Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu beschreiben, wie Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen in frisch präparierten Hirnschnitten durchgeführt werden können. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z.B. die Frage, wie experimentelle Kontrollmanipulationen die Aktivität bestimmter Neuronen in bestimmten Gehirnregionen verändern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das Medium bietet, um ein X vivo-Präparat lang anhaltende Veränderungen der Neuronenfunktionen zu identifizieren, die sich bei intakten wachen Tieren entwickelt haben.

Obwohl diese Methode Einblicke in die neuronalen Funktionen in Hirnschnitten geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. Zellen in Kultur und Neuronen in vivo. Francisco Garcia-Oscos, ein Student aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Um diesen Vorgang zu beginnen, ziehen Sie mit einer Kunststoffpipette mit Trimmspitze vorsichtig ein Hirnschnitt aus der Aufwachkammer.

Setzen Sie die Transferpipette in die Aufnahmekammer ein und drücken Sie die Scheibe vorsichtig aus der Pipette auf das Deckblattfutter am Boden der Kammer. Positionieren Sie anschließend mit dem 4x-Objektiv des Mikroskops die Scheibe so, dass der gewünschte Bereich genau in der Mitte der Aufnahmekammer platziert wird. Nachdem die gewünschte Position erreicht wurde, sichern Sie die Position des Gehirnschnitts mit dem Scheibenhalter, der auch als Harfe bezeichnet wird.

Wechseln Sie danach zum 40-fach-Objektiv und senken Sie das Objektiv vorsichtig ab, bis es den ACSF in der Kammer berührt. Verwenden Sie dann das Feineinstellrad, um das Gewebe scharf zu stellen. Wenn der Fokus auf Gewebeebene liegt, beobachten Sie die Zellen in der Zielregion.

Suchen Sie nun nach einer Zielzelle. Markieren Sie es auf dem Computerbildschirm, um die Aufzeichnungsmikropipette zu führen. Heben Sie die Objektivlinse an, um genügend Platz für die Platzierung der Aufzeichnungsmikropipette zu haben.

Füllen Sie in diesem Schritt mit einer Ein-Milliliter-Spritze, einer nichtmetallischen Mikrospritzennadel und einem speziellen Filter eine Mikropipette mit der zuvor vorbereiteten internen Lösung. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Mikropipette befinden. Legen Sie dann die Mikropipette in einen Elektrodenhalter, so dass die Lösung mit der mit Silberchlorid beschichteten Drahtelektrode in Kontakt kommt.

Ziehen Sie die Pipettenkappe fest, so dass die Konusscheibe eine Dichtung um die Mikropipette bildet. Üben Sie anschließend mit der luftgefüllten Spritze, die mit dem Pipettenhalter verbunden ist, einen Überdruck aus, bevor Sie die Mikropipette in den ACSF eintauchen, um das Eindringen von Schmutz zu verhindern. Führen Sie die Pipette mit dem Mikromanipulator so in die Kammer, dass sie sich ungefähr unter der Mitte des eingetauchten Objektivs befindet.

Während Sie die Mikropipette mit dem Mikromanipulator mit mittlerer bis hoher Geschwindigkeit bewegen, positionieren Sie die Mikropipette auf dem Computerbildschirm und führen Sie die Mikropipette in Richtung der Position der Zelle auf der XY-Achse. In der Zwischenzeit ist der Widerstand der Mikropipette durch Anlegen eines Spannungsschritts zu messen. Üben Sie Überdruck aus, um Luftblasen oder andere Fremdkörper zu entfernen, die die Mikropipette blockieren.

Führen Sie nach dem Löschen der Mikropipette einen Spannungsoffset durch, um den Pipettenstrom auf Null zu reduzieren. Beginnen Sie mit dem Feinfokussierrad des Mikroskops mit dem Fokussieren, während Sie die Mikropipette allmählich absenken. Fokussieren Sie immer zuerst nach unten und senken Sie die Mikropipette dann in die Fokusebene, um sicherzustellen, dass die Spitze der Mikropipette nicht abrupt in die Scheibe eindringt.

Wenn die Mikropipette mit der Oberfläche der Scheibe in Berührung kommt, verlangsamen Sie die Geschwindigkeit des Mikromanipulators auf den mittleren niedrigen Modus. Üben Sie vorsichtig leichten positiven Druck aus, um Schmutz auf dem Weg zu entfernen. Nähern Sie sich dann der Zelle, indem Sie entweder mit den XYZ-Drehreglern wechseln oder indem Sie sich diagonal nähern, wobei beide XZ-Achsen durch Drehen des Z-Achsen-Drehknopfes geändert werden.

Wenn sich die Mikropipette nahe genug an der Zelle befindet, erscheint ein Grübchen auf der Zelloberfläche. Saugen Sie nun schwach und kurz durch das Rohr, das mit dem Saugrohr des Pipettenhalters verbunden ist, um eine Abdichtung zu erzeugen. Während sich ein Giga-Siegel bildet, verwenden Sie den computergesteuerten Verstärker-Commander, um das Haltepotenzial der Zellen auf das physiologische Ruhepotential zu bringen, um plötzliche Veränderungen zu verhindern, sobald die Membran gerissen ist.

Nachdem sich die Giga-Dichtung gebildet hat, kompensieren Sie die schnellen oder langsamen Kapazitäten. Hier ist es sehr wichtig, dass der ausgeübte Sog nicht zu stark ist. Andernfalls kann es vorkommen, dass die Membran vor dem Aufsetzen der Versiegelung reißt.

Wenn die Dichtung stabil bleibt und über einem Gigaom liegt, üben Sie einen kurzen und starken Sog aus, um die Plasmamembran zu zerreißen. Der Sog muss kurz und stärker sein als der Druck, der beim Einbringen einer Dichtung ausgeübt wird. Um die Membran richtig zu zerreißen und eine stabile Ganzzellkonfiguration zu erreichen.

Wenn Sie im Membrantest in den Zellmodus wechseln, können Sie verschiedene Parameter der Zelle anzeigen, wie z. B. Eingangswiderstand, Serienwiderstand und Membrankapazitäten. Nachdem Sie die Ganzzellenkonfiguration erreicht haben, überwachen Sie diese Parameter während der Aufzeichnung weiter. Hier ist ein Beispiel für die evozierte EPSCs-Steigung von einer Einzelkern-accumbens-Schale MSN gezeigt.

Wenn Sie die Temperatur von 24 auf 28 und auf 32 Grad Celsius erhöhen, erhöht sich die Steigung der evozierten EPSCs. Hier wird die evozierte EPSCs-Amplitude im Voltage-Clamp-Modus bei minus 80 Millivolt gemessen. Wenn der Serienwiderstand zunimmt, nimmt die Amplitude des evozierten EPSCS ab.

Und hier ist ein Beispiel für die Spuren von zwei Neuronen, die den Effekt des Eingabewiderstands auf die Fähigkeit des Neurons zeigen, Spikes zu erzeugen. Neuronen werden stromgeklemmt und bei minus 80 Millivolt gehalten. Mit zunehmendem Eingangswiderstand steigt auch die Anzahl der Aktionspotentiale.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Erzeugung gesunder Gehirnschnitte von entscheidender Bedeutung ist. Es ist auch wichtig, die Parameter zu überwachen, die die Wellenform des elektrischen Signals beeinflussen können, wie z. B. den Serienwiderstand, den Eingangswiderstand und die Temperatur. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für den grundlegenden Aspekt der Ganzzellaufzeichnungstechnik in Gehirnschnitten haben.