In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert

Das übergeordnete Ziel dieser Protokolle ist es, die Zellkolonien zu charakterisieren, die aus Pankreas-Vorläuferzellen gezüchtet wurden, die von adulten Mäusen isoliert wurden, unter Verwendung von Kulturassays, die Methylcellulose enthaltendes halbfestes Medium verwenden. Unsere Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Pankreas-Vorläuferzellbiologie zu beantworten, wie z.B. welche Selbsterneuerungs- und Differenzierungsfähigkeiten haben Vorläuferzellen in der adulten Bauchspeicheldrüse? Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie die Untersuchung einzelner Vorläuferzellen ermöglichen, was wichtig ist, um ihr wahres biologisches Potenzial zu erkennen.

Die Idee zu diesen Methoden hatten wir, als wir feststellten, dass die Kolonie-Assays hämatopoetische Stammzellen auch auf Pankreaszellpopulationen anwenden könnten. Jacob Tremblay, ein Doktorand, Dr. Janine Quijano, eine Postdoktorandin, und Miss Angela Luo, eine Technikerin, alle aus meinem Labor, werden die Verfahren vorführen. Machen Sie so bald wie möglich nach der Opferung mit einer Schere einen vertikalen Schnitt an der Mittellinie der Bauchdecke und öffnen Sie die Bauchhöhle.

Heben Sie die Milz mit einer Pinzette vorsichtig an und durchtrennen Sie das Bindegewebe zwischen Milz und Milzlappen der Bauchspeicheldrüse mit einer Schere. Durchtrennen Sie das Bindegewebe für den Zwölffingerdarm und den Magenlappen auf die gleiche Weise und legen Sie das Bauchspeicheldrüsengewebe in eine Petrischale, die DPBS enthält, das mit 0,1 % BSA und Antibiotika auf Eis ergänzt ist. Verwenden Sie dann unter einem Präpariermikroskop eine Pinzette mit feiner Spitze, um das Fettgewebe zu entfernen.

Übertragen Sie nun die Bauchspeicheldrüse in eine Gewebekulturhaube und spülen Sie das Gewebe in drei aufeinanderfolgenden 100-Millimeter-Petrischalen mit je 10 Millilitern kaltem PBS plus BSA. Legen Sie die Bauchspeicheldrüse nach dem letzten Waschen in eine sterile, trockene Petrischale, um so viel PBS plus BSA wie möglich zu entfernen, und geben Sie das Gewebe in eine andere trockene Petrischale, die auf Eis liegt. Anschließend die Bauchspeicheldrüse mit einer Federschere zwei bis drei Minuten lang zerkleinern, bis feine Gewebestücke entstehen, und die Gewebefragmente in zwei bis drei Millilitern frisch zubereiteter kalter PBS BSA DNase I-Lösung suspendieren.

Übertragen Sie die Stücke mit einer 10-Milliliter-Pipette in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie genügend PBS BSA DNase I hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 Milliliter zu erhöhen. Geben Sie dann 350 bis 450 Mikroliter Kollagenase B in das Gewebe. Legen Sie die Tube acht Minuten lang in ein 37 Grad heißes Wasserbad und schwenken Sie sie alle drei bis vier Minuten.

Am Ende der Inkubation wird die Gewebelösung mit einer 10-Milliliter-Spritze und einer 16,5-Millimeter-Nadel siebenmal bei Raumtemperatur aufgezogen und anschließend an der Wand des 50-Milliliter-Röhrchens heruntergesprüht. Dann legen Sie das Taschentuch für weitere acht Minuten unter gelegentlichem Schwenken in das Wasserbad zurück, gefolgt von sieben Durchgängen durch die Spritze, wie gerade gezeigt. Nach der letzten mechanischen Unterbrechung wird ein 10-Mikroliter-Aliquot der Zellsuspension auf eine trockene Petrischale übertragen und das Vorhandensein von Einzelzellen und kleinen Zellclustern unter einem inversen Phasenkontrastlichtmikroskop mit einer 10-fachen Objektivlinse bestätigt.

Legen Sie dann das Röhrchen auf Eis und bringen Sie das Gesamtvolumen mit PBS BSA DNase I auf 50 Milliliter. Zentrifugieren Sie die Zellen und verwenden Sie eine P1000-Pipette, um das Pellet in fünf Millilitern kaltem PBS BSA DNase I wieder zu suspendieren. Stellen Sie das Volumen auf 5 Milliliter PBS BSA DNase I ein und zählen Sie die Zellen. Anschließend wird die Einzelzellsuspension auf eine Endkonzentration von zwei mal 10 auf die sieben Zellen pro Milliliter in kalter PBS BSA DNase I auf Eis verdünnt.

Um Immunfärbungen von Pankreaskolonien, die in Methylcellulose enthaltendem halbfestem Medium gezüchtet wurden, vollständig zu montieren, bereiten Sie zunächst eine Pasteur-Glaspipette mit einer feinen Öffnung unter Verwendung eines Bunsenbrenners vor. Befestigen Sie als Nächstes das kleine Ende einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze an einem Ende eines dünnwandigen Gummischlauchs und ein Mundstück am anderen Ende. Befestigen Sie die Pasteur-Pipette aus Glas am großen Ende einer Pipettenspitze.

Dann ziehen Sie 10 bis 50 Mikroliter DMEM/F12-Medium mit einem Prozent Methylcellulose in die Mundpipette. Stellen Sie nun die Schale mit den Kolonien auf einen invertierten Phasenkontrastmikroskoptisch und verwenden Sie das 10-fach-Objektiv, um geeignete Kolonien für die Entnahme zu finden. Platzieren Sie dann die Öffnung der Pipette neben der gewünschten Kolonie und saugen Sie langsam an den Mund, um eine einzelne Kolonie zu entnehmen.

Für eine effektive Entnahme ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Kolonie von Interesse im Fokus ist, bevor die Öffnung der Glaspipette neben dem Zellcluster platziert wird. Sobald das Volk geerntet wurde, legen Sie die Pipettenspitze in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte, die 4 % Paraformaldehyd enthält, und legen Sie das Volk in die Vertiefung. Nachdem alle Völker eingesammelt wurden, fixieren Sie die Völker über Nacht bei vier Grad Celsius durch leichtes Schütteln.

Am nächsten Morgen waschen Sie die Bienenvölker zweimal 10 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS. Von diesem Zeitpunkt an nehmen Sie die Kolonien mit einer P10-Kunststoffpipette mit gebogener Spitze auf. Nach der zweiten Wäsche lagern Sie die fixierten Kolonien über Nacht in 1,5-Milliliter-Röhrchen, die mit Paraffin gefüllt sind, bei vier Grad Celsius.

Übertragen Sie dann die Kolonien in einzelne Vertiefungen einer schwarzen Platte mit 96 Vertiefungen und klarem Boden, die 200 Mikroliter Blockierungspuffer pro Vertiefung enthalten. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln. Am nächsten Morgen werden die Kolonien in neue Vertiefungen mit 200 Mikrolitern des primären Antikörpers überführt, um eine weitere Kultur über Nacht bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln durchzuführen.

Am nächsten Morgen werden die Bienenvölker in drei aufeinanderfolgende Vertiefungen mit 200 Mikrolitern PBS plus 0,1 % Tween 20 für 10-minütige Wäschen bei Raumtemperatur umgefüllt. Nach der dritten Wäsche werden die Kolonien in saubere Vertiefungen mit 200 Mikrolitern des entsprechenden Sekundärantikörpers umgefüllt und die Platte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Völker dreimal in PBS Tween, wie gerade gezeigt, und setzen Sie die Völker für fünf Minuten bei Raumtemperatur in neue Vertiefungen mit DAPI um.

Anschließend werden die immungefärbten Kolonien in einer 35 Millimeter großen Petrischale mit Glasboden zusammengefasst und mit einem Deckglas abgedeckt. Zum Schluss bilden Sie die Kolonien mit einem konfokalen Mikroskop ab. Adulte Pankreas-Vorläuferzellen können durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung unter Verwendung der entsprechenden Gating-Parameter angereichert werden, da die koloniebildende Fähigkeit nur in CD133 Sox9/EGFP-positiven duktalen Zellen zu finden ist.

Die Pankreaskolonien können dann durch die Inversphasenkontrastlichtmikroskopie nach ihren Morphologien klassifiziert werden. Nach der Handernte können die Kolonien auch durch mikrofluidische qRT-PCR-Analyse zur Genexpression oder durch Ganzmount-Immunfärbung zur Proteinexpression analysiert werden. In der Tat exprimieren viele einzelne Kolonien Abstammungsmarker für Gang-, endokrine und azinäre Zellen, was darauf hindeutet, dass die Mehrheit der initiierenden Pankreaskolonie, die Vorläuferzellen für diese Kolonien bilden, tripotent sind.

Einmal gemeistert, können die Verfahren zum Sezieren, Dissokieren, Färben und Sortieren von Zellen sowie zum Plattieren in methylcellulosehaltiges halbfestes Medium in sechs bis sieben Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt werden. Nach der Koloniebildung können weitere Methoden wie quantitative RT-PCR, Western Blot oder Insulinsekretionsassays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Genexpression oder den funktionellen Fähigkeiten der Kolonien zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine adulte murine Bauchspeicheldrüse dissoziiert und wie man aus Pankreasvorläuferzellen erzeugte Kolonien in Methylcellulose enthaltenden halbfesten Kulturen charakterisiert.