Name: In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Lernen Sie In-vitro-Kolonie-Assays zur Charakterisierung tri-potenter Progenitorzellen aus dem adulten murinen Pankreas. Diese Methode mit Methylcellulose-Medium ermöglicht die Analyse von Selbsterneuerung und Differenzierungspotenzial einzelner Zellen.

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Wir danken Lucy Brown und Alexander Spalla aus der Analytical Cytometry Core beim City of Hope für die Unterstützung bei der Sortierung. Diese Arbeit wird teilweise durch National Institutes of Health (NIH) gewährt R01DK081587 und R01DK099734 zu HTK und U01DK089533 ADR, und von der National Science Foundation NSF Zuschuss-DMR-1206121 und California Institute for Regenerative Medicine Zuschuss RB5-07398 DAT Unterstützt unterstützt vom Joseph J. Jacobs-Institut für Molekulare Technik für Medizin an der Caltech zu DAT, und diejenigen, die aus Oxnard Foundation und Ella Fitzgerald Foundation HTK sind auch dankbar anerkannt. Finanzierung: Diese Arbeit wird teilweise durch National Institutes of Health (NIH) unterstützt gewährt R01DK081587 und R01DK099734 zu HTK und U01DK089533 ADR, und von der National Science Foundation NSF Zuschuss-DMR-1206121 und California Institute für Regenerative Medizin an Zuschuss RB5-07398 DAT Unterstützt von der Joseph J. JacobsInstitut für Molekulare Technik für Medizin an der Caltech zu DAT, und diejenigen, die aus Oxnard Foundation und Ella Fitzgerald Foundation HTK sind auch dankbar anerkannt. Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet, die in der Analytical Cytometry Core-und Lichtmikroskopie Digital Imaging-Core unterstützt durch das National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Verleihungsnummer P30CA33572 geleistete Arbeit. Studie Sponsor: Der Sponsor beteiligte sich nicht an der Studie Design, Sammlung, Analyse oder Interpretation der Daten.

<ol><li>Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+tracing+reveals+the+ontogeny+of+pancreatic+cell+fates+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis.</a> Mech Dev. 120, 35-43 (2003).</li>
<li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9%2B+ductal+cells+are+multipotent+progenitors+throughout+development+but+do+not+produce+new+endocrine+cells+in+the+normal+or+injured+adult+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas.</a> Development. 138, 653-665 (2011).</li>
<li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+gene+therapy+for+HIV+with+lentiviral+vector-modified+CD34%28%2B%29+cells+in+patients+undergoing+transplantation+for+AIDS-related+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma.</a> Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).</li>
<li>Inada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrase+II-positive+pancreatic+cells+are+progenitors+for+both+endocrine+and+exocrine+pancreas+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).</li>
<li>Solar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+exocrine+duct+cells+give+rise+to+insulin-producing+beta+cells+during+embryogenesis+but+not+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth.</a> Dev Cell. 17, 849-860 (2009).</li>
<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine%2Facinar+colonies+in+laminin+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-26a+targets+ten+eleven+translocation+enzymes+and+is+regulated+during+pancreatic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).</li>
<li>Ghazalli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+Pancreas+of+Mice+Contains+Tripotent+Progenitors+Capable+of+Giving+Rise+to+Duct%2C+Acinar%2C+and+Endocrine+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+progenitor+cells+in+the+postnatal+mouse+liver+and+pancreas+give+rise+to+morphologically+distinct+insulin-expressing+colonies+in+3D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Diabet+Stud%22%5BJournal%5D)">Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures.</a> Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Multilineage+Differentiation+and+Self-Renewal+of+Single+Pancreatic+Colony-Forming+Cells+from+Adult+C57Bl%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice.</a> Stem Cells Dev. , (2014).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+conversion+of+human+pancreatic+ductal+cells+into+insulin-secreting+endocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells.</a> Elife. 2, e00940(2013).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organoid-initiating+cells+in+mouse+pancreas+and+liver+are+phenotypically+and+functionally+similar%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar.</a> Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).</li>
<li>Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoietin%2C+the+ligand+for+the+Mpl+receptor%2C+synergizes+with+steel+factor+and+other+early+acting+cytokines+in+supporting+proliferation+of+primitive+hematopoietic+progenitors+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice.</a> Blood. 87, 4544-4551 (1996).</li>
<li>Ku, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li>
<li>Winkler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+insulin-expressing+colony-forming+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors.</a> J Vis Exp. , e3148(2011).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li>
<li>Formeister, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+SOX9+levels+differentially+mark+stem%2Fprogenitor+populations+and+enteroendocrine+cells+of+the+small+intestine+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).</li>
<li>Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide (PN) 68000088 K1. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.fluidigm.com/documents">http://www.fluidigm.com/documents</a> (2015).</li>
<li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dosage-dependent+requirement+for+Sox9+in+pancreatic+endocrine+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation.</a> Dev Biol. 323, 19-30 (2008).</li>
<li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li>
<li>Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+multipotent+pancreatic+progenitors+using+flow-cytometric+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting.</a> Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).</li>
<li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li>
<li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455, 627-632 (2008).</li>
<li>Baeyens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+cytokine+treatment+induces+acinar+cell+reprogramming+and+regenerates+functional+beta+cell+mass+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice.</a> Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).</li>
<li>Thorel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+adult+pancreatic+alpha-cells+to+beta-cells+after+extreme+beta-cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss.</a> Nature. 464, 1149-1154 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Pankreas - Kolonie - Assays und einzelne Kolonie Analysen der Methylhaltigen hämatopoetischen Kolonie - Assays beschrieben hier wurden inspiriert , die bei der Entschlüsselung der Biologie der hämatopoetischen Vorläuferzellen in den vergangenen Jahrzehnten 23 Hauptrollen gespielt haben. In diesen Assays (Abbildung 5), dissoziiert sind Pankreaszellen ausplattiert in Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medien mit geeigneten Wachstumsfaktoren und ECM - Proteinen, die die Bildung von Ring, ...

Das Pankreas besteht aus drei Hauptzelllinien; acinar Zellen sezernieren Verdauungsenzyme, Kanäle Krankheitserreger abzuwehren und zu transportieren Verdauungsenzyme im Darm und endokrinen Zellen sezernieren Hormone, einschließlich Insulin und Glucagon, das Glukose-Homöostase aufrechtzuerhalten absondern Mucin. Während der embryonalen Entwicklung der Bauchspeicheldrüse, sind die frühen duktalen Zellen die Quelle der tri-potent Vorläuferzellen fähig ist , die zu den drei Linien in den Bauchspeicheldrüsen von erwachsenen Tieren 1,2. Da adulten Stammzellen und Vorläuferzellen, wie Knochenmark - Stammzellen werden bereits erfolgreich verwendet , um verschiedene Krankheiten 3, behandeln es intensive Interesse , die Stamm- und Vorläuferzellen im erwachsenen Bauchspeicheldrüse bei der Suche. Wenn die Isolierung und Manipulation von adulten Pankreas Stamm- und Vorläuferzellen möglich waren, konnten diese Zellen verwendet werden, um Krankheiten wie Typ-1-Diabetes zu behandeln, in denen die insulinsezernierenden Zellen durch Autoimmunität zerstört werden. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Ob Tri-potente Vorläuferzellen existieren noch in erwachsenen Pankreasgänge nach Abschluss der Embryonalentwicklung eine Frage ist, die stark in der wissenschaftlichen Gemeinschaft diskutiert wird. In dieser Debatte und unter Verwendung von in - vivo - cre-lox abstammungsVerfolgungsTechniken, Inada und Mitarbeiter zeigten , dass erwachsene Maus mit einem Marker markiert duktalen Zellen, Carboanhydrase II, was zu allen 4 drei pankreatischen Linien geben könnte. Jedoch unter Verwendung anderer duktalen Marker, wie HNF1B 5 und Sox9 2, wurde geschlossen , dass duktalen Zellen nicht die Hauptquelle von Beta - Zellen in erwachsenen Mäusen sind. Vor einigen Jahren vorgeschlagen, wir , dass die Ursache der oben erwähnten Diskussion des Fehlens liegen kann im Bereich 6,7, geeigneter Analysewerkzeuge, die verwendet werden können Selbsterneuerung und multi-lineage differenzierungs zwei Kriterien notwendig zu messen , eine Stammzelle definieren. Die in - vivo - cre-lox lineage-Tracing - Technik erwähntoben kann Hinweise auf die Beziehungsebene an einer Population Vorläufer-Nachkommen zur Verfügung stellen. Allerdings ist diese Linie Tracing-Technik in ihrer Macht beschränkt auf, ob Zellen können einzelne Vorläufer erkennen Selbsterneuerung und Differenzierung in mehrere Linien. Einzelzellanalyse ist wichtig, weil, wenn mehrere Mono potent Vorläufern, die jeweils mit einem unterschiedlichen Potential lineage zusammen analysiert wurden, sie gemeinsam mit mehreren lineage Differenzierung Fähigkeiten haben können auftreten. Außerdem sind Stammzellen der Regel eine kleinere Population von einem Erwachsenen organ. Die Aktivitäten eines kleinen Zellpopulation könnte von der großen Bevölkerung maskiert werden. Daher wird ein negatives Ergebnis aus einer Population Studie nicht notwendigerweise das Fehlen von Stammzellen an. Schließlich hat cre-lox-Linie Tracing ist nicht die Messung der Selbsterneuerung ermöglichen. Zu Beginn der Bewältigung der technischen Lücke im Bereich der Pankreas - Vorläufer Zellbiologie, Kolonie 7-11 oder 12-15 organoiden </sup&gt; Assays 3D-Kultursysteme wurden unter Verwendung entwickelt. Zwei Kolonie - Assays für Pankreas - Vorläufern wurden in unserem Labor entwickelt: einer enthält eine kommerzielle Herstellung von murine extrazelluläre Matrixproteine ​​(ECM) (siehe Methods and Equipment Table) und die andere enthält Laminin - Hydrogel, ein definiertes künstliches ECM - Protein 7-11. Progenitorzellen sind in halbfesten Medium, das Methylcellulose gemischt. Methylcellulose ist ein biologisch inert und viskoses Material aus Holzfasern hergestellt, und 16 in hämatopoetische Kolonie - Assays routinemäßig verwendet worden ist. Die Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medium beschränkt die Bewegung der einzelnen Vorläuferzellen, so dass sie nicht wieder aggregieren. Noch ist das Medium weich genug, um eine Vorläuferzelle zu erlauben, in einer Kolonie von Zellen in dem 3D-Raum zu wachsen und differenzieren. Im Anschluss an die Tradition der Hämatologen, eine Zelle, die Pankreas-Vorläufer von was zu einer Kolonie von Zellen in der Lage war, named eine Pankreas-Kolonie bildende Einheit (PCFU). PCFUs, wenn sie in der Maus - ECM-enthaltenden Kolonie - Assay, geben Anlass zu zystischer Kolonien gewachsen , die &quot;Ring&quot; Kolonien 7 genannt werden. Nach Zugabe eines Wnt - Agonist R-spondin1, in die murine ECM-enthaltenden Kultur, schalten einige Ring Kolonien in &quot;Dense&quot; Kolonien 7. In diesem Artikel werden diese beiden Arten von Kolonien in murine ECM Kultur gezüchtet zusammenfassend als &quot;Ring / Dense&quot; Kolonien. Wenn Ring / Dense Kolonien in einzelne Zellsuspension dissoziiert sind und neu plattiert in Kulturen , die Laminin Hydrogel enthalten, &quot;Endokrine / acinar&quot; Kolonien werden 7 gebildet. Mit einzelnen Kolonie - Analysen wurde festgestellt , dass die Mehrheit der Ring / Dense und Endokrine / acinar Kolonien, entweder von Erwachsenen (2-4 Monate alt) 7,11 oder junge (1 Woche alt) 9 Maus - Pankreas exprimieren alle drei Lineage Marker. Dies legt nahe, dass die meisten der Ursprung PCFUs sind Tri-potent. Im Maus - ECM-enthaltenden Kolonie - Assay, erwachsenen Maus PCFUs robust selbst zu erneuern und zu erweitern etwa 500.000 Mal über 11 Wochen in Kultur 7. Murine ECM unterstützt vorzugsweise die Differenzierung von duktalen Zellen über endokrine und acinar Linien, wohingegen in Gegenwart von Laminin - Hydrogels sind murine PCFUs gefördert bevorzugt in endokrinen und Azinuszellen zu differenzieren und weniger auf die duktale lineage 7,9,11. Wichtig ist , dass Insulin Glucagon + - mono-hormonellen Zellen werden in der Laminin Hydrogel Kultur erzeugt und Insulin in Reaktion sekretieren Stimulation in vitro zu Glucose 7,9, was darauf hindeutet funktionelle Reife. Die Tri-Linie Differenzierungspotential 7,9 und Selbsterneuerung 11 einzelner PCFUs werden durch einzellige Mikromanipulations bestätigt, dh die Kultivierung einer Zelle pro Vertiefung für die Koloniebildung. Zusammen bieten diese Ergebnisse Hinweise darauf, dass es sich selbst erneuernden, Tri-potent, Progenitor-ähnlichen Zellen in der postnatalen Maus Bauchspeicheldrüse, die Aktivitäten in 3D-Kultur zeigen. Die murine PCFU Assays in diesem Artikel beschrieben werden , aus einer früheren Kolonie - Assay für abgeleitete Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) 17 differenziert gestaltet. Das Protokoll 18 im Detail in einem anderen JoVE Publikation dokumentiert. Die Kultur Komponenten und Techniken erforderlich 17,18 die murine ECM-enthaltenden Kolonie - Assay für erwachsene PCFUs sind die gleichen wie für MESC abgeleiteten Vorläufern durchzuführen. Daher werden diese Aspekte des Assays hier nicht wiederholt werden; statt dessen werden die folgenden Verfahren werden behandelt: 1) Dissoziation des adulten Pankreas und Sortieren CD133 + Sox9 / EGFP + duktalen Zellen, die PCFUs von erwachsenen Mäusen 7, 2) Einzelzellmanipulation der sortierten Zellen, 3) Einzelkolonie bereichern Analysen mikrofluidischen qRT-PCR und ganze-mount Immunfärbung verwendet und 4) Dissoziation von colonies in Einzelzellsuspension und Wiederbeschichtung in murine ECM oder Laminin-Hydrogel-Kolonie-Assays.

<table><tbody><tr><td>Murine ECM-Proteine (Matrigel)</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>354230</td><td>Bestand bei -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Laminin-Hydrogel</td><td>zur Verfügung gestellt von David Tirrell (Pasadena, CA, USA)</td><td></td><td>Bestand bei -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Shinetsu Chemical (Tokio, Japan)</td><td></td><td>1.500 Centipoise (dynamische Viskositätseinheit entspricht 15 g/cm/sec) (hohe Viskosität)</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat-Buffered Saline</td><td>Mediatech (Manassas, VA, USA)</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Flakon Konisches Fläschchen</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm Suspensionskulturschale</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>DNase1</td><td>Calbiochem (Darmstadt, Deutschland)</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase B</td><td>Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Schweiz)</td><td>11088831001</td><td>Bestand bei -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD16/32</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>101310</td><td>niedriges Endotoxin, azidfreies</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Ratte IgG2a & Kappa; </td><td>Isotyp-Kontroll-Biolegende (San Diego, CA, USA)</td><td>400522</td><td></td></tr><tr><td>Ratten-IgG1 & Kappa; Isotypkontrolle</td><td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td><td>13-4301-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD133-Biotin</td><td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td><td>13-1331-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD71-PE-Cy7</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>113812</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Allophycocyanin</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>405207</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol</td><td>Invitrogen ( Waltham, Massachusetts; USA)</td><td>3571</td><td>Lagerbestand bei -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Anti-Mucin 1</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>HM-1630-P1</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 649 Ziege anti-armenischer Hamster</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>127-495-160</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nährstoffmischung F-12</td><td>Mediatech (Manassas, VA, USA)</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Rinderserum</td><td>Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA)</td><td>101</td><td>Bestand bei -20 &#176 gehalten; C</td></tr><tr><td>Tris Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>TEKnova (Hollister, CA, USA)</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Micro Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Niederlande)</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTec Reverse Transkription Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Niederlande)</td><td>205310</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>Ambion/Invitrogen (Grand Island, NY, USA)</td><td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>005-000-121</td><td>Bestand gehalten bei -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Eselsserum</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>0017-000-121</td><td>Bestand bei -20 &#176 gehalten; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>T-4799</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Invitrogen (Waltham, MA,&nbsp; USA)</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies (Waltham, MA, USA)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sterilwasser Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipette</td> für Molekularbiologie <td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtergewebe</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Filtergewebe</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 96 Well Suspension</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924 (zuvor 83.1835)</td><td></td></tr><tr><td>1 cc Spritze</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 cc Spritze</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>48.48 Dyanmic Array Chip</td><td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td><td>BMK-M-48.48</td><td></td></tr><tr><td>Fluidigm GE 48.48 Dynamisches Array Probe & Reagenzienkit für die Assay-Beladung</td><td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td><td>85000800</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA)</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol-Sorbitan-Monolaurat</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenschale</td><td>MatTek (Ashland, MA, USA)</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>35 mm Petrischale mit Glasboden</td></tr><tr><td>Mundstück/Gummischlauch</td><td>Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)</td><td>MP-SET</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>N0636</td><td>Lagerbestand gehalten bei -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor</td><td>R& D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>293-VE</td><td>Bestand bei -80 &#176; C</td></tr><tr><td>Activin B</td><td>R& D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>659-AB</td><td>Bestand bei -80 &#176; C</td></tr><tr><td>Extendin 4</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>E7144</td><td>Lagerbestand bei -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Rspondin-1</td><td>R& D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>3474-RS</td><td>Bestand bei -80 &#176; C</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Nadel 18 G x1 1/2</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Nadel 16 G x 1 1/2</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 Well flache Bodenplatte&nbsp;</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 Black Well Plate</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>3603</td><td>Flacher, klarer Boden mit Deckel.&nbsp; Mikrotiterplatten aus schwarzem Polystyrol mit TC-Behandlung</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverses Mikroskop</td><td>Carl Zeiss AG (Oberkochen, Deutschland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biomark HD&nbsp;</td><td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aria Special Order Research Product Cell</td><td>Sorter Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS/BSA</td><td></td><td></td><td>1x PBS 
0,1% (wt/vol) BSA 
PenStrep (49 Einheiten/ml Penicillin, 49 &mu; g/ml Streptomycin)</td></tr><tr><td>PBS/BSA/Dnase1</td><td></td><td></td><td>1x PBS 
0,1% (wt/vol) BSA 
PenStrep (49 Einheiten/ml Penicillin, 49 &mu; g/ml Streptomycin) 
Dnase 1 (2.400 Einheiten/ml pro Bauchspeicheldrüse)</td></tr></tbody></table>

in - vitro - assays für colony tri-potente progenitorzellen charakterisieren von den adult murine pancreas isoliert

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stamm- und Vorläuferzellen aus der Bauchspeicheldrüse erwachsener könnte eine potentielle Quelle von therapeutischen beta-ähnlichen Zellen werden zur Behandlung von Patienten mit Typ 1 Diabetes. Es ist jedoch noch nicht bekannt, ob Stamm- und Vorläuferzellen im erwachsenen Bauchspeicheldrüse existieren. Forschungsstrategien mit cre-lox abstammungs Tracing in erwachsenen Mäusen haben Ergebnisse erzielt, dass entweder unterstützen oder die Idee zu widerlegen, dass Beta-Zellen aus den Kanälen erzeugt werden kann, der vermuteten Stelle, an der erwachsenen Pankreas-Vorläufern vorhanden sein können. Diese in - vivo - cre-lox abstammungs Tracing - Verfahren kann jedoch nicht beantworten die Fragen der Selbsterneuerung und Multilinien - Differenzierung zwei Kriterien notwendig , um eine Stammzelle zu definieren. Zunächst diese technische Lücke Adressierung erarbeiteten wir 3-dimensionale Kolonie-Assays für Pankreas-Vorläufern. Bald nach unserer ersten Veröffentlichung, andere Labors entwickelt unabhängig eine ähnliche, aber nicht identische Verfahren die organoiden Test genannt. Im Vergleich zum organoiden Assay unser Verfahren verwendetMethylcellulose, die viskose Lösungen bildet, der die Aufnahme von extrazellulären Matrixproteinen in niedrigen Konzentrationen ermöglichen. Die Methylcellulose enthaltenden Assays erlauben einfachere Erkennung und Analyse von Vorläuferzellen auf der Ebene einzelner Zellen, die entscheidend sind, wenn Vorläufern eine kleine Subpopulation bilden, wie es der Fall für viele erwachsene Orgel Stammzellen ist. Zusammen zeigen Ergebnisse von mehreren Laboratorien in vitro Selbsterneuerung und multi-lineage Differenzierung von Pankreas - Vorläuferähnlichen Zellen von Mäusen. Die aktuellen Protokolle beschreiben zwei Methylcellulose-basierte Kolonie-Assays Maus Pankreas-Vorläufern zu charakterisieren; einer enthält eine kommerzielle Herstellung von murine extrazellulären Matrixproteinen und die andere eine künstliche extrazelluläre Matrixprotein als Laminin Hydrogel bekannt. Die Techniken , die hier gezeigt werden , sind 1) die Dissoziation des Pankreas und Sortieren von CD133 + Sox9 / EGFP + duktalen Zellen von erwachsenen Mäusen, 2) Einzelzell Manipulation der sorted Zellen, 3) analysiert einzelne Kolonie mikrofluidischen qRT-PCR und ganze-mount Immunfärbung verwendet und 4) Dissoziation von primären Kolonien in Einzelzellsuspensionen und Wiederbeschichtung in sekundäre Kolonie-Assays Selbsterneuerung oder Differenzierung zu beurteilen.

Adult Pankreas - Vorläuferzellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (Abbildung 1) angereichert werden. Die Sox9 / EGFP transgenen Mauslinie hier verwendet wurde zum ersten Mal als Ergebnis des Projekts GENSAT Gehirn - Atlas 19 erzeugt, und die EGFP Reporter unter der Kontrolle eines bakteriellen künstlichen Chromosom enthält ~ 75 kb stromaufwärts und ~ 150 kb Downstream - Sequenzen von Sox9 20 . In diesen Mäusen markiert EGFP Pankreasgänge e...

In vitro - Kolonie - Assays Selbsterneuerung und Differenzierung von Vorläuferzellen , isoliert aus adulten murinen Bauchspeicheldrüse sind entwickelt zu detektieren. In diesen Assays geben Bauchspeicheldrüsen Progenitoren Anlass zu Zellkolonien in 3-dimensionalen Raum in Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medium. Protokolle für die sind einzelne Zellen und Charakterisierung von einzelnen Kolonien Handhabung beschrieben.

In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Das übergeordnete Ziel dieser Protokolle besteht darin, die aus von erwachsenen Mäusen isolierten pankreatischen Vorläuferzellen hervorgegangenen Zellkolonien mittels Kulturtests zu charakterisieren, die ein halbfestes Medium mit Methylcellulose verwenden. Unsere Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich der Biologie pankreatischer Vorläuferzellen zu beantworten, beispielsweise: Welche Selbsterneuerungs- und Differenzierungspotenziale besitzen Vorläuferzellen im erwachsenen Pankreas? Der Hauptvorteil dieser Techniken liegt darin, dass sie die Untersuchung einzelner Vorläuferzellen ermöglichen, was wichtig ist, um deren tatsächliche biologische Potenziale zu ermitteln.Die Idee zu diesen Methoden entstand, als uns bewusst wurde, dass die Kolonieassays zur Untersuchung hämatopoetischer Stammzellen auch auf Pankreaszellpopulationen angewendet werden könnten. Die Durchführung der Verfahren wird Jacob Tremblay, ein Doktorand, Dr. Janine Quijano, eine Postdoktorandin, und Fräulein Angela Luo, eine technische Assistentin, alle aus meinem Labor, demonstrieren. Unmittelbar nach der Tötung mit einer Schere einen vertikalen Schnitt entlang der Mittellinie der Bauchwand durchführen und die Bauchhöhle öffnen.Mit einer Pinzette wird die Milz vorsichtig angehoben und das Bindegewebe zwischen der Milz und dem Milzlappen der Bauchspeicheldrüse mit einer Schere durchtrennt. Auf die gleiche Weise werden die Bindegewebsverbindungen zu den duodenalen und gastrischen Lappen durchtrennt, und das Pankreasgewebe wird in eine Petrischale gegeben, die mit DPBS ergänzt durch 0,1 % BSA und Antibiotika auf Eis enthält. Anschließend wird unter einem Stereomikroskop mit einer feinen Pinzette das Fettgewebe entfernt.Überführen Sie nun die Pankreasorgane in eine Zellkulturschleuse und spülen Sie das Gewebe nacheinander in drei 100-Millimeter-Petri-Schalen, die jeweils 10 Milliliter kalte PBS mit BSA enthalten. Nach dem letzten Waschschritt legen Sie die Pankreasorgane in eine sterile, trockene Petri-Schale, um so viel PBS mit BSA wie möglich zu entfernen, und überführen das Gewebe anschließend in eine weitere trockene Petri-Schale auf Eis. Zerkleinern Sie danach das Pankreas mit einer Feder-Schere zwei bis drei Minuten lang, bis feine Gewebestücke entstehen, und suspendieren Sie die Gewebefragmente in zwei bis drei Milliliter frisch zubereiteter kalter PBS-BSA-DNase-I-Lösung.Unter Verwendung einer 10-Milliliter-Pipette die Stücke in ein 50-Milliliter-Konischgefäß überführen und so viel PBS BSA DNase I hinzufügen, dass das Gesamtvolumen 10 Milliliter beträgt. Anschließend 350 bis 450 Mikroliter Kollagenase B zu dem Gewebe hinzugeben. Das Gefäß acht Minuten lang in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad stellen, wobei alle drei bis vier Minuten geschwenkt wird.Am Ende der Inkubation eine 10-Milliliter-Spritze mit einer Nadel der Größe 16,5 verwenden, um die Gewebelösung aufzuziehen und anschließend siebenmal die Lösung an der Wand des 50-Milliliter-Röhrchens bei Raumtemperatur herunterzusprühen. Danach das Gewebe für weitere acht Minuten in das Wasserbad zurückgeben und gelegentlich vorsichtig schwenken, gefolgt von sieben Durchgängen durch die Spritze, wie zuvor gezeigt. Nach der letzten mechanischen Dissoziation ein 10-Mikroliter-Aliquot der Zellsuspension auf eine trockene Petrischale übertragen und das Vorhandensein einzelner Zellen sowie kleiner Zellverbände unter einem umgekehrten Phasenkontrast-Lichtmikroskop mit einem 10x-Objektiv überprüfen.Als Nächstes stellen Sie das Röhrchen auf Eis und ergänzen das Gesamtvolumen mit PBS BSA DNase I auf 50 Milliliter. Zentrifugieren Sie die Zellen und verwenden Sie eine P1000-Pipette, um das Pellet in fünf Milliliter kaltem PBS BSA DNase I erneut aufzuschwemmen. Danach filtrieren Sie die Zellen durch einen 70-Mikrometer-Nylon-Mesh-Filter, gefolgt von einem 40-Mikrometer-Nylon-Mesh-Filter, in ein neues 50-Milliliter-Polypropylen-Konusröhrchen. Stellen Sie das Volumen auf 5 Milliliter PBS BSA DNase I ein und zählen Sie die Zellen. Verdünnen Sie anschließend die Einzelzell-Suspension auf eine Endkonzentration von zwei mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter in kaltem PBS BSA DNase I auf Eis.Um Immunfärbungen an ganzmontierten pankreatischen Kolonien durchzuführen, die in einem halbfesten Medium mit Methylcellulose gezüchtet wurden, bereiten Sie zunächst eine Glas-Pasteurpipette mit einer feinen Öffnung mithilfe eines Bunsenbrenners vor. Befestigen Sie anschließend das kleine Ende einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze an einem Ende eines dünnwandigen Gummischlauchs und ein Mundstück am anderen Ende. Verbinden Sie die Glas-Pasteurpipette mit dem großen Ende der Pipettenspitze.Anschließend 10 bis 50 Mikroliter DMEM/F12-Medium mit einem Prozent Methylcellulose in die Mundpipette aufziehen. Danach die Schale mit den Kolonien auf den Objekttisch eines invertierten Phasenkontrastmikroskops stellen und mit dem 10x-Objektiv geeignete Kolonien zum Auswählen suchen. Dann die Öffnung der Pipette neben die gewünschte Kolonie bringen und langsam Saugkraft durch den Mund ausüben, um eine einzelne Kolonie aufzunehmen.Für eine effektive Gewinnung ist es wichtig sicherzustellen, dass die gewünschte Kolonie im Fokus ist, bevor die Öffnung der Glaspipette neben dem Zellverband platziert wird. Sobald die Kolonie gewonnen wurde, setzen Sie die Pipettenspitze in ein Loch einer 96er-Platte, die 4 % Paraformaldehyd enthält, und geben Sie die Kolonie in das Loch ab. Nachdem alle Kolonien gesammelt wurden, fixieren Sie die Kolonien über Nacht bei vier Grad Celsius mit sanftem Schütteln. Am nächsten Morgen die Kolonien zwei Mal für 10 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur in PBS waschen. Ab diesem Zeitpunkt die Kolonien mit einer Plastik-P10-Pipette mit gebogenem Spitzenende aufnehmen. Nach der zweiten Wäsche die fixierten Kolonien über Nacht in 1,5-Milliliter-Röhrchen mit Paraffin bei vier Grad Celsius lagern.Überführen Sie anschließend die Kolonien in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Schwarzplatte mit klarem Boden, die jeweils 200 µL Blockpuffer enthalten. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius unter sanftem Schütteln. Am nächsten Morgen überführen Sie die Kolonien in neue Vertiefungen, die jeweils 200 µL des gewünschten primären Antikörpers enthalten, und führen eine weitere Übernachtkultur bei vier Grad Celsius unter sanftem Schütteln durch.Am nächsten Morgen überführen Sie die Kolonien in drei aufeinanderfolgende Vertiefungen, die jeweils 200 µL PBS mit 0,1 % Tween 20 enthalten, und waschen sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der dritten Wäsche überführen Sie die Kolonien in saubere Vertiefungen, die jeweils 200 µL der geeigneten sekundären Antikörperlösung enthalten, und inkubieren die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Kolonien dreimal wie zuvor gezeigt mit PBS-Tween und überführen sie anschließend für fünf Minuten bei Raumtemperatur in neue Vertiefungen mit DAPI.Anschließend sammeln Sie die immungefärbten Kolonien in einer 35-Millimeter-Petrischale mit Glasboden und bedecken sie mit einem Deckglas. Schlussendlich werden die Kolonien mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Adulte pankreatische Vorläuferzellen können mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung unter Verwendung geeigneter Gating-Parameter angereichert werden, da die Koloniebildungs­fähigkeit nur in CD133 Sox9/EGFP-positiven duktalen Zellen vorliegt.Die pankreatischen Kolonien können anschließend anhand ihrer Morphologien mittels invertierter Phasenkontrast-Lichtmikroskopie klassifiziert werden. Nach manueller Isolierung können die Kolonien außerdem mittels mikrofluidischer qRT-PCR-Analyse auf Genexpression oder mittels Ganzpräparat-Immunfärbung auf Proteinausprägung untersucht werden. Tatsächlich exprimieren viele einzelne Kolonien Linienmarker für Ductus-, endokrine und azinäre Zellen, was darauf hinweist, dass die Mehrheit der ursprünglichen pankreatischen koloniebildenden Vorläuferzellen für diese Kolonien tripotent ist.Wenn man die Dissektion, Dissoziation, Zellfärbung und Sortierung sowie das Ausplattieren der Zellen in ein Methylcellulose enthaltendes halbfestes Medium einmal beherrscht, können diese Schritte bei korrekter Durchführung innerhalb von sechs bis sieben Stunden abgeschlossen werden. Nach der Koloniebildung können weitere Methoden wie quantitative RT-PCR, Western Blot oder Insulinsekretionsassays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Genexpression oder zu den funktionellen Eigenschaften der Kolonien zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen adulten murinen Pankreas dissoziiert und wie man aus pankreatischen Vorläuferzellen entstandene Kolonien in halbfesten Kulturen mit Methylcellulose charakterisiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Eine dreidimensionale klonogene Test, dass Pankreas-like Vorläuferzellen in Insulin-exprimierenden Kolonien unterscheiden können beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile von halbfesten Medien mit Methylcellulose, Matrigel und Wachstumsfaktoren, in denen einzelne Vorläuferzellen proliferieren und...

A Quantitative Assay für Insulin-exprimierenden Koloniebildende Vorläufern

Die aktuelle Studie beschreibt eine gerichtete Differenzierung Ansatz bei der Induktion von Pankreas-Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen. Von großer Bedeutung ist der Befund, dass Endothelzellen Co-Kultur vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen in Insulin exprimierenden Zellen.

Endothelial Cell Co-Kultur Vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen zu Pankreas-Insulin-produzierenden Zellen in einer gerichteten Differenzierung Ansatz

Ein Protokoll zur Isolierung und Kultur und Bildinselzellclustern (ICC) von humanen fötalen Pankreaszellen abgeleitet wird beschrieben. Die Methode beschreibt die erforderlich sind, um Chipkarten aus Gewebe, Kultur als Monoschichten oder in Suspension als Aggregate und Bild für Marker der Proliferation und Pankreaszellschicksal Entscheidungen erzeugen Schritte.

Isolierung, Kultur und Imaging von humanen fötalen Pankreas-Zellhaufen

Die in diesem Protokoll beschriebenen dreidimensionalen Kulturverfahren rekapituliert Bauchspeicheldrüse Entwicklung von verteilten embryonalen Maus-Pankreasvorläuferzellen, einschließlich ihrer erheblichen Ausweitung, Differenzierung und Morphogenese in einem verzweigten Organ. Dieses Verfahren ist zugänglich Bildgebung, funktionelle Störungen und Manipulationen der Nische.

In-vitro-Pankreas Organogenese von Dispersed embryonalen Maus-Vorläufer

Hier beschreiben wir eine 4-Stufen - Protokoll an humanen embryonalen Stammzellen zu NKX6-1 + Pankreas - Vorläufern in vitro zu differenzieren. Dieses Protokoll kann auf einer Vielzahl von menschlichen pluripotenten Stammzelllinien angewendet werden.

Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Vorläufern

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Insulin mit dem Ausdruck 3D murinen Pancreatoids von Pankreas Stammväter frei schwebenden e10.5 getrennt und die damit verbundenen Mesenchym zu generieren.

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

Dieses Protokoll stellt einen Vergleich zwischen zwei verschiedenen Induktionsprotokollen zur Differenzierung menschlicher Zellpulpa-Stammzellen (hDPSCs) gegenüber Pankreaslinien in vitrodar: dem integrativen Protokoll und dem nicht-integrativen Protokoll. Das integrative Protokoll erzeugt mehr insulinproduzierende Zellen (IPCs).

In vitro Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen in Pankreaslinien

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Erhöhung der Koexpression von PDX1- und NKX6.1-Transkriptionsfaktoren in Pankreas-Vorläuferzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPS-Zellen) in planaren Monoschichten. Dies wird erreicht, indem die frische Matrix aufgefüllt, die Zelldichte manipuliert und die endodermalen Zellen dissoziiert werden.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse in einem 2D-Kultursystem

Die Differenzierung von Stammzellen in Inselzellen bietet eine alternative Lösung zur herkömmlichen Diabetesbehandlung und Krankheitsmodellierung. Wir beschreiben ein detailliertes Stammzellkulturprotokoll, das ein kommerzielles Differenzierungskit mit einer zuvor validierten Methode kombiniert, um die Herstellung von Insulin sezernierenden, aus Stammzellen gewonnenen Inseln in einer Schale zu unterstützen.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu insulinproduzierenden Inselclustern

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die gerichtete Differenzierung und funktionelle Analyse von β-zellähnlichen Zellen vor. Wir beschreiben optimale Kulturbedingungen und Passagen für humane pluripotente Stammzellen, bevor insulinproduzierende Pankreaszellen erzeugt werden. Die sechsstufige Differenzierung schreitet von der endgültigen Endodermbildung bis hin zu funktionellen β-Zell-ähnlichen Zellen fort, die Insulin als Reaktion auf Glukose absondern.

Optimiertes Protokoll zur Erzeugung funktioneller Insulin-sezernierender Zellen der Bauchspeicheldrüse aus humanen pluripotenten Stammzellen

Wir bieten ein minimalinvasives Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von von humanen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Stammzellinseln in immundefiziente Mäuse für die In-vivo-Implantation und nachgelagerte Analyse.

Intramuskuläre Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten endokrinen Zellen der Pankreasbildung bei Mäusen

Lernen Sie In-vitro-Kolonie-Assays zur Charakterisierung tri-potenter Progenitorzellen aus dem adulten murinen Pankreas. Diese Methode mit Methylcellulose-Medium ermöglicht die Analyse von Selbsterneuerung und Differenzierungspotenzial einzelner Zellen.

In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert

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