolie abdecken.

Bei 28 Grad Celsius für acht Stunden inkubieren und gemäß dem Textprotokoll analysieren. Nach Anästhesie gemäß dem Textprotokoll die gastrointestinalen Organe freilegen, indem mit einer Schere die Haut und darunterliegende Muskulatur entlang des Bauches von der Afterflosse bis zum Operculum durchtrennt wird. Anschließend entlang der Seite des Fisches bis zur Afterflosse nach posterior schneiden.

Stellen Sie den Fisch in ein 15-mL-Kegelrohr und waschen Sie ihn einmal mit PBS. Anschließend entfernen Sie den PBS und geben 4 mL frisch zubereitete 3 %ige Formaldehyd-Lösung in PEM-Puffer hinzu. Inkubieren Sie den Fisch über Nacht bei 4 °C, um ihn zu fixieren.

Am folgenden Tag, nach dem Waschen der Proben gemäß dem Textprotokoll, schneiden Sie die Speiseröhre durch, um den gesamten Darm zusammen mit der Leber aus der Körperhöhle zu entnehmen. Anschließend bringen Sie die gastrointestinalen Organe in eine Schnittform ein und verwenden vierprozentige Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt, um das Gewebe einzubetten. Danach beschneiden Sie den Block zu einer trapezförmigen Gestalt und kleben ihn auf den Untergrund.

Verwenden Sie anschließend ein Vibratom und schneiden Sie ausgehend vom inneren Ende des Gewebes Proben in Querschnitten im Abstand von fünfzig Mikrometern in eiskalte PBS-Lösung. Überführen Sie die Schnitte mit einem Pinsel der Stärke eins in eine sechswellige Platte mit PBS. Nach der Immunfärbung der Schnitte gemäß dem schriftlichen Protokoll überführen Sie die Schnitte vorsichtig mit einem Pinsel der Stärke eins auf Objektträger.

Entfernen Sie mit Kimwipes überschüssiges PBS, bevor Sie einen Tropfen Eindeckmedium und einen Deckgläser hinzufügen. Versiegeln Sie anschließend das Deckglas mit Nagellack. Erfassen Sie abschließend mit einem konfokalen System, das mit einer 40x 1.3 NA Öl-Immersionsoptik ausgestattet ist, Z-Stack-Aufnahmen bei 20 bis 50 Prozent Intensität und in Ein-Mikrometer-Intervallen.

Diese Abbildung zeigt, dass sich bei Larven, die mit Ethanol MTZ behandelt wurden, eine nach oben gerichtete Krümmung des Rumpfes und des Schwanzes, Perikardödeme sowie ein Ausbleiben der Aufblähung der Schwimmblase entwickeln. Wie hier zu sehen ist, wiesen Lebern von DMSO-behandelten Kontrolltieren keine Ablagerung von kollagenem Typ-I-Fibril vor. Hingegen zeigten Lebern, die mit Ethanol MTZ behandelt wurden, 25 und 50 Stunden nach der Ablation eine erhöhte Akkumulation von kollagenem Typ I.

Außerdem nahm die Anzahl der HSCs in den mit Ethanol und MTZ behandelten regenerierenden Lebern im Vergleich zu den mit DMSO behandelten Kontrolllebern zu und sie nahmen eine myofibroblastenähnliche Form an, die cytoplasmatische Fortsätze fehlten. Diese Abbildung zeigt die Entwicklung eines durch Ethanol induzierten fibrotischen Lebermodells bei adulten Zebrafischen, die mit einem Prozent Ethanol gefolgt von MTZ behandelt wurden. Aus diesen zeitlichen Analysen ergab sich im Vergleich zu den mit DMSO behandelten Lebern eine signifikant erhöhte Ablagerung von Kollagen Typ I in den mit Ethanol und MTZ behandelten regenerierenden Lebern zwei, drei und vier Tage nach der Ablation.

In diesem chemischen Screening-Versuch wurden Hepatozyten in Gegenwart von 1,5 Prozent Ethanol und 15 Millimolar MTZ ablatiert. Anschließend wurden die Larven 50 Stunden lang Chemikalien ausgesetzt. Zahlreiche Wint-Agonisten, wie Inhibitoren der Glykogensynthasekinase-3 und ein Wint-Aktivator, förderten im Vergleich zu DMSO die Regeneration der Hepatozyten.

Diese Daten legen nahe, dass dieses nachhaltige fibrotische Modell ein unschätzbares Werkzeug darstellt, um kleine Moleküle zu entdecken, die die Regeneration von Hepatozyten fördern. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb einer Woche durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, eine nahezu vollständige Ablation der Hepatozyten zu erreichen und die Ethanolkonzentration während des gesamten Verfahrens aufrechtzuerhalten.

Mithilfe dieses Verfahrens kann die Wirksamkeit der identifizierten chemischen Verbindungen in Modellen für Leberschäden bei Säugetieren getestet werden. Nach ihrer Entwicklung kann diese Technik neue Wege im Bereich der zellulären Regenerationstherapie eröffnen, um die Entdeckung neuartiger therapeutischer Strategien für Patienten mit chronischem Leberversagen zu erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein ethanolinduziertes fibrotisches Lebermodell im Zebrafisch entwickelt und wie man chemische Screens durchführt.

Beachten Sie, dass die Arbeit mit Formaldehyd äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen sowie die Handhabung des Reagenz in einer chemischen Abzugshaube stets eingehalten werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.