Name: Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Lernen Sie die Biolumineszenz-Bildgebung zur Verfolgung von Trypanosoma brucei-Infektionen im ZNS von Mäusen. Diese Methode verkürzt die Arzneimittelbewertung von 180 auf 90 Tage und ermöglicht Echtzeit-Visualisierung.

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Wir danken John Kelly und Martin Taylor (London School of Hygiene &amp; Tropical Medicine) für T. Bereitstellung b. brucei GVR35-VSL-2 und Dr. Andrea Zelmer (LSHTM) für die Beratung über in - vivo - Bildgebung. Diese Arbeit wurde von der Bill and Melinda Gates Foundation Global Health Program (Grantnummer OPPGH5337) unterstützt.

Ethik Alle Arbeiten wurden im Rahmen der Genehmigung der britischen Home Office Tiere durchgeführt (Scientific Procedures) Act 1986 und der London School of Hygiene &amp; Tropical Medicine Tierschutz und Ethik Review Board. ANKOMMEN Leitlinie werden in diesem Bericht folgt. 1. In - vivo - Passage von Biolumineszenz Trypanosoma brucei brucei <ol><li> Entfernen eines kryokonservierten Lager (genannt Stabilat) von T. b. brucei Stamm GVR35-VSL-2 (erhältlich von Professor John Kelly an der London School of Hygiene &amp; Tropical Medicine durch MTA) 9 aus flüssigem Stickstoff und auf Raumtemperatur äquilibrieren. Verdünnte Stabilat bis 2 x 10 4 Trypanosomen / ml in steriler Phosphat - gepufferter Glukosesalzlösung (PBS-G) pH 8,0 (1 l PBS + 15 g Glucose) 10. Anmerkung: T. b. brucei GVR35-VSL-2 ist nicht infektiös für den Menschen und erfordert SAPO Einrichtungen lizenziert Experimente durchzuführen. </li><li> inject 20-25 g weiblichen CD1-Maus mit 0,2 ml Trypanosomen über die intraperitoneale Injektion (ip) mit einer 25 G-Nadel verdünnt. Dies ist der &quot;Spendermaus&quot;. Legen Sie die infizierte Maus in eine spezifische pathogenfreie (SPF) -cage und Futter ad libitum. Hinweis: CD1 - Mäuse sind ein Auszucht Stamm und T. b. brucei GVR35 - Infektionen sind in diesem Stamm gut charakterisiert. Jedoch ist dieses Protokoll auch für angeboren oder genetisch veränderte Stämme, aber es ist wichtig , dass die Fellfarbe zu beachten , kann auf die Empfindlichkeit der Bildgebung 6,9 auswirken. </li><li> Überwachen peripheren Parasitämie durch Blutentnahme. Platzieren Sie die Maus in eine Plastik Verzögerer und nehmen 5 ul Blut aus dem Schwanz von venepuncture mit 21 G-Nadel oder Aderlässe und mischen 1/10 mit 0,85% sterilem Ammoniumchlorid roten Blutkörperchen zu lysieren und einfacher Zählung ermöglichen. </li><li> Zählen Sie die verdünntes Blut in einer Neubauer-Zählkammer. <ol><li> Legen Sie das verdünnte Blut in beiden Kammern. Zählen Sie die gesamte zentrale grID von einer Kammer zu geben n Trypanosomen. Konzentration von Trypanosomen in Blut = n x 10 4 Trypanosomen / ml, für jede Verdünnungsfaktor einzustellen und die Mittel der beiden Kammern berechnen. Hinweis: Nach ca. 5-7 Tage nach der Infektion sollte peripheren Parasitämie steigen ausreichend um eine Infektion bei einer Konzentration von 2 x 10 4 Trypanosomen / ml durchzuführen. </li></ol></li><li> Wenn Trypanosomen ist hoch genug für die Anzahl der Mäuse erforderlich, bewegen sich auf 1,6 zu treten. Ein Parasitämie Niveau von 6 x 10 4 Trypanosomen / ml in einer Spendermaus ist für die Infektion von 10 Mäusen ausreichend. Hinweis: Für die statistisch signifikante Gruppengrößen, n = 6 für jede Behandlungsgruppe von Mäusen werden 8 benötigt. Für andere Modelle der Infektion, müssten Leistungsberechnungen angewandt werden, um geeignete Gruppengrößen zu bestimmen. </li><li> Ort Mäuse in einem Wärmefeld (bei 28-30 ° C für etwa 5-10 min) die Schwanzvenen zu erlauben, zu dilatieren.Zur Auslösung einer Klemme Narkose verabreichen 20 mg / kg Pentobarbital iv mit einer 25 G-Nadel. Bestätigen Sie die Maus wird durch sanftes Drücken der Fußballen narkotisiert, um sicherzustellen, gibt es keine Rückzugsreflex ist. </li><li> Heparinisierung eine 21 G Nadel durch Aliquotieren 5 ml Heparin bei 5000 USP-Einheiten / ml in einem Bijou Rohr und Saugen zweimal in die und aus der Nadel in eine 1 ml Spritze befestigt. </li><li> Nehmen Sie die heparinisierte 21 G Nadel und 1-ml-Spritze und führen Herzpunktur auf der narkotisierten Passage Maus durch die Nadel mittig unter dem Brustkorb eingefügt (eine Perle von Blut wird in der Basis des Nadel Pool) und ziehen Sie vorsichtig zurück auf den Kolben um nicht die Kammer des Herzens zu kollabieren. Sammeln Sie ein Minimum von 0,7 ml Blut. </li><li> Verdünnte infiziertem Blut ein Inokulum von 2 x 10 4 Trypanosomen / ml in PBS-G pH 8,0 als Schritt 1.1 oben zu erzeugen. Hinweis: An dieser Stelle kann das restliche Blut kryokonserviert werden Stabilat herzustellen, indem man mit 8% Glycerin mischen, 20% hitzeinaktiviertem fötalen calf Serum (hallo-FCS) und 72% infiziertem Blut. Langsam bei -80 ° C einfrieren ein langsam einfrieren Behälter mit einer Kühlrate von 1 ° C / min zu erreichen, bevor sie mit flüssigem Stickstoff übertragen. </li></ol> 2. Infektion von Versuchsmäusen <ol><li> Platzieren CD1 weibliche Mäuse (~ 21-25 g) in einen Heizkasten sanft warmen Venen zu dilatieren. Legen Sie die erwärmte Mäuse in eine Plastikstütze und injizieren 0,2 ml verdünnte Inokulum intravenös mit einer 25 G-Nadel in die Schwanzvene, das entspricht 4000 Trypanosomen pro Maus. Platzieren Druck an der Injektionsstelle danach die Blutung einzudämmen. Hinweis: Die intraperitoneale Infektion eine gültige Route der Infektion und wurde in früheren Studien verwendet worden , 10, aber wir haben festgestellt , diese weniger reproduzierbar als intravenöser Applikation. </li><li> Randomize infizierten Mäusen und Käfig in Gruppen von 3 in SPF-belüftete Käfige. Als Kontrolle injizieren CD1 weibliche Mäuse mit Wildtyp nicht Biolumineszenz - Parasiten, T. b. brucei GVR35 (n =3). </li><li> Überwachen Sie die Infektion durch Blut Film Mikroskopie <ol><li> Spot 5 ul Blut aus venepuncture oder Aderlässe auf einen Glasträger und führen Sie einen Blutabstrich (mit einem zweiten Glasträger vorsichtig die Tropfen Blut schieben über die Rutsche einen dünnen Film zu erzeugen). Lassen Sie Folien an der Luft trocknen. </li><li> Befestigen Sie den Blutabstrich mit 100% Methanol und Fleck mit Giemsa für 10 Minuten , bevor sie mit dH 2 O gespült und an der Luft trocknen lassen . Unter 100X Ziel zählen die Anzahl der Trypanosomen in 10 Bereichen (FOV). Hinweis: Blutdreharbeiten wird neben ganzen Tier nicht-invasive Bildgebung bereits einen Tag nach der Infektion durchgeführt. Wenn eine Anzahl von Tieren Verarbeitung dieses Verfahren der Trypanosomen Quantifizierung über Hämozytometer Zählen bevorzugt, da die Proben können später bei Raumtemperatur und gezählt gespeichert werden. </li></ol></li></ol> 3. Biolumineszenz Imaging-Infektion zu verfolgen Hinweis: Um die Infektion zu überwachen, ganze animal nichtinvasive Bildgebung verwendet werden. <ol><li> Vorbereitung einer Stammlösung von D-Luciferin, das Glühwürmchen-Luciferase-Substrat, in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) bei 30 mg / ml. Filter sterilisieren und in Aliquots bei -20 ° C einfrieren. Hinweis: D-Luciferin Licht empfindlich ist, daher schützen sie vor Licht von Aliquoten in Folie gewickelt wird. Nicht wiederholt Frost-Tau - Luciferin , wie es 11 - Aktivität beeinflussen können. </li><li> Wärmen eines Aliquots von D-Luciferin auf Raumtemperatur. Entfernen Sie jede Maus aus dem Käfig (einschließlich Kontrollmäuse infiziert mit nonbioluminescent Stamm Wildtyp-Parasiten) und injizieren 150 mg / kg des erwärmten D-Luciferin (verdünnt in DPBS) intraperitoneal mit einer 25 G-Nadel. Legen Sie die Mäuse in eine Isofluran Kammer für ca. 5 min zu induzieren Anästhesie mit 2% Isofluran / O 2 Mix bei 2,5 l / min. Hinweis: Die Mäuse werden unbeweglich, wenn sie unter Narkose sind. Für den Bildaufnehmer hier verwendet, 3 Mäuse können gleichzeitig verarbeitet werden. Wenn Mäuse sind anesthetized länger als 30 min, können ophthalmische künstliche Tränen Salbe angewendet werden, um die Augen der Mäuse verhindert das Austrocknen. </li><li> Verwendung der Software gemäß den Anweisungen des Herstellers für den Imager hier beschrieben, die Software öffnen und die Maschine zu initialisieren. Erwerben Sie Bilder einmal Kamera und beheizte Plattentemperatur erreicht haben. Hinweis: Dieses Gerät nicht in der Regel ausgeschaltet ist, so dass die Maschine über Nacht Hintergrund Kalibrierungen durchzuführen. Für den Fall, dass es neu gestartet werden muss, es muss eine Überprüfung der Kalibrierung laufen zuerst. </li><li> Legen Sie die narkotisierten Mäusen in den Imager (siehe 3.5). Verwenden Sie große schwarze Trennzeichen zwischen den Mäusen zu minimieren bluten durch jedes helle Biolumineszenz-Signal. Bild Mäuse eine Reihe von Belichtungszeiten; 1, 3, 10, 30, 60 und 180 Sekunden, mit mittlerer Binning, 1 f / stop und einem offenen Filter und Sichtfeld E (12,5 x 12,5 cm 2). Hinweis: Die Kontrollmäuse infiziert mit den Wildtyp-nonbioluminescent GVR35 Parasiten bieten eine background Biolumineszenz Wert. Aus einem Luciferin Kinetik Experiment (Abbildung 6) mit diesem Modell haben wir die Biolumineszenz Signalspitzen bei 10 Minuten nach der Verabreichung und Imaging dauert ca. 5 min für 3 Mäuse gefunden. Nehmen Sie diesen Zeitplan in Betracht, wenn anesthetizing und Abbilden der Mäuse. </li><li> Um sicherzustellen, gründliche Abbildung der Mäuse, drehen einen ventralen, dorsalen und Seitenansicht zu erhalten. Pflegen Sie die Konsistenz in der Reihenfolge der Orientierung für die Bildgebung zwischen aufeinanderfolgenden Tieren. </li><li> Nach der Bebilderung erlauben Mäuse aus der Narkose unter Beobachtung zu erholen, bevor zu SPF-Käfig zurück. </li><li> Weiter Mäuse Bildgebung alle 7 Tage bis zum Tag 21 nach der Infektion. Es sollte eine stetige Zunahme der Biolumineszenz-Signal über das gesamte Tier sein. </li><li> Bei D21, Bild und Blut Film die Mäuse wie oben beschrieben, und der Dosis-Mäuse mit 40 mg / kg Diminazen aceturat intraperitoneal. Dieses Medikament wird die periphere Parasitämie klar, aber das Blut-brai nicht überquerenn-Schranke und ermöglicht somit eine bessere Visualisierung der ZNS-Infektion. Hinweis: Diminazen aceturat ist ein gut etabliertes Medikament zur Frühstadium nagana behandeln. </li><li> Weiter Bildgebung und Überwachung bei D28 und D35. </li></ol> 4. Bestätigen ZNS-Infektion <ol><li> Bei D35, Bild Mäuse wie oben beschrieben (Schritte 3,1-3,4). </li><li> Nach der Bebilderung erlauben Mäuse aus der Narkose und exsanguinate Mäuse in so detailliert Schritt 1,6-1,8, das Sammeln zur weiteren Analyse Blut zu erholen. </li><li> Nach Herzpunktur, perfuse Mäuse, die mit 20 ml PBS (optional: add 3 mg / ml Luciferin zu Perfusionslösung) über das Herz das Blut aus den Organen zu löschen und Luciferin Etikett wieder einführen, die aus der Region des Gehirns über das Zeitintervall gelöscht haben könnte aus Schritt 4.1. </li><li> Vorsichtig in das Gehirn zu entfernen, die durch gekrümmte Schere, die um den Umfang des Schädels von der Basisschneiden und das Oberteil des Schädels Abhebens, das Gehirn zu ermöglichen,sanft herausgehoben mit einer gebogenen Pinzette werden. </li><li> Legen Sie das ausgeschnittene Gehirn auf einen Abschnitt aus schwarzem Kunststoff und Pipette 50 ul 15 mg / ml Luciferin über das Organ vor der Bildgebung, um sicherzustellen, ausreichende Luciferin hat ausgeschnittenen Gehirn hinzugefügt. Bild die Einstellungen wie oben. Dies wird die Lokalisierung der Infektion zu den Gehirnhälften demonstrieren. Hinweis: Downstream Quantifizierung von Parasitämie am exzidiert Gehirn kann durch qPCR , durchgeführt werden , wie zuvor 8 beschrieben. Andere alternative Downstream-Anwendungen könnte Histologie oder Immunhistochemie umfassen Parasiten im Hirngewebe folgenden Fixierung zu identifizieren. </li></ol> 5. Die Quantifizierung der Biolumineszenz-Bildgebung Hinweis: Die Biolumineszenz quantifiziert werden können, die Region von Interesse (ROI) mit der Bildverarbeitungssoftware und für die Hintergrund Biolumineszenz korrigiert. <ol><li> den ROI-Tool verwenden, erstellen Sie einen rechteckigen ROI für ganze Tier Quantifizierung einnd positionieren sie über die Maus Bild der Nasenspitze zur Basis des Schwanzes der Maus zu decken. Verwenden Sie die gleiche Größe Box für jedes Tier und jeden Zeitpunkt. Bei der Betrachtung der ROI für das Gehirn suchen, verwenden Sie einen kreisförmigen ROI in der gleichen Art und Weise, sie über die Maus Kopfbereich in die Bildposition. </li><li> Falls gewünscht, einstellen Bilder auf dem gleichen Spektrum für eine visuelle Darstellung der Infektion zu erscheinen. Hinweis: Die Software, die hier erzeugt eine Farbkarte für jedes Bild automatisch angepasst für minimale und maximale Photonenzählungen. Um einen visuellen Vergleich zwischen einer Reihe von Bildern zu ermöglichen, die Farbskala muss für alle Bilder auf die gleichen Werte eingestellt werden. <ol><li> Mit dem Bild mit der höchsten Biolumineszenz und der &quot;Bild anpassen&quot; Registerkarte auf der Werkzeugpalette, wählen Sie eine logarithmische Skala und eine entsprechende Farbskala Minimum und Maximum (empirisch ermittelt werden). Wenden Sie diese Skala auf alle Bilder während des gesamten Experiments. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Entwicklung eines biolumineszenten T. b. brucei GVR35 Stamm ermöglicht die Visualisierung eines Trypanosomeninfektion von den frühen bis späten Stadium. Zurück Infektionsmodellen konnten die späten Stadium zu erkennen, wenn Parasiten im Gehirn, in Echtzeit aus dem Blut Film Mikroskopie sind und erforderlich , um die Keulung und Beseitigung von Gehirnen von der infizierten Mäuse Parasitenlast 12 zu bestimmen. Die Biolumineszenz reduziert inter Maus Variabilität als eine einzige Maus kann über die ...

Humane afrikanische Trypanosomiasis (HAT) oder Schlafkrankheit wird durch die vektorübertragenen Protozoen-Parasiten des Trypanosoma brucei spp1 verursacht. Die geschätzte Zahl der aktuellen Fälle liegt bei weniger als 7.000 pro Jahr, wobei fast 70 Millionen Menschen auf dem afrikanischen Kontinent dem Risiko einer Parasiteninfektion ausgesetzt sind. Die Krankheit, die unbehandelt meist tödlich verläuft, umfasst ein frühes hämolymphhatisches Stadium, in dem Parasiten im Blut vorhanden sind, und ein Stadium, in dem Parasiten in das späte Stadium übergehen, in dem Parasiten in das Zentralnervensystem (ZNS) eindringen und nicht mehr anfällig für eine Behandlung mit trypanosomalen Arzneimitteln im Frühstadium sind2. Die derzeitigen medikamentösen Therapien für HAT im Spätstadium weisen sowohl komplexe, langwierige Behandlungsschemata und schwere Nebenwirkungen als auch berichtete Resistenzen auf, weshalb die Erforschung neuer medikamentöser Therapien unerlässlich ist3,4. 
Die Untersuchung der humanen afrikanischen Trypanosomiasis (HAT) im Spätstadium in traditionellen Mausmodellen ist langwierig und komplex, wobei die Entfernung von Hirngewebe erforderlich ist, um die parasitäre Belastung zu überwachen5. Als Studienmodell für Trypanosomiasis wird der tierische infektiöse Stamm T. b. brucei verwendet, wobei das Spätstadium 21 Tage nach der Infektion (dpi) auftritt. Um die nicht-biolumineszierende Parasiteninfektion des Wildtyps im Mausmodell zu überwachen, sind periphere Blutfilme oder quantitative PCR die einzigen Methoden, um die Parasitenlast zu bestimmen. Für die Parasitenbelastung im Gehirn muss die Maus gekeult, das Gehirn herausgeschnitten und eine qPCR am Gewebe durchgeführt werden, was es unmöglich macht, Parasiten über mehrere Zeitpunkte im Spätstadium der Infektion zu verfolgen. Dies führt dazu, dass Infektionen im Zentralnervensystem (ZNS) nicht in Echtzeit verfolgt werden können. 
In vivo Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) kann einen hochsensitiven, nicht-invasiven Nachweis der Parasitenverbreitung und des Krankheitsverlaufs in einem Mausmodell ermöglichen, der an einem einzigen Tier während des gesamten Experiments verfolgt werden kann6. BLI basiert auf der Emission von Licht im sichtbaren Spektrum, die durch eine Luciferase-katalysierte Reaktion erzeugt wird. Die emittierten Photonen werden dann von einer CCD-Kamera (Charge Coupled Device)7 detektiert. Zu diesem Zweck wird der Erreger genetisch so verändert, dass er ein Luciferase-Protein exprimiert, und das Substrat Luciferin wird zu interessierenden Zeitpunkten durch Injektion eingebracht. Der Hauptvorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, Längsschnittstudien durchzuführen, bei denen dasselbe Tier mehrmals mit minimalen Nebenwirkungen abgebildet werden kann. Das erfasste Biolumineszenzsignal kann quantifiziert werden und somit auf die Erregerlast hinweisen.
Die Optimierung und Validierung eines rotverschobenen biolumineszierenden T. b. brucei hat die Untersuchung der Infektion im Spätstadium durch nicht-invasive Verfahren ermöglicht, Parasiten früher als die Blutfilmmikroskopie erkannt und den Zeitaufwand, die Kosten und die Anzahl der Tiere, die für die Untersuchung der ZNS-Infektion und das Wirkstoffscreening bei Trypanosomiasis im Spätstadium benötigt werden, erheblich reduziert8,9. In diesem Protokoll zeigen wir die Infektion von Mäusen mit biolumineszierenden Trypanosomen und wie die Parasiten dann in vivo sichtbar gemacht werden können, um das Fortschreiten der Krankheit und die ZNS-Penetration zu quantifizieren.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Sigma, UK</td><td>P4417</td><td>Tabletten pH 7,4</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma, UK</td><td>G8270</td><td>99,5 % (molekular</td></tr>) <tr><td>Qualität Ammoniumchlorid</td><td>Sigma, UK</td><td>A9434</td><td>99,5 % (molekular</td></tr>) <tr><td>Qualität Heparin (Lithiumsalz)</td><td>Sigma, UK</td><td>H0878</td><td></td></tr><tr><td>Hi-FCS</td><td>Gibco, Life Technologies, UK</td><td>10500-064</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma, UK</td><td>D4031</td><td>Steril gefiltert</td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Nalgene, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Sigma, UK</td><td>G5637</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Perkin Elmer, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma, UK</td><td>115144-35-9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diminazenaceturat</td><td>Sigma, UK</td><td>D7770</td><td>Analytische Qualität</td></tr><tr><td>IVIS Lumina II</td><td>Perkin Elmer, UK</td><td></td><td>andere Bioimager erhältlich z.B. von Bruker, Kodak</td></tr><tr><td>Living Image v. 4.2</td><td>Perkin Elmer, UK</td><td></td><td>proprietäre Software für Perkin Elmer IVIS-Instrumente; andere Instrumente können ihre eigene</td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>Fisher Scientific, UK</td><td>10142104</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Spritze</td><td>Fisher Scientific, UK</td><td>10743785</td><td></td></tr><tr><td>25 g Nadeln</td> <td>habenGreiner Bio-one</td><td>N2516</td><td></td></tr><tr><td>21 G Nadeln</td><td>Greiner Bio-one</td><td>N2138</td><td></td></tr><tr><td>Twin-frosted Objektträger</td><td>VWR, UK</td><td>631-0117</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>StarLab, UK</td><td>I1415-1000</td><td></td></tr><tr><td>7 ml Bijou Röhrchen</td><td>StarLab, UK</td><td>E1412-0710</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Restrainer</td><td>Sigma, UK</td><td>Z756903</td><td>Unser Rückhaltesystem wurde im eigenen Haus hergestellt, dies ist ein ähnliches Modell</td></tr></tbody></table>

biolumineszenz-bildgebung zur erkennung von late stage-infektion der afrikanischen trypanosomiasis

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Humane afrikanische Trypanosomiasis (HAT) ist eine mehrstufige Krankheit, die sich in zwei Stadien manifestiert: ein frühes Blutstadium und ein spätes Stadium, in dem der Parasit in das zentrale Nervensystem (ZNS) eindringt. In-vivo-Studien im Spätstadium waren bisher begrenzt, da traditionelle Methoden die Entfernung des Gehirns erfordern, um das Vorhandensein der Parasiten zu bestimmen.
Biolumineszenz-Bildgebung ist eine nicht-invasive, hochempfindliche Form der optischen Bildgebung, die die Visualisierung eines Luciferase-transfizierten Erregers in Echtzeit ermöglicht. Durch die Verwendung eines transfizierten Trypanosomenstammes, der in der Lage ist, bei Mäusen eine Krankheit im Spätstadium hervorzurufen, sind wir in der Lage, die Kinetik einer ZNS-Infektion bei einem einzelnen Tier im Verlauf der Infektion zu untersuchen sowie die Bewegung und Ausbreitung einer systemischen Infektion zu beobachten.
Hier beschreiben wir ein robustes Protokoll zur Untersuchung von ZNS-Infektionen unter Verwendung eines Biolumineszenzmodells der afrikanischen Trypanosomiasis, das nicht-invasive Beobachtungen in Echtzeit liefert, die mit optionalen Downstream-Ansätzen weiter analysiert werden können.

Dieses Protokoll zeigt , wie Krankheitsprogression nach einer Infektion von Mäusen mit T. folgen b. brucei, ein Modell für die afrikanische Trypanosomiasis. 1 , die die Zeitleiste des Versuchsprotokoll zeigt, den Zeitplan für die Behandlung und Imaging - Schritte zeigt, Fig . 2 eine typische Sichtfeld in einer festen Giemsa-gefärbten Blutausstrich zeigt , verwendet periphere Parasitämie quantitativ zu bestimmen, mit Try...

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung eines biolumineszierenden Stammes afrikanischer Trypanosomen, um die Verfolgung von Infektionen im Spätstadium zu ermöglichen, und zeigt, wie in vivo Live-Bildgebung verwendet werden kann, um Infektionen im zentralen Nervensystem in Echtzeit zu visualisieren.

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, mit Hilfe der in-vivo-Echtzeit-Bildgebung eine Trypanosomen-Infektion in Echtzeit zu verfolgen und die frühen Blutstadien bis hin zu den späten Hirninfektionsstadien in der Maus sichtbar zu machen, wodurch der klinische Verlauf der Schlafkrankheit nachempfunden wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Trypanosomenbiologie zu beantworten, potenziell neue therapeutische Behandlungen zu identifizieren und deren Wirksamkeit gegen die Infektion zu bewerten. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass die Arzneimittelbewertung innerhalb von 90 Tagen abgeschlossen werden kann, im Gegensatz zu den 180 Tagen, die für das bisherige Modell erforderlich waren.Dieses Protokoll kann Einblicke in die afrikanische Trypanosomiasis des Menschen liefern, ist jedoch auch auf andere Modelle von Infektionskrankheiten wie Tuberkulose oder die Chagas-Krankheit anwendbar. Beginnen Sie damit, weibliche CD1-Mäuse mit einem Gewicht von 21 bis 25 Gramm in eine Wärmekammer zu stellen, um die Schwanzvenen zu weiten. Anschließend werden die erwärmten Mäuse einzeln in eine Kunststoff-Haltevorrichtung platziert und mit einer 25-Gauge-Nadel 0,2 Milliliter verdünntes Inokulum des Trypanosoma brucei GVR35VSL2 intravenös in die Schwanzvene injiziert, wobei unmittelbar nach der Injektion Druck auf die Einstichstelle ausgeübt wird, um die Blutung zu stoppen.Um die Infektion mittels Dünndarmmikroskopie zu überwachen, geben Sie fünf Mikroliter Blut auf einen Objektträger. Verwenden Sie einen zweiten Objektträger, um den Tropfen vorsichtig über den ersten Objektträger zu verteilen, sodass ein dünner Film entsteht. Lassen Sie die Objektträger an der Luft trocknen und fixieren Sie das Blut anschließend in 100 % Methanol, gefolgt von 10 Minuten in Giemsa.Am Ende der Inkubation spülen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser ab und lassen Sie an der Luft trocknen. Zählen Sie dann die Anzahl der Trypanosomen in 10 Blickfeldern unter einem 100x-Objektiv. Um die Infektion mittels biolumineszenzbasierter Bildgebung zu verfolgen, erwärmen Sie eine Aliquot aus D-Luciferin auf Raumtemperatur.Verabreichen Sie anschließend pro Tier 150 Milligramm pro Kilogramm des erwärmten Luciferins intraperitoneal mit einer 25-Gauge-Nadel. Danach starten Sie das Gerät mithilfe der Imager-Software gemäß den Herstelleranweisungen. Sobald die Kamera und die Heizplatte die geeigneten Temperaturen erreicht haben, platzieren Sie große schwarze Trennwände zwischen den anästhesierten Tieren, um eine Übersprechung hellem biolumineszentem Signal zu minimieren.Bilden Sie die Mäuse mit einer Reihe von Belichtungszeiten, mittlerer Binning-Stufe, einer Blende und offenem Filter sowie einem Gesichtsfeld E von 12,5 mal 12,5 Zentimetern ab. Um eine vollständige Bildgebung der Mäuse sicherzustellen, drehen Sie die Tiere, um ventrale, dorsale und laterale Ansichten zu erhalten. Bilden Sie die Mäuse am Tag 21 ab und erstellen Sie Blutausstriche, wie gezeigt.Dann verabreichen Sie den Tieren 40 Milligramm pro Kilogramm Diminazinaceturat intraperitoneal, um die periphere Parasitämie zu beseitigen. Nach der Bildgebung der Tiere am Tag 35 legen Sie die entnommenen Gehirne auf einen schwarzen Kunststoffträger und pipettieren 50 Mikroliter einer 15 Milligramm pro Milliliter-Luciferin-Lösung über das Gewebe. Anschließend wird das Gehirn mit denselben Einstellungen wie bei der Ganzkörperbildgebung abgebildet.Um den Grad der Biolumineszenz in bestimmten interessierenden Bereichen (ROIs) zu quantifizieren, wählen Sie das ROI-Werkzeug in der Bildgebungssoftware aus und erstellen Sie ein rechteckiges ROI zur Quantifizierung des gesamten Tieres. Positionieren Sie das ROI über das Mausbild von der Nasenspitze bis zur Schwanzwurzel und messen Sie unter Verwendung einer Box gleicher Größe für jedes Tier und jeden Zeitpunkt den Gesamtfluss. Um das ROI des Gehirns allein auszuwerten, erstellen Sie ein kreisförmiges ROI und platzieren Sie es über den Kopfbereich des Tieres.Wiederholen Sie dies für jedes Tier und messen Sie den Gesamtfluss. Verwenden Sie dann das Bild mit der höchsten Biolumineszenz und die Registerkarte „Bild anpassen“ in der Werkzeugpalette, um eine logarithmische Skala sowie ein geeignetes Farbskalen-Minimum und -Maximum für das Bild auszuwählen, und wenden Sie diese Skala auf alle Bilder innerhalb des Experiments an. Die Infektionsentwicklung kann in vivo durch sequenzielle Messungen der Biolumineszenz verfolgt werden, um den Infektionsgrad der Tiere im Verlauf eines Experiments zu bestimmen.Während die Infektion fortschreitet, kann bei allen Tieren über die ersten 21 Tage hinweg eine Zunahme der Biolumineszenz beobachtet werden, da das Signal stärker verbreitet und intensiver wird, wobei die höchsten Bereiche der Biolumineszenz im Bereich der Milz sichtbar sind. Am Tag 21 werden die Mäuse nach der Bildgebung, wie gerade gezeigt, mit Diminazinaceturat behandelt, was dazu führt, dass bis zum Tag 28 nur noch geringe Biolumineszenzniveaus im Gehirn vorhanden sind, da die periphere Infektion beseitigt wird. Am Tag 35 ist das Signal nicht nur im Kopfbereich weiterhin vorhanden, sondern hat auch an Intensität zugenommen, was auf eine mögliche Gehirninfektion hindeutet.Die Quantifizierung sowohl der peripheren Parasitämie als auch der Biolumineszenz ermöglicht die Beurteilung der Krankheitskinetik. Beispielsweise wurde in diesem Experiment am Tag 7 ein starkes Biolumineszenzsignal von 1 × 10⁸ Photonen pro Sekunde beobachtet, während die festgestellte Parasitämie in den am selben Tag angefertigten Blutausstrichen sehr niedrig war. Am Tag 28 war die Parasitämie in den Blutausstrichen aufgrund der am Tag 21 verabreichten Diminazenaceturat-Behandlung nicht mehr nachweisbar, während die Biolumineszenz bis zum Tag 35 über den Hintergrundwerten verblieb, was der in der Kopfregion beobachteten Biolumineszenz entspricht und die höhere Empfindlichkeit der Biolumineszenzanalyse im Vergleich zur Blutausstrichuntersuchung bestätigt.Die biolumineszenzgestützte Bildgebung des Gehirns selbst zeigt Unterschiede in der Infektionslast zwischen den Tieren, wobei diese nicht auf bestimmte anatomische Regionen des Gewebes beschränkt zu sein scheint. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, einen geeigneten Bereich von Belichtungszeiten zu wählen, um qualitativ hochwertige Bildgebungsdaten sicherzustellen, da beispielsweise eine Überbelichtung wichtige Lokalisierungsdetails negativ beeinflusst. Nach Abschluss dieses Verfahrens können weitere nachgeschaltete Methoden wie die quantitative PCR und die Immunhistochemie angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen bezüglich der Parasitenlast und der Parasitenlokalisation im Gehirn zu beantworten.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Trypanosomenbiologie den Weg, um innerhalb von 90 Tagen nach der Infektion eine Arzneimittelbewertung durchzuführen, da die Empfindlichkeit der Rezidivdetektion verbessert wurde. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Biolumineszenzbildgebung der TB brucei-Infektion genutzt werden kann, um den Krankheitsverlauf vom Blut bis zur Spätphase der Gehirninfektion zu verfolgen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In-vivo-Imaging von transgenen Leishmania Parasiten in einer Live-Host

Dieser Artikel beschreibt die Verwaltung...

Bioluminescent Bakterielle Imaging<em&gt; In Vivo</em

Mit Hilfe Luciferase und in vivo bildgebende Systeme (IVIS) als neuartiges Mittel gegen Krankheiten Endpunkte zu identifizieren, bevor klinische Entwicklungen auftreten. IVIS hat uns erlaubt, in Echtzeit visualisiert die Invasion der encephalitische Viren über mehrere Tage, eine genauere Krankheit Modell für zukünftige Studie. Es hat uns auch die Möglichkeit, die potenziellen Schutzfunktionen von Virostatika und Impfstoffen schneller als derzeit genutzt Tiermodellen zu identifizieren. Die...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Nachweis eines Neuro-Invasive encephalitische Virus

Quelle: de Vries, C. R., et al., Ein verzögertes Impfungsmodell der chronischen Wundinfektion von Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert eine biolumineszente Bildgebungstechnik zur Überwachung des Verlaufs bakterieller Infektionen in einem lebenden Mausmodell. Pathogene Bakterien, die mit dem luxABCDE-Reportersystem konstruiert wurden, senden Licht an der Infektionsstelle aus, was die Visualisierung metabolisch aktiver Bakterien ermöglicht. Durch die Abbildung...

Biolumineszenzbildgebung bakterieller Infektionen bei Mäusen

Die Glykosomendynamik in afrikanischen Trypanosomen ist mit traditionellen zellbiologischen Techniken wie Elektronen- und Fluoreszenzmikroskopie schwer zu untersuchen.  Um das Verhalten dynamischer Organellen zu beobachten, wurde ein Fluoreszenz-Organellen-Reportersystem in Verbindung mit der Durchflusszytometrie verwendet, um die Echtzeit-Glykosomendynamik in lebenden Parasiten zu überwachen.

Mit fluoreszierenden Proteinen zu Glycosome Dynamics in der afrikanischen Trypanosomen auf Monitor

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines tumortragenden Mausmodells zur Überwachung der Tumorprogression und Angiogenese in Echtzeit durch duale Biolumineszenz-Bildgebung.

Dual Biolumineszenz-Bildgebung der Tumorprogression und Angiogenese

Das hier bereitgestellte Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte zur Durchführung von Arzneimittelwirksamkeitsstudien in einem biolumineszierenden Modell der Trypanosoma cruzi-Infektion , wobei der Schwerpunkt auf der Datenerfassung, -analyse und -interpretation liegt. Fehlerbehebungs- und Qualitätskontrollverfahren zur Minimierung technischer Probleme werden ebenfalls bereitgestellt.

Entmystifizierung der In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung eines Mausmodells für die Chagas-Krankheit für Wirksamkeitsstudien von Arzneimitteln

In dieser Arbeit präsentieren wir eine longitudinale Auswertung von Goldhamstern, die intraperitoneal (IP) oder intragingival (IG) mit L. infantum-Luc infiziert wurden, mittels biolumineszierender Bildgebung und mittels PCR. Hamster wurden 1 Tag nach der Infektion (1 dpi), 1 Woche nach der Infektion (8 dpi) und 3 Wochen nach der Infektion (22 dpi) untersucht und bei der 50. dpi und 8 Monate nach der Infektion euthanasiert.

Im lebenden Organismus Bildgebung von mit Leishmania infantum infizierten Hamstern durch gingivale Inokulation von axenischen Amastigoten, die Luciferase exprimieren

Anti-retrovirale Therapie von HIV / Aids zu behandeln, ist in Südafrika in großem Umfang überwacht. Die Durchflusszytometrie ist für Hämatologie (CD45), Immunologie (CD4) und Viruslast verbunden CD38-Assay kombiniert. Aufgenommen in den NHL-SA Labors, Johannesburg, sind diese modernen Methoden kostengünstig mit erhöhten lokalen internen Qualitätskontrolle, die als Vorbilder für die begrenzten Ressourcen Diagnostik.

Umfassende &amp; Kostengünstig Laboratory Überwachung von HIV / AIDS: eine afrikanische Role Model

NADPH-Oxidase ist die wichtigste Quelle von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Phagozyten. Aufgrund der Kurzlebigkeit von ROS, ist es schwierig zu messen und zu überwachen ROS Ebenen in lebenden Tieren. Ein minimal invasives Verfahren zur seriellen Quantifizierung von ROS in lebenden Mäusen beschrieben.

Biolumineszenz Imaging von NADPH-Oxidase-Aktivität in verschiedenen Tiermodellen

Lernen Sie die Biolumineszenz-Bildgebung zur Verfolgung von Trypanosoma brucei-Infektionen im ZNS von Mäusen. Diese Methode verkürzt die Arzneimittelbewertung von 180 auf 90 Tage und ermöglicht Echtzeit-Visualisierung.

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

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