Name: Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Erfahren Sie die Erzeugung von 3D-Mikrotumoren aus patientenstammigen Glioblastomzellen für Hochdurchsatz-Drug-Testing und kinomische Profilanalyse. Diese Methode ermöglicht realistische Tumorkultursysteme für personalisierte Krebstherapieforschung.

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Unterstützt von NIH R21 Zuschuss (PI: C. Willey, CA185712-01), Brain Tumor SPORE Auszeichnung (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) und SBIR Vertrag (PI: R. Singh, N43CO-2.013-00.026).

HINWEIS: Alle Xenotransplantat Therapie Auswertungen wurden unter Verwendung eines orthotopen Tumormodell für Glioblastom auf einem Protokoll getan genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee. 1. Isolierung von Patienten stammenden GBM Xenotransplantatzellen <ol><li> Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Wieder bilden Kollagenase-I in sterilem Wasser auf eine Konzentration von 5 mg / ml und Sterilfilter. Store in 1 ml Aliquots bei -20 ° C (Endkonzentration beträgt 50 &amp; mgr; g / ml in 100 ml Enzymlösung). </li><li> Man löst 100 ug Epidermal Growth Factor (EGF) in 2 ml steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Store in 100 ul (5 ug / 100 ul) Aliquots bei -20 ° C für eine Endkonzentration von 10 ng / ml. </li><li> Man löst 100 ug FGF-β in 2 ml sterilem PBS. Store in 100 ul (5 ug / 100 ul) Aliquots bei -20 ° C für eine Endkonzentration von 10 ng / ml. </li><li> Fügen Sie den folgenden auf eine 500 ml Flasche Neurobasal Media (NBM) herzustellen vollständige NBM: 10 ml B-27 Supplement ohne Vitamin A, 5 ml N2 ergänzen, 100 ul EGF, 100 ul Fibroblast Growth Factor (FGF) -Basic, 5 ml Amphotericin B, 0,5 ml Gentamycin, 5 ml L-Glutamin. </li><li> Bereiten Sie frische Enzymlösung durch die Kombination: 98,5 ml PBS, 1 ml Kollagenase-1, 0,5 ml 10x Trypsin / EDTA und sterilisieren durch Filtration durch 0,22 um Porenfilter. </li><li> Vorbereiten oder ein kleines Volumen steriler Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) / F12 Zellkulturmedium mit 7% fötalem Rinderserum (FBS) und 1x PBS ohne Calcium oder Magnesium erhalten. </li></ol></li><li> Tumor Disaggregation HINWEIS: athymischen nu / nu-Maus zuvor mit Tumorzellen in die rechte Flanke injiziert, und man ließ sie aus einer tastbaren Tumormasse ist für dieses Verfahren erforderlich. In den hier gezeigten Beispielen verwendeten wir Patienten stamm Xenotransplantat GBM Zellen, JX10 und JX12 17. <ol><li> Sterilisieren Arbeitsbereich durch Sprühen 2% Chlorhexidin und eingerichtet Arbeitsbereich Witzh notwendigen Instrumente / Lieferungen einschließlich Einweg - Bohrfutter, Pinzetten, Skalpell, Glas Petrischale, Enzymlösung, PBS und Chlorhexidin (siehe Abbildung 2A). </li><li> Euthanize Maus / Mäuse eine Flanke Tumor beherbergen. Ziel für eine 20% / min Verschiebungsrate von CO 2 unter Verwendung von 30% CO 2. Nachdem der Maus Atemstillstand zeigt, für ca. 1 min (typischerweise 3 min gesamt) CO 2 Fluss aufrechtzuerhalten. Mäuse werden aus der Kammer entfernt und zervikale Dislokation wird als Sekundär Euthanasie Bestätigung ausgeführt. Sprühen Sie das Tier mit 3% Chlorhexidin Haut zu sanieren. </li><li> Während die Maus stabil halten, machen halbkreisförmige Hautschnitt ~ 1,5 cm von Tumormasse (Flanke implantierte Tumor) beginnt kranial der Tumormasse mit einer sterilen Einweg-Skalpell mit # 11 Klinge und in Richtung Bauch der Maus Einschneiden und um auf die Schwanzende. </li><li> Reflektieren Haut über Massentumor Finger mit leichten Zug am Schwanzende des Einschnitts mit und drücken Sie dann auf der HautOberflächen Tumor zu erhöhen besten Zugang zu haben , ohne den Tumor zu berühren (siehe 2B). </li><li> Verwenden Sie mit einer Pinzette stumpfe Präparation vorsichtig frei Tumormasse von Peritonealwand und von der Haut (siehe Abbildung 2C). </li><li> Transfer Tumormasse mit einer Pinzette in sterile Glaspetrischale (NICHT Plastikgeschirr verwenden, um zu verhindern während mincing Brechen) und ordnungsgemäß Karkasse verwerfen und diese Instrumente beiseite legen. </li><li> Verwenden Sie neue Reihe von sterilen Instrumenten (Skalpell mit # 11 Klinge, halb gebogenen Pinzette) Tumorgewebe des nekrotischen Gewebes und membranösen Wirts Bindegewebe bedeckt Tumor debride. </li><li> Legen 15 ml Enzymlösung in einem sterilen entlüftet-Trypsinisierung Kolben mit Rührstab und beginnen langsam in der Haube gerührt wurde. </li><li> In einer sterilen Petrischale aus Glas, waschen geerntet Tumoren 3-5 mal mit sterilem PBS überschüssiges Blut zu entfernen (Spritze gießen oder verwenden Sie können sie mit dem PBS spülen). kippen vorsichtig Schale und Pipette oder das Waschmaterial absaugen. Mince finely zwei # 11 Skalpellklingen mit (siehe 2D). </li><li> In 14 ml Enzymlösung auf gehacktes Tumor und pipettieren sanft auf und ab 2 - 3 mal. Transfer Gemisch entlüftet-Trypsinisierung Kolben und rühren langsam für 20 min. Bereiten 5 50 ml konische Röhrchen durch Zugabe von 1,5 ml FBS zu jeder um das Trypsin in Schritt 1.2.11 zu neutralisieren. </li><li> Nach 20 min von Trypsinisierung Kolben 14 ml Zelllösung zu sammeln und mit FBS zu einem Röhrchen hinzufügen. In 14 ml frischer Enzymlösung in den Kolben und das Rühren fortgesetzt. </li><li> Zentrifuge gesammelten Zellen bei 150 g für 8 Minuten bei Raumtemperatur und den Überstand verwerfen. In 45 ml Komplett NBM zum Pellet, vorsichtig mischen und wiederholen Zentrifugation Serum auszuspülen. Re-suspend Pellet in 5ml komplette NBM und halten Sie auf dem Eis. </li><li> Wiederholen Zellernte Schritte für insgesamt 5 Ernten, alle geernteten-Zellen in einem einzigen konischen Röhrchen auf Eis kombinieren. </li><li> Legen Sie eine 40 &amp; mgr; m Zellsieb auf der Oberseite eines 50 ml konischen Röhrchen. Prep ter Zellsieb von 10 ml DMEM / F12 + 7% FBS und dann durch Waschen mit 10 ml PBS geben. </li><li> Langsam Zellsuspension Sieb hinzufügen, es (siehe Abbildung 2 M) zu durchtropfen ermöglicht. Das Register der Zelle Sieb zwischen jedem neuen Zusatz jedes Vakuum zu brechen und erlauben die suspendierten Zellen frei zu passieren (siehe Abbildung 2 N) vorsichtig anheben. </li><li> Zentrifugieren Sie die gefilterte Zellsuspension wie oben. Re-suspend in 10 ml Voll-NBM und zählen Gesamtzahl der lebenden Zellen zu bestimmen, unter Verwendung von 0,04% Trypanblau und einer Zählkammer. Halten Sie Zellen auf Eis, bis microtumor Generation. </li></ol></li></ol> 2. Alternative Tissue Disaggregation Protokoll <ol><li> Automatisierte Gewebe Dissociator und Disaggregation System. <ol><li> Legen Sie die Disaggregation Rohr in das zelluläre Dissociator, wählen Sie das Programm &quot;Tumor _02_02&quot; und drücken Sie auf Start und laufen für 32 Sekunden. Übertragungsrohr an Rotator, in 37 ° C Inkubator für 40 min. </li><li> Zentrifuge suspendiert-Zellen bei 150 g für 8 Minuten bei Raumtemperatur und den Überstand verwerfen. Während die Zellen zentrifugiert, Reagenzien für die Verarbeitung der Zellsuspension auf. 10 ml Serum-freien NBM und sanft verreiben Suspension. </li><li> 30 x 10 6 lebende Zellen (~ 0,3 ml) - ein Zellpellet ~ 10 enthält Nach der Zentrifugation erhalten. Re-suspendierte das Pellet in 10 ml Serum-freien NBM (siehe Abbildung 2 O). Bestimmen Sie die lebenden Zellen durch Ausschluss-Assay (siehe Schritt 3.2.2). </li></ol></li></ol> 3. Microtumor-Generation <ol><li> Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Bereiten Sie komplette NBM wie in 1.1.4 und bereiten neutralisierten High Density menschlichen Biogel (HuBiogel) (HDHG bei 3 mg / ml) pro internes Protokoll. Ähnliche Biogel Matrizen können ebenfalls verwendet werden. </li></ol></li><li> Microtumor Produktion und Kultur <ol><li> Erhalten Sie frisch gewonnenen PDX-Zellen als Einzelzellsuspension in Voll-NBM, auf Eis. </li><li> Mischen Sie die Zelle suspension mit einem gleichen Volumen von Trypan - Blau - Lösung (0,4% in PBS) und zu analysieren Hämozytometer unter Verwendung von 18 Zellzahl und Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss bestimmt werden . Entfernen notwendige Volumen 50.000 Zellen zu erzeugen / microtumor wo Volumen = (50.000 Zellen / Tumor * # Tumoren) / (Lebendzellzahl / 1 ml) und in einen frischen konischen Röhrchen. </li><li> Konzentrat-Zellen durch Zentrifugation bei 150 xg für 8 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und Zellpellet mit eiskaltem HDHG Lösung in einem abschließenden Verhältnis von 1 Teil Zellen in FBS und 4 Teilen HDHG. </li><li> Verwenden Sie eine elektronische Mehrkanalpipette 10 &amp; mgr; l pro Pin zell HDHG Mischung auf einen 96-poligen Stahlplatte verzichtet werden (mit hydrophoben Beschichtung) microtumors (2 mm Perlen mit je 50.000 Zellen) zu erzeugen. </li><li> Legen Sie 3D - Tumor Perlen innerhalb Gewebekultur - Inkubator (37 ° C, 5% CO 2, befeuchtete) für 15 min um die Perlen zu gelieren. </li><li> Nach dem Gelieren, übertragen Sie die microtumors (10 μl) zu einer benutzerdefinierten Suspensionskulturkammer (50 ml) oder große Volumen Kulturschale (10 cm) mit vollständigen NBM mit Hilfe des elektronischen Mehrkanalpipette und benutzerdefinierte Pin-Gerät;. </li><li> Nach 1 - 2 Tage in Kultur Inkubator Gewebe übertragen microtumors auf 96-Well-Kulturplatten 50 ul NBM / Vertiefung mit einem Weithals Pipette enthält Abgabe und verschiedene Assay und Analyseprotokolle durchführen. </li></ol></li><li> Medikamentöse Behandlung und Pflege von microtumors <ol><li> Wählen Sie Endkonzentrationen für Drogentests. HINWEIS: Wenn die Wirksamkeit von Medikamenten in 2D Kultur, wählen Sie 2x die IC 50 als die mittlere Dosiskonzentration bekannt ist , und wählen Sie 3-fach Reihenverdünnungen oben und unten für insgesamt 5 Dosen. Wenn beispielsweise die IC 50 9 &amp; mgr; M für das Medikament in 2D Kultur ist, wählen Sie 2 uM, 6 uM, 18 uM, 54 uM und 162 uM als Endkonzentration für Drogentests. </li><li> Bereiten Sie 2x Medikamentendosierung Lösung in Voll-NBM von Dimethyl sulfoxide (DMSO) Lager. Verdünnte Dosierung Lösung in 1% DMSO Medium, das eine 5-Dosis, 3-fach serielle Verdünnung herzustellen. </li><li> Je 50 ul Dosierungslösung zur microtumor auch 50 &amp; mgr; l in Assay-Platten, die eine endgültige DMSO-Konzentration von 0,5% zu erreichen. Wiederholen für jede Wiederholung (beispielsweise 4) bei jeder Arzneimitteldosis in 3.3.1 bestimmt. </li><li> Aufrechterhaltung Kulturen in 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Gewebekultur - Inkubator mit 1 - 14 Tagen. Feed-Kulturen zweimal wöchentlich von Medien und Medikamentenlösung wie oben erfrischend. </li></ol></li></ol> 4. Morphologische und phänotypische Analyse von Microtumors <ol><li> Bestimmen Sie die Zellmorphologie in microtumors unter Verwendung von Standard Lebendzellfärbung. <ol><li> Bereiten Sie 1 mM Lager von Calcein-AM in DMSO. Aliquotieren und bei -20 ° C. </li><li> In gewünschten Intervallen Kultur (1, 7 und 14 Tage), fügen Calcein-AM-Lösung in PBS hergestellt (ohne Ca / Mg) auf 96-Well-Platte für 1 &amp; mgr; M Endkonzentration. </li><li> bebrüten20 min in einem 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Inkubator und Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 2X, 4X und 10X (Anregung: 450-490 nm Bandpass, Emission: 515 nm Langpass dichroitische 500 nm) . </li></ol></li><li> Microtumor Wachstum / Proliferation Assay <ol><li> Löse MTT Pulver in PBS (ohne Ca / Mg) 12 mM Lager vorzubereiten. Sterilfilter, aliquoten, und bei -20 ° C. </li><li> Bei gewünschten Kultur Intervallen (1, 7 und 14 Tage), fügen Sie 20 ul MTT-Lösung auf 96-Well-Platte pro 100 &amp; mgr; l Kulturvolumen. Inkubieren 2 Std in Gewebekultur-Inkubator. </li><li> Bereiten Sie frische Lyselösung von 10% SDS in 0,01 M HCl und fügen Sie die gleiche Menge an Kulturvolumen zu den Platten. versiegelten Platten Inkubieren über Nacht in 37 ° C Inkubator. </li><li> Lesen Sie die Absorption bei 570 nm eine Mehrplattenleser. </li></ol></li><li> Microtumor Vorbereitung für Kinomic Analyse <ol><li> Bereiten Lysepuffer durch Vorkühlen auf 4 ° C und dann Zugabe einer 1: 100-Verhältnis von jedem 100x Protein Phosphataseinhibitor (PPI) und 100x Protein Protease-Inhibitor (PI). Gut mischen und auf Eis halten. </li><li> Transfer 2 microtumors jedem von drei 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Überstand entfernen und werden 40 &amp; mgr; l Lyse-Puffer, der PPI und PI in jedes Röhrchen und lysieren, für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Pipette Proben kräftig Tumor Perlen zu brechen. Zentrifuge bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C und Proben bei -80 ° C bis kinomic Analyse. </li></ol></li></ol> 5. Kinomic Profilieren von Microtumors <ol><li> Protein - Tyrosinkinase (PTK) Profilierungs <ol><li> Thaw Reagenzien (10x Protein Kinase (PK) Puffer und 2% Rinderserumalbumin (BSA)) bis 4 ° C Last PK - Puffer (300 ul 10x PK Puffer Lager in 2,7 ml dH 2 O) in die Spritze in die Position # 2 auf der Profilierung Plattform. </li><li> Öffnen Sie die Kinase-Assay-Software-Programm und laden Sie die PTK-Protokoll-Datei und klicken Sie auf &quot;START&quot;, mit Anmerkungen versehen Proben innerhalb Softwsind Programm nach dem Scannen Chips. Platz Chips auf Profilierungsplattform und Last 25 ul 2% Rinderserumalbumin (BSA) pro Array und dann LOAD drücken Sie die softwaregesteuerte Protokoll Blockierungsschritt zu beginnen. </li><li> Verdünnen 6 uM 100 mM ATP Lager mit 54 &amp; mgr; l dH 2 O 10 mM Adenosintriphosphat (ATP) zu machen. Wenn die Software die 3. beginnt und letzten Waschschritt (auf dem Bildschirm sichtbar) bringen 15 ug Lysat bis 28 &amp; mgr; l mit dH 2 O gebracht, mischen und zu Array hinzufügen. </li><li> Bereiten Sie PTK Master-Mix (MM) (für bis zu 12 Proben). Hinzufügen 32,6 &amp; mgr; l dH 2 O zu rekonstituieren Dithiothreitol (DTT) und füge 6 ul DTT und 60 ul 10x - PK - Lösung zu PTK-MM1 Rohr (bereits 60 &amp; mgr; l 10x BSA enthält). </li><li> Warten Sie, bis &quot;Load&quot; Eingabeaufforderung in der Kinase-Assay-Software erscheint dann fügen Sie 126 ul von PTK-MM1, 60 ul PTK Additiv und 60 &amp; mgr; l 10 mM ATP zu MM2 (enthält aliquotiert zuvor 4,5 ul PY20 FITC-Antikörper) und mischen.In 16 ul dieser PTK Master-Mix zu jedem Probenlysat Röhrchen und Pipette Mischung 5 mal. </li><li> Stellen Sie sicher, Deckglas sauber ist und fügen Sie dann 35 ul Lysat / Master-Mix pro Array, in der Nähe Karussell Deckel und drücken Sie LOAD-Taste. </li></ol></li><li> Serin / Threonin - Kinase (STK) Profilierung: <ol><li> Auftau-Reagenzien (10x PK-Puffer, 10x STK-Puffer und 2% BSA) auf 4 ° C. Last PK - Puffer (300 &amp; mgr; l in 2,7 ml dH 2 0) in die Spritze Position # 1, 1:10 und STK - Puffer (300 &amp; mgr; l in 2,7 ml dH 2 0) in die Spritze Position # 2. </li><li> Öffnen Sie die Kinase-Assay-Computer-Software-Programm und laden Sie die STK-Protokoll-Datei und drücken Sie START, mit Anmerkungen versehen Proben innerhalb des Programms nach dem Scannen Chips. Platz Chips auf Profilierungsplattform und Last 25 ul 2% BSA pro Array und dann LOAD drücken Sie die softwaregesteuerte Protokoll Blockierungsschritt zu beginnen. </li><li> Verdünnen 6 uM 100 mM ATP mit 54 &amp; mgr; l dH 2 O. Während Finale (3.) Waschschritt Mix2 ug Lysat und bringen bis 32,6 &amp; mgr; l mit dH 2 O, mischen und zu Array hinzufügen. </li><li> Make STK Master - Mix: In 70 ul 10x PK STK-MM1 Rohr (enthält 7 ul 100x BSA), und fügen Sie dann 42 &amp; mgr; l dH 2 O zu STK-MM1 Rohr. </li><li> Warten Sie, bis &quot;Load&quot; Eingabeaufforderung in der Kinase-Assay-Software dann: In 18 ul 10 mM ATP zu STK-MM1 und fügen 9 ul MM1 zu jedem Probenlysat. Gut mischen. </li><li> Stellen Sie sicher, Deckglas ist sauber und fügen Sie 35 ul Lysat / Master-Mix pro Array, in der Nähe Karussell Deckel und drücken Sie LOAD. </li><li> Während Final (3.) Waschschritt Hinzufügen 1,05 ul STK-FITC sekundären Antikörper zu DMAB Rohr (enthält 3,03 ul STK primärer Antikörper - Mix), fügen 39,6 ul AB - Puffer zu DMAB, fügen 356,0 ul dH 2 O zu DMAB, 30 &amp; mgr; l DMAB zu jedem Array hinzuzufügen, und drücken Sie LOAD . </li></ol></li><li> Analyse von Kinomic Daten 19,20 <ol><li> Offene-Analyse-Software und laden Sie die Bildanalyse App. Select Bildordner barcodierte und zeitgestempelt ganze Reihe Bilder für PTK oder STK Daten, wählen Sie Artikelnummer angepasst Array-Layout-Datei (86312 für PTK und 87102 für STK) enthält, und die Last vorher Array Anmerkungsdatei erzeugt. </li><li> Stellen Sie sicher, korrekte Rasterung aller Bilder und laufen Belichtungszeit App Skalierung. Statistisch gesehen vergleichen Exposition / Steigung log2 transformierten Werte und 19-21 mit Vorwäsche Kinetikkurven validieren. </li><li> Führen Sie Upstream - Kinase - Vorhersage - Software veränderte kinomic Profile zwischen den Bedingungen für die Upstream - Kinasen 22,23 abzufragen. </li></ol></li></ol>

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<li>Jarboe, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinomic+profiling+approach+identifies+Trk+as+a+novel+radiation+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator.</a> Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Throughput+Kinomic+Profiling+of+Human+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma+Identifies+Kinase+Activity+Dependent+Molecular+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes.</a> PLoS One. 10 (9), 0139267(2015).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinomic+Alterations+in+Atypical+Meningioma%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Research+Archives%22%5BJournal%5D)">Kinomic Alterations in Atypical Meningioma.</a> Medical Research Archives. 3, (2015).</li>
<li>Hothi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+chemical+screens+identify+disulfiram+as+an+inhibitor+of+human+glioblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells.</a> Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).</li>
<li>Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screening+of+Patient-Derived+Cultures+Reveals+Potential+for+Precision+Medicine+in+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma.</a> ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+personalized+medicine+with+a+three-dimensional+micro-scale+perfusion-based+two-chamber+tissue+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system.</a> Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).</li>
<li>Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glioma+cell+phenotype+in+3D+matrices+by+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).</li>
<li>Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+strategies+to+mimic+the+glioblastoma+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment.</a> Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).</li>
<li>Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Derived+Xenografts+as+a+Model+System+for+Radiation+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Radiat+Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research.</a> Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).</li>
</ol>

R.S. und R.S.S. sind Mitarbeiter von Vivo Biosciences. J.C.A. wird teilweise durch den UAB Kinome Core finanziert.

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls betreffen überwiegend Generation zu microtumor sowie Medikamentendosierung und Wartung. Da die microtumor Perlen zerbrechlich sind und leicht zerrissen, ist äußerste Sorgfalt in den beiden Entwicklungsstadien eines Tests und Wartung erforderlich. Wenn ein Fehler während einer dieser Prozesse auftritt, kann experimentell Interpretation beeinträchtigt werden, was zu Nebenstelle oder eine unnötige Wiederholung der Experimente oder sogar Ausschluss von Daten. <p class="jove_co...

Die häufigsten primären intrakraniellen bösartigen Hirntumoren sind Grad III Astrozytome und Grad IV Glioblastom (Glioblastom oder GBM). Diese Tumoren bieten schlechten Prognosen mit Median Ein-Jahres - Überlebensrate zwischen 12 bis 15 Monaten bei den derzeitigen Therapien für GBM in den USA 1-3. Multimodalität Therapien umfassen Chirurgie, Strahlentherapie und Chemotherapie einschließlich Temozolomid (TMZ) und Kinase-bezogenen Mittel. Kinase Signalgebung in GBM, einschließlich Teilmengen von Tumoren mit Amplifikation oder aktivierende Mutationen in den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), erhöht sich in Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFR) Signalisieren, erhöht Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase (PI3K) häufig dysreguliert und Unterstützung Tumor 4-6 angiogenen Signalisierung durch Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR) sowie andere Kinase angetrieben Wege. Aktuelle In - vitro und in - vivo - Modellen diese repräsentativen Veränderungen häufig verlieren &lt;sup&gt; 7. Darüber hinaus hat genetische Profilierung nicht die erwarteten Vorteile angeboten, die die Tatsache, dass genetische und epigenetische Veränderungen Veränderungen auf der Ebene der Proteinaktivität vorhersagen, nicht immer widerspiegeln kann, wo die meisten Kinase Mittel wirken direkt und wo Therapien mit anderen Wirkmechanismen wirken können Targeting indirekt. Die traditionelle immortalisierte Zelllinie, die ad infinitum agiert werden kann, ist seit langem der Standard für Drogentests aufgrund ihrer Wartungsfreundlichkeit und Reproduzierbarkeit. Jedoch leidet dieses Modell von einem hohen Nährstoff (und künstliche) Wachstumsumgebung, die Zellen für schnell wachsende, die sich stark von dem ursprünglichen Tumor auswählt. Als solches hat es bei der Entwicklung realistischer Modellsysteme ein beträchtliches Interesse, die ein komplexeres Tumor biologischen System reflektieren als in dem Patienten vorhanden ist. Tumorxenografte bei Mäusen gezüchtet direkt aus einem Primärtumor entwickelt ( &quot;xenoline&quot; Patienten stamm Xenotransplantat oder PDX) provide ein reflektierter Modellsystem, insbesondere im Rahmen von Krebstherapeutika, da sie zuverlässiger klinischer Erfolg vorhersagen , sind zu spüren. 8 Trotz der reflexions Biologie, diese Modelle sind teuer und schwierig herzustellen und aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus sind sie Hochdurchsatz-Untersuchungen nicht zugänglich. Die Notwendigkeit, eine bessere biologische Modelle zu entwickeln, die genauer molekularen Veränderungen in den primären Tumoren reflektieren und zu profilieren und diese Modelle durch direkte Maßnahmen der Kinaseaktivität zu testen, nicht genetische Marker Surrogat, ist klar. Es ist bekannt , dass im Gegensatz zu zweidimensionalen (2D) Monolayer - Kulturen, 3D oder mehrzelligen Testmodellen mehr physiologisch relevanten Endpunkten 9-11 bereitstellen kann. Gemeinsame 3D-Kultur Ansätze beinhalten Matrix beschichteten Mikrocarriern und Zell Sphäroidformation. Tumorsphäroide kann über zelluläre Aggregation mit Rührflasche, pHEMA Platte und Hänge Drop-Techniken erzeugt werden. Einschränkungen für tiese Ansätze umfassen: Unfähigkeit für einige Zellen stabil Sphäroiden, Variabilität in Wachstum und Herausforderungen mit gemischten Zelltypen zu bilden. Alternativ 12-14 viele synthetische (Hydrogel - Polymer) und tierischen Ursprungs Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Matrix aus Maus - Sarkome, Rinder - Kollagen) Matrizen entwickelt wurden , für die 3D - Kultur studiert. Maus - EHS - Matrix weitgehend verwendet wird , aber bekannten Zellwachstum und die Differenzierung in vitro zu fördern , und in vivo 15. Um 3D - Tumorbiologie zu replizieren, wurde ein Mensch Biomatrix System von Dr. Raj Singh et al. Entwickelte 16. Die natürliche, Wachstumsfaktor-freien menschlichen Biogel ermöglicht 3D-Kultur Gerüste (Perlen, Scheiben), die Langzeitkultivierung von mehreren Zelltypen unterstützen. Eine Reihe von 3D menschlichen Biogel Kultur Designs sind für die Untersuchung von Tumorwachstum, Adhäsion, Angiogenese und Invasion Eigenschaften etabliert. Vorteile und Eigenschaften der menschlichen Biogel im Vergleich zu gemeinsamenMaus - EHS - Gele sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 zusammengefasst. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Quelle: </td><td> Menschliche Amnion (gepoolte Gewebe) Pathogen-frei, IRB frei / genehmigt </td></tr><tr><td> ECM Natur: </td><td> Nichtdenaturierter Biogel (GLP-Produktion) </td></tr><tr><td> Schlüssel Komponenten: </td><td> Col-I (38%), Laminin (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), Entactin &amp; HSPG (&lt;3%) </td></tr><tr><td> GF frei: </td><td> Undetectable EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogenen, ungiftiger) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Eigenschaften der Menschen Biogel als Common EHS Gele verglichen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Menschliche Biogel </td><td> EHS - Gele </td></tr><tr><td> Natürliche menschliche Matrix </td><td> Rekonstituierte Maus Matrix </td></tr><tr><td> Controlled Zellwachstum und Differenzierung </td><td> Kann das Zellwachstum und Differenzierung fördern </td></tr><tr><td> Physiologische Genexpression </td><td> Variable Genexpression </td></tr><tr><td> 3D gewebeähnlichen Kulturmodell </td><td> Plattenbasis Kulturmodell </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Die Vorteile der Menschen Biogel als Common EHS Gele verglichen.

<table><tbody><tr><td>Kollagenase-I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CO130</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>1x Endkonzentration</td></tr><tr><td>B-27 Supplement ohne Vitamin A</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td>1x Endkonzentration</td></tr><tr><td>Rekombinant Human FGF-basic</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0266</td><td>10 ng/ml Endkonzentration</td></tr><tr><td>Rekombinante humane EGF</td><td>Life Technologies</td><td>PGH0315</td><td>10 ng/ml Endkonzentration</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Corning Cellgro Mediatech</td><td>25-005-CI</td><td>2 mM Endkonzentration</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Omega Scientific</td><td>FG-70</td><td>2,5 &micro; g/ml Endkonzentration</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Omega Scientific</td><td>PS-20</td><td>100 U/ml Penicillin G, 100 & Mikro; g/ml Streptomycin Endkonzentration</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td>50 ng/ml Endkonzentration</td></tr><tr><td>MTT</td><td>Life Technologies</td><td>M6494</td><td>hergestellt auf 5 mg/ml in PBS und steril filtriert, 1 mg/ml in</td></tr><tr><td>Vertiefung SDS</td><td>Fisher</td><td>BP166</td><td>für MTT-Lysepuffer, hergestellt auf 10 % in 0,01 μm; M HCl, 5% in</td></tr><tr><td>Vertiefung HCl</td><td>Fisher</td><td>A144SI-212</td><td>für MTT-Lysepuffer, vorbereitet auf 0,01&nbsp; M mit SDS, 5 mM in der Vertiefung</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C1430</td><td>1 mM in DMSO-Lager, 2&nbsp; &Mikro; M in PBS-Färbelösung, 1&nbsp; &Mikro; M in gut</td></tr><tr><td>Halt' s Protein Phosphatase Inhibitor Cocktail&nbsp;</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>78420</td><td>Verhältnis 1:100 in MPER&nbsp;</td></tr><tr><td>Halt's Protein-Protease-Inhibitor&nbsp;</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>87786</td><td>Verhältnis 1:100 in MPER</td></tr><tr><td>Reagenz zur Extraktion von Säugetierproteinen (MPER)</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>PI78501</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231</td><td>zum Auflösen von Calcein AM & Verbindungen</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca/Mg</td><td>Lonza</td><td>17-517Q</td>, <td>verdünnt auf 1x mit MiliQ Reinstwasser und steril filtriert (für Zellkultur)</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Ca/Mg</td><td>Corning Cellgro Mediatech</td><td>20-030-CV</td>, <td>verdünnt auf 1x mit MiliQ Reinstwasser (für die Vorfixierung)</td></tr><tr><td>10% neutral gepuffertes Formalin</td><td>Protokoll</td><td>032-060</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Hubiogel</td><td>Vivo Biosciences</td><td>HDHG-5</td><td></td></tr><tr><td>Halt's Protein Phosphatase</td><td>Inhibitor Pierce</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Halt's Protein Protease Inhibitor</td><td>Pierce</td><td>87786</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz zur Extraktion von Säugetierproteinen (MPER)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78501</td><td></td></tr><tr><td>Protein-Tyrosinkinase (PTK) Array Profiling Chip</td><td>PamGene</td><td>86312</td><td></td></tr><tr><td>PTK-Kinase-Puffer</td><td>PamGene</td><td>36000</td><td>300 &micro; l 10x PK Pufferlager in 2,7&nbsp; ml dH2O, Katalognummer für PTK-Reagenzkit</td></tr><tr><td>ATP</td><td>PamGene</td><td>36000</td><td>Katalognummer für PTK-Reagenzienkit</td></tr><tr><td>PY20- FITC-konjugierter Antikörper</td><td>PamGene</td><td>36000</td><td>Katalognummer für PTK-Reagenzkit</td></tr><tr><td>PTK Additive</td><td>PamGene</td><td>32114</td><td></td></tr><tr><td>PTK-MM1 Röhrchen (10x BSA)</td><td>PamGene</td><td>36000</td><td>Katalognummer für PTK-Reagenzienkit</td></tr><tr><td>Serin/Threonin-Kinase (STK) Array Profiling-Chip</td><td>PamGene</td><td>87102</td><td></td></tr><tr><td>STK-Kinase-Puffer</td><td>PamGene</td><td>32205</td><td>Katalognummer für STK-Reagenzienkit</td></tr><tr><td>STK Primary Antibody Mix (DMAB-Röhrchen)</td><td>PamGene</td><td>32205</td><td>Katalognummer für STK-Reagenzkit</td></tr><tr><td>FITC-konjugierter Sekundärantikörper</td><td>PamGene</td><td>32203</td><td></td></tr><tr><td>STK-MM1 Röhrchen (100x BSA)</td><td>PamGene</td><td>32205</td><td>Katalognummer für STK-Reagenzienkit</td></tr><tr><td>STK Antikörperpuffer</td><td>PamGene</td><td>32205</td><td>Katalognummer für STK-Reagenzienkit</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#11 Klingen, steril</td><td>Fisher</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>#3 Skalpellgriffe, steril</td><td>Fisher</td><td>08-913-5</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petrischalen aus Glas</td><td>Fisher</td><td>08-748D</td><td></td></tr><tr><td>Halbgebogene Pinzette</td><td>Fisher</td><td>12-460-318</td><td></td></tr><tr><td>Trypsinierkolben</td><td>Fisher</td><td>10-042-12B</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer</td><td>Fisher</td><td>14-490-200</td><td></td></tr><tr><td>3/4" Rührstab</td><td>Fisher</td><td>14-512-125</td><td></td></tr><tr><td>B-D Zellsieb</td><td>Fisher</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>B-D 50 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher</td><td>#352098</td><td></td></tr><tr><td>PamStation 12</td><td>PamGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioNavigator 6.0 kinomische Analysesoftware&nbsp;</td><td>PamGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evolve Kinase Assay Software</td><td>PamGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UpKin App Software (Upstream-Kinase-Vorhersage)</td><td>PamGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissoziator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Rotary Cell Culture System (RCCS)</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-D</td><td>mit 10 ml Einweg-HARV</td></tr></tbody></table>

die erzeugung von microtumors mit 3d human biogel kultursystem und patienten stammglioblastomzellen für kinomic profilieren and drug response-testing

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Die Verwendung von patienteneigenen Xenotransplantaten zur Modellierung von Krebserkrankungen hat wichtige Einblicke in die Krebsbiologie und das Ansprechen von Medikamenten geliefert. Sie sind jedoch zeitaufwändig, teuer und arbeitsintensiv. Um diese Hindernisse zu überwinden, haben sich viele Forschungsgruppen Sphäroidkulturen von Krebszellen zugewandt. Tumor-Sphäroide oder -Aggregate sind zwar nützlich, replizieren aber keine Zell-Matrix-Wechselwirkungen, wie sie in vivo gefunden werden. Daher bieten dreidimensionale (3D) Kulturansätze, die ein extrazelluläres Matrixgerüst verwenden, ein realistischeres Modellsystem für die Untersuchung. Ausgehend von subkutanen oder intrakraniellen Xenotransplantaten wird das Tumorgewebe in eine Einzelzellsuspension dissoziiert, die den Neurosphären von Krebsstammzellen ähnelt. Diese Zellen werden dann in eine vom Menschen stammende extrazelluläre Matrix, das menschliche 3D-Biogel, eingebettet, um eine große Anzahl von Mikrotumoren zu erzeugen. Interessanterweise können Mikrotumoren mit hoher Lebensfähigkeit etwa einen Monat lang kultiviert werden und können für Arzneimittelreaktionstests mit Standard-Zytotoxizitätsassays wie 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) und Lebendzellbildgebung mit Calcein-AM verwendet werden. Darüber hinaus können sie immunhistochemisch analysiert oder für die molekulare Profilierung geerntet werden, wie z. B. das Array-basierte Hochdurchsatz-Kinomische Profiling, das hier ebenfalls ausführlich beschrieben wird. 3D-Mikrotumoren stellen somit ein vielseitiges Hochdurchsatz-Modellsystem dar, das die In-vivo-Tumorbiologie besser replizieren kann als herkömmliche Ansätze.

Wir haben gezeigt, dass 3D-Biogel Kultursystem langfristige Wachstum und die Funktion von mehreren Zelltypen unterstützt. In diesem Verbundprojekt, Patienten stammenden GBM xenolines (PDX) werden zur Herstellung von Hunderten von microtumors verwendet. Dissociated Zellen (3 x 10 5) oder Neurosphären (40 - 50) wurden in Biogel Perlen (2 mm) eingebettet und nach dem schnellen Gelieren sie kultiviert werden in einem NB-Medium gefüllt benutzerdefinierte Bioreaktor. Die Lebensfähig...

Von Patienten stammende Xenotransplantate von Glioblastoma multiforme können mit Hilfe eines humanen 3D-Biogel-Kultursystems in lebende Mikrotumoren miniaturisiert werden. Dieser in vivo-ähnliche 3D-Tumorassay eignet sich für Drug-Response-Tests und molekulares Profiling, einschließlich kinomischer Analysen.

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Das übergeordnete Ziel dieses aus Patienten gewonnenen, dreidimensionalen Mikrotumor-Kultursystems für Glioblastome besteht darin, Hochdurchsatz-Testungen von Wirkstoffen mit einem entsprechenden molekularen Profiling-Assay, wie beispielsweise einer Kinom-Analyse, zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsforschung zu beantworten, etwa: Warum wirken bestimmte Therapien bei Tumoren des einen Patienten gut, bei denen eines anderen jedoch nicht? Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein miniaturisiertes, dennoch realistisches Tumorkultursystem bereitstellt, das für die Therapieprüfung geeignet ist.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da der Umgang mit patientenderivierten Xenotransplantat-Zellen anders ist als der Umgang mit lang etablierten, immortalisierten Tumorzellen. Dies liegt an ihrer Zerbrechlichkeit und Empfindlichkeit gegenüber wechselnden Kulturbedingungen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Erzeugung von Mikrotumoren allein anhand einer Beschreibung schwer zu erlernen sind, aufgrund ihres einzigartigen und komplexen Herstellungsverfahrens.Die Tumordisaggregationsprozedur wird Catherine Langford demonstrieren, die leitende Technikerin und Laborleiterin in meinem Labor. Die Erzeugung von Mikrotumoren und die Dosierungsprozeduren für Wirkstoffe wird Rachael Shevin demonstrieren, eine Technikerin in meinem Labor. Unter Verwendung von Pinzetten vorsichtig mit stumpfer Dissektion das Tumorgewebe von der Peritonealwand und der Haut lösen und das Tumorgewebe in eine sterile Glas-Petri-Schale überführen.Verwenden Sie anschließend ein steriles Skalpell mit einer Klinge der Größe 11 und sterile halbkreisförmige Pinzetten, um das Tumorgewebe von nekrotischem Gewebe und membranösem Wirtsbindegewebe zu befreien. Spülen Sie die gereinigten Tumore dreimal bis fünfmal mit steriler RPMI-Lösung, um überschüssiges Blut zu entfernen, und kippen Sie die Petrischale vorsichtig zwischen den Spülgängen, um die Spülflüssigkeit abzudecken. Verwenden Sie nach dem letzten Spülgang zwei Klingen der Größe 11, um die Tumore fein zu zerkleinern.Verwenden Sie dann sterile halbkreisförmige Pinzetten, um die Tumore in ein Dissoziationröhre mit Enzymlösung zu überführen. Stellen Sie die Röhre in einen Zelldissoziator und wählen Sie das Programm „Tumor 2“. Klicken Sie auf „Start“, um den Dissoziator 37 Sekunden lang laufen zu lassen.Überführen Sie das Röhrchen anschließend auf einen Rotator und stellen Sie den Rotator für 40 Minuten in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator. Am Ende der Inkubation stellen Sie das Röhrchen wieder auf den Dissoziator und führen das Programm Tumor 3 für 37 Sekunden aus. Am Ende des Programms zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren das Pellet unter vorsichtiger Mischung in 10 Milliliter serumfreiem RPMI.Als Nächstes pipettieren Sie die Zellen langsam auf einen 40-Mikron-Zellfilter in einem neuen 50-Milliliter-Röhrchen und lassen die Suspension durch Schwerkraft durch den Filter tropfen. Heben Sie vorsichtig die Lasche des Zellfilters zwischen jeder neuen Zugabe von Zellen an, um das Vakuum zwischen dem Filter und dem Röhrchen zu durchbrechen und den frei fließenden Durchtritt der suspendierten Zellen durch das Netz zu ermöglichen. Nachdem alle Zellen filtriert wurden, zentrifugieren Sie die Einzelzell-Suspension und resuspendieren das Pellet in 10 Milliliter vollständigem Neurobasal-Medium.Bestimmen Sie anschließend die Anzahl der vitalen Zellen mithilfe der Trypanblau-Ausschlussmethode und stellen Sie die Zellen auf Eis. Um die Mikrotumoren herzustellen, zentrifugieren Sie die dissoziierten, vom Patienten stammenden Glioblastom-Xenolinien-Zellen und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 50.000 Zellen pro zwei Mikroliter FBS. Verdünnen Sie die Zellen danach im eiskalten High-Density-Human-Biogel im Verhältnis von 1:4 (Zellen zu Biogel).Verwenden Sie anschließend eine elektronische Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter der Zellmischung pro Nadel auf eine 96-Nadel-Stahlplatte mit hydrophober Beschichtung abzugeben. Es ist wichtig, Blasenbildung beim Mischen der Zellen, des Mediums und des Biogels zu vermeiden, gleichzeitig aber zügig und effizient zu arbeiten, um die Mikrotumoren zu erzeugen, bevor das humane Biogel auf den Nadeln zu verfestigen beginnt. Sobald alle Mikrotumoren aufgebracht wurden, überführen Sie die 3D-Tumoren für 20 Minuten in einen Zellkulturtrockenschrank, um die Tumorkügelchen zu gelieren.Am Ende der Inkubation überführen Sie die Mikrotumoren in eine 10 cm große Kulturschale, die vollständiges Neurobasal-Medium enthält, und stellen die Tumoren zurück in den Inkubator. Nach ein bis zwei Tagen überführen Sie die Mikrotumoren mithilfe einer Pipette mit breiter Öffnung in die Vertiefungen einer 96-Loch-Kulturplatte, die jeweils 50 µL Neurobasal-Medium pro Vertiefung enthalten, und geben 50 µL der entsprechenden Dosierungslösung zu jeder Vertiefung hinzu. Kultivieren Sie die behandelten Mikrotumoren im Gewebeinkubator für einen bis 14 Tage und versorgen Sie die Tumoren zweimal wöchentlich mit frischem Medium und Wirkstofflösung.Um die Mikrotumor-Zellmorphologie zu bewerten, markieren Sie die Mikrotumoren am ersten, siebten und vierzehnten Tag der Kultur für 20 Minuten mit einem Mikromolar frisch verdünntem Calcein-AM pro Vertiefung im Gewebekultur-Inkubator. Anschließend bilden Sie die Tumoren mittels Fluoreszenzmikroskopie mit 2-, 4- und 10-facher Vergrößerung ab. Um das Wachstum der Mikrotumoren zu beurteilen, behandeln Sie die Kulturen am ersten, siebten und 14. Tag mit 20 Mikroliter frisch zubereiteter MTT-Lösung für zwei Stunden im Gewebekultur-Inkubator.Am Ende der Inkubation lysieren Sie die Tumore mit frisch zubereitetem 10 %igen SDS-Lysepuffer im Verhältnis 1:1 zu den Kulturbrunnen-Volumina und versiegeln die Platte. Anschließend inkubieren Sie die Mikrotumore über Nacht bei 37 Grad Celsius in dem Lysepuffer und messen am nächsten Morgen die Absorption bei 570 Nanometern mit einem Multiplatten-Reader. Mithilfe der Live-Zell-Bildgebung mit Calcein-AM, wie gerade gezeigt, können das Zellwachstum und die Zellviabilität der Mikrotumore sowie die Wirkungen der pharmakologischen Therapien auf diese Funktionen bewertet werden.Wie beobachtet, zeigen unbehandelte Mikrotumore und Mikrotumore mit bekannter Resistenz gegenüber der experimentellen Wirkstoffbehandlung über einen zweiwöchigen Kultivierungszeitraum hinweg ein kontinuierliches Wachstumsmuster. Diese TMZ-empfindlichen Tumorzellen weisen jedoch am Ende der Kultur eine verminderte Zellproliferation als Reaktion auf die höchste Konzentration der TMZ-Behandlung im MTT-Assay auf. Interessanterweise zeigt die Kinasensignalübertragung in TMZ-resistenten Mikrotumoren eine Reihe von Peptiden mit signifikant veränderten Intensitäten nach der Behandlung mit 10 µM TMZ.Tatsächlich zeigte die Analyse dieser veränderten kinomischen Profile mithilfe einer Software zur Vorhersage upstream liegender Kinasen in diesem repräsentativen Experiment spezifische Veränderungen in den Tyrosinkinasen SYK, LCK und CTK sowie bei mehreren Serin/Threonin-Kinasen, was auf potenzielle neuartige therapeutische Zielstrukturen hindeutet, die dabei helfen könnten, die Tumortherapieresistenz zu überwinden. Nachdem die Technik beherrscht ist, kann die Tumordisaggregation in zwei Stunden abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Die Erzeugung von Mikrotumoren und die Techniken zur Applikation von Wirkstoffen können insgesamt in drei Stunden abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt werden.In Zukunft könnte dieses Modellsystem als Avatar-System im Stil eines Probanden verwendet werden, bei dem der Tumor eines Patienten molekular mit einer bestehenden, von Patienten abgeleiteten Mikrotumor-Bibliothek abgeglichen wird, um dem behandelnden Arzt die beste Therapiewahl zu empfehlen.

generation-microtumors-using-3d-human-biogel-culture-system-patient

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

In diesem Video erzeugen wir Mikrotumoren aus Tumorzellen von Patienten mit humanem 3D-Biogel. Diese Mikrotumoren ähneln stark der in vivo Tumor-Mikroumgebung und dienen als potenzielle Plattformen für Wirkstofftests.

Erzeugung von Mikrotumoren: Eine In-vitro-Kulturtechnik zur Kultivierung von 3D-Mikrotumoren zur Analyse des Ansprechens auf eine medikamentöse Behandlung

Protokoll zur Verbreitung von dissoziierten hochgradigen chirurgischen Gliomproben im serumfreien Neurosphärenmedium zur Auswahl für Zellen mit Krebsstammzellphänotyp. Für Proben, die nicht als Neurosphären wachsen, wird ein alternatives Protokoll vorgeschlagen. Eine Paraffin-Einbettungstechnik zur Aufrechterhaltung der 3D-Neurosphärenarchitektur für die Immunzytochemie wird beschrieben.

Optimierung der hochwertigen Gliom-Zellkultur von chirurgischen Proben für den Einsatz in klinisch relevanten Tiermodellen und 3D-Immunchemie

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für dreidimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen innerhalb orthogonal abstimmbaren Biomaterialien entwickelt, um das Gehirn-Matrix zu imitieren. Dieser Ansatz bietet eine in Vitro, experimentelle Plattform, die viele Eigenschaften von in Vivo Glioblastom-Zellen in der Regel in Kultur verloren beibehält.

Hyaluronsäure basierte Hydrogele für 3-dimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen

Neurosphären als 3D Kulturen angebaut sind ein mächtiges Werkzeug um Gliom Biologie zu studieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Immunohistochemistry durchführen unter Beibehaltung der 3D-Struktur von Gliom Neurospheres durch Paraffin einbetten. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Gliom Neurosphäre Eigenschaften wie Stemness und neuronale Differenzierung.

Bewertung von Biomarkern in Gliom von Immunohistochemistry auf Paraffin-eingebetteten 3D Gliom Neurosphäre Kulturen

Hier beschreiben wir einen einfach zu bedienenden Invasionstest für Glioblastom. Dieser Test eignet sich für glioblastom-Stammzellen. Ein Fidschi-Makro zur einfachen Quantifizierung von Invasion, Migration und Proliferation wird ebenfalls beschrieben.

Ein 3D Spheroid Modell für Glioblastom

Hier beschreiben wir eine Methode, um Organoide des Glioblastoms (GBM) aus primären Patientenproben oder von Patienten stammenden Zellkulturen zu erzeugen und bis zur Reife zu erhalten. Diese GBM-Organoide enthalten phänotypisch vielfältige Zellpopulationen und bilden Tumormikroumgebungen ex vivo nach.

Erhaltung der zellulären Vielfalt des menschlichen Glioblastoms ex vivo unter Verwendung dreidimensionaler Organoidkultur

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine experimentelle Plattform zur Bewertung der Auswirkungen mechanischer und biochemischer Hinweise auf chemotherapeutische Reaktionen von patientenabgeleiteten Glioblastomzellen in 3D-matrixmimetischen Kulturen unter Verwendung eines maßgeschneiderten UV-Beleuchtungsgeräts, das die Hochdurchsatz-Photovernetzung von Hydrogelen mit abstimmbaren mechanischen Eigenschaften ermöglicht.

Hydrogel-Arrays ermöglichen erhöhten Durchsatz für Screening-Effekte von Matrixkomponenten und Therapeutika in 3D-Tumormodellen

Hier skizzieren wir ein umfassendes Protokoll für die Generierung und Verwendung von labortechnisch hergestellten Glioblastom-Organoiden (LEGO), um Genotyp-Phänotyp-Abhängigkeiten zu untersuchen und potenzielle Medikamente für die Glioblastombehandlung zu screenen.

Labortechnische Glioblastom-Organoidkultur und Wirkstoffscreening

Hier etablieren wir eine metabolische Profiling-Plattform, die dreidimensionale (3D) Gliom-Sphäroide und bildgebende Normalisierung mittels extrazellulärer Flussanalyse integriert. Dieser Ansatz ermöglicht eine genauere Bewertung der metabolischen Reaktionen von Tumoren auf medikamentöse Behandlungen und gibt Einblicke in mögliche Resistenzmechanismen.

Fortschritte bei der metabolischen Profilerstellung von dreidimensionalen Hirntumor-Sphäroiden für das Wirkstoffscreening

Wir präsentieren ein 3D-Glioblastom-Migrationsmodell unter Verwendung von von Patienten abgeleiteten magnetischen Gliomsphären, die aus neu diagnostizierten und wiederkehrenden Tumoren erzeugt wurden. Diese Plattform ermöglicht die Visualisierung patientenspezifischer Migrationsdynamiken und die Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit. Der Test kann nach der Migration multiplexiert werden, um die Proteinlokalisierung und Expressionsmuster zu bewerten.

Reproduzierbarer 3D-Glioblastom-Migrationstest mit magnetischer Nanopartikel-vermittelter sphäroider Lokalisierung unter hypoxischen Bedingungen

Erfahren Sie die Erzeugung von 3D-Mikrotumoren aus patientenstammigen Glioblastomzellen für Hochdurchsatz-Drug-Testing und kinomische Profilanalyse. Diese Methode ermöglicht realistische Tumorkultursysteme für personalisierte Krebstherapieforschung.

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing (Video) | JoVE Journal

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing

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