Name: Das Ex Vivo Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Lernen Sie die Ex-vivo-Kultur und Stimulation von Maus-Darm-Organoiden mit PAMPs und Listeria monocytogenes. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genexpression und Immunantworten im Darm.

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Die Autoren danken Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel und Bettina Heid für die technischen Diskussionen. Die Autoren danken Dr. Nanda Nanthakumar für die Bereitstellung der Caco-2-Zellen. Die Autoren danken auch dem Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) an der Virginia Tech. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (an I.C.A.) unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die Kultur und die Wartung der intestinalen Organoide ist eine Prozedur, die von jedem einzelnen mit ausreichender Gewebekultur Technik beherrscht werden kann. Es gibt Feinheiten in Passagierung im Vergleich zu Zellen in einer konventionelleren Monoschicht wachsen, aber diese Feinheiten sind nicht schwierig zu überwinden. Die kritischen Schritte dieses Verfahrens beinhalten die Organoide auf eine ausreichend hohe Dichte für optimale seeding wachsen zu können. Die Versuche müssen nach unten mit Organoiden skaliert werden...

Die Fähigkeit , zu ernten und Kultur primären Organoide wurden Dünndarm, Dickdarm, Bauchspeicheldrüse, Leber und Gehirn und sind spannende Fortschritte germane zum Verständnis eines physiologisch repräsentativen Phänomene für Gewebe biology 1-5 ​​beschrieben. Die ersten Methoden , um die Kultur und die Wartung von kleinen Darm-Organoiden beschreiben wurde von Sato et al. Aus dem Labor von Hans Clevers 1. Vor dieser Methode, die Ernte und Kultur der primären intestinalen Epithelzellen nachgewiesen begrenzt und ineffektiv bei der Aufrechterhaltung epithelialen Zellwachstums werden. Verfahren enthalten Dissoziation des Gewebes durch Inkubation mit Enzymen wie Kollagenase und Dispase, die letztlich zum Auswachsen von vermischte primären Fibroblastenzellen 6 führen würde. Diese Bedingungen würden auch die epithelialen Zellkultur bei der Aufrechterhaltung Zeit eingeschränkt werden. Minimale bis keine Epithelzelle Nische bilden würde, wie die Epithelzellen Apoptose eintreten würde aufgrunddas Fehlen von geeigneten Wachstumsfaktoren oder Kontaktverlust Integrität, bezeichnet anokis 7. Das Aufkommen der 3D-organoiden Kultursystem hat ein Verfahren zur Kultur primären Darmzellen bereitgestellt 1 ein Spektrum von Darmzelltypen in Kultur anhalt enthält. Diese epithelialen Organoide haben Vorteile gegenüber Zelllinien ist , dass sie aus mehreren differenzierten Zellen zusammengesetzt sind, und imitieren besser das Organ sie in vivo 8 abgeleitet sind. Der Prozess, um schließlich &quot;wachsen, um ein Mini-Darm in einer Schale&quot; ein wertvolles Instrument für die Bewertung der Reaktion von Darmepithel unter verschiedenen Stimuli bewährt hat. Die Untersuchung der Interaktion von primären Darmzellen mit mikrobiellen Pathogen associated molecular patterns (PAMPs) ist auf dem Gebiet der Immunologie relevant , da diese molekularen Muster 9 unterschiedlichen Antworten von sowohl Wirt und Mikrobe regulieren kann. Nicht nur können die Ermittler untersuchen nun diese Interaktionen mit der Maus Organoiden, aber siekann von Menschen als auch 2 kultiviert werden. Diese Technologie hat das Potenzial, dramatisch personalisierte Medizin zu verändern und es ist verlockend, um Fortschritte zu spekulieren, dass diese Technik in naher Zukunft möglich machen wird. Das Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Protokoll für die Kultur, Expansion und Behandlung von Darm Organoide mit einer Vielzahl von Stimuli bereitzustellen. Solche Reize schließlich kann von Impfstoffen, bakterielle PAMPs reichen, Live-Erreger, gastrointestinale (GI) und Krebstherapeutika. Die Isolierung und Kultur von Maus - Darm-Organoiden wurde von Sato et al angepasst. Zwar gibt es geringfügige Abweichungen von der ursprünglichen Methode der Produktkultur sein Ende organoiden wird noch erreicht , wenn dieses Protokoll folgen. Dieses Verfahren wird auf die Beschreibung eine ausreichende Technik zum korrekten Normalisierung fokussiert, wenn sie mit nicht homogenen Zellstrukturen arbeitet, die berücksichtigt werden müssen, wenn ein Assay basierend auf Zelle n leitendenUmber.

<table><tbody><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050</td> <td>(Abschnitt 1,3,6) Oder gleichwertige Marke</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td><td>Thermo</td><td></td> <td>(Abschnitt 1,3)</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare</td><td>Sh30243.01</td> <td>(Abschnitt 1,6) Für Caco-2 und HEK293 Rspondin1-Zellen</td></tr><tr><td>HEK293T-Rspondin1 sekretierende Zelllinie</td><td></td><td></td><td>(Abschnitt 1) Beschrieben und modifiziert von Kim, K.A. et al. Lentivirale Partikel enthielten RSPO1(NM_138683)-ORF-cDNA, die in ein pReceiver-Lv105-Rückgrat kloniert wurde, das speziell bei GeneCopoeia bestellt und gekauft wurde.</td></tr><tr><td>50 ml konisches Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352070</td> <td>(Abschnitt 1) Oder gleichwertige Marke</td></tr><tr><td>T-175 Flask</td><td>Corning</td><td>431079</td> <td>(Abschnitt 1) Oder gleichwertige Marke&nbsp;</td></tr><tr><td>Protein Matrix</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>(Abschnitt 2,3,4,5,6) Matrigel Wachstumsfaktor reduziert &nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's (DPBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30264.01</td><td>(Abschnitt 2,3)</td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td> <td>(Abschnitt 2,3) Fortschrittliches DMEM/F12</td></tr><tr><td>Corning 24-Well-TC-Platten</td><td>Corning</td><td>3524</td> <td>(Abschnitt 2)</td></tr> <tr><td>N2 Ergänzung 100x&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>(Abschnitt 2)</td></tr><tr><td>B27 ohne Vitamin A 50x&nbsp;</td><td>Lebenstechnologien</td><td>12587-010&nbsp;</td><td>(Abschnitt 2)</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td> <td>(Abschnitt 2)</td></tr> <tr><td>Glutamin-Ergänzung (Glutamax)</td> <td>Life Technologies</td><td>35050-061</td> <td>(Abschnitt 2) Kann mit Advanced DMEM / F12</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td> kombiniert werden <td>Life Technologies</td><td>15630-080</td> <td>(Abschnitt 2) Kann mit Advanced DMEM / F12 kombiniert werden.</td></tr><tr><td>10 ml serologische Pipette</td><td>Falcon</td><td>357551</td> <td>(Abschnitt 2) oder gleichwertige Marke</td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td> <td>(Abschnitt 2) Bestand = 100 mg/ml</td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-Cystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td> <td>(Abschnitt 2) Bestand = 1 M</td></tr><tr><td>rekombinante Maus EGF</td><td>Biolegend</td><td>585608</td> <td>(Abschnitt 2) Bestand = 500 mg/ml</td></tr><tr><td>Rocker Variable</td><td>Bioexpres</td><td></td><td>(Abschnitt 3)</td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td></td><td></td><td>(Abschnitt 3)</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td>(Abschnitt 3)</td></tr><tr><td>Glasobjektträger</td><td></td><td></td>(<td>Abschnitt 3)</td></tr><tr><td>Präparierpinzette</td><td></td><td></td><td>(Abschnitt 3)</td></tr><tr><td>25 ml Serologische Pipette</td><td>Falke</td><td></td><td>(Abschnitt 3)</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9821</td> <td>(Abschnitt 3) 0,5 M oder alternativ EDTA</td></tr><tr><td>sterile Petrischale in TC-Qualität 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td> <td>(Abschnitt 3) Oder TC-Schale in gleicher Größe</td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td> <td>(Abschnitt 4)</td></tr> <tr><td>Präzisions-Gleitnadel</td><td>Becton Dickinson</td><td>305120</td> <td>(Abschnitt 4) 23G x 1 1/4 (0,6 mm x 30 mm)</td></tr><tr><td>Flagellin aus Bacillus subtilis</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-bsfla&nbsp;</td><td>(Abschnitt 5,6)</td></tr><tr><td>Listeria monocytogenes</td><td>ATCC</td><td>19115</td><td>(Abschnitt 5,6)&nbsp;( Murray&nbsp; et&nbsp;al.)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td> <td>(Abschnitt 5,6) Oder gleichwertige Marke</td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>211065</td> <td>(Abschnitt 5)</td></tr> <tr><td>Bacto Brain Heart Infusion</td><td>Becton Dickinson</td><td>237500</td> <td>(Abschnitt 5)</td></tr> <tr><td>Caco-2</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td> <td>(Abschnitt 6)</td></tr> <tr><td>Trypsin&nbsp;</td><td>gibco</td><td>25200056</td> <td>(Abschnitt 6)</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td> <td>(Abschnitt 6)</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td></td> <td>(Abschnitt 6)</td></tr><tr><td>96 Well Assay Plate</td><td>Corning</td><td>3603</td> <td>(Abschnitt 6) Schwarze Platte, klarer Boden TC-behandelt</td></tr><tr><td>Nukleare Färbung Farbstoff</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td> <td>(Abschnitt 6) Hoechst 33342</td></tr><tr><td>T-75 Kolben</td><td>Corning</td><td>430641</td> <td>(Abschnitt 6) Oder</td></tr><tr><td>konisches 15-ml-Röhrchen</td> der gleichwertigen Marke <td>Falcon</td><td>352096</td> <td>(Abschnitt 1,3) Oder</td></tr><tr><td>1,7-ml-Polypropylen-Röhrchen</td> der gleichwertigen Marke <td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td>oder gleichwertige Marke</td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td>oder gleichwertige Marke</td></tr><tr><td>TNF-alpha</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00443260_g1</td><td>Taqman Genexpressions-Assay-Kit</td></tr><tr><td>IL-6&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td> <td>(Mm 00446190_m1</td><td>Taqman Genexpressions-Assay-Kit</td></tr><tr><td>IL-1beta</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00434228_m1</td><td>Taqman Genexpressions-Assay-Kit</td></tr><tr><td>IL-18</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00434225_m1</td><td>Taqman Genexpressions-Assay-Kit</td></tr><tr><td>18s</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs 99999901_s1</td><td>Taqman Genexpressions-Assay-Kit</td></tr><tr><td>7500 Schnelles Echtzeit-PCR-System</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nexus Gradient Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Schnelle optische 96-Well-Reaktionsplatte, 0,1 mL</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td></td><td></td>4346907</tr><tr><td>Rekombinante Maus R-Spondin 1 Protein</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>500 ng/ml</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7559</td><td></td></tr></tbody></table>

das<em&gt; ex vivo</em&gt; kultur und mustererkennung rezeptor-stimulation von maus-darm-organoide

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primäre Darm-Organoiden sind ein wertvolles Modell-System, das das Potenzial hat, deutlich auf dem Gebiet der Immunologie Schleimhaut auswirken. Allerdings führen die Komplexität der organoiden Wachstumseigenschaften erhebliche Einschränkungen für die Ermittler. Insbesondere sind die Wachstumsmuster der einzelnen organoiden sehr variabel und eine heterogene Population von Epithelzellen in Kultur zu schaffen. Mit einer solchen Einschränkungen können gemeinsame Gewebekulturpraktiken nicht einfach auf den organoiden System angewendet werden, aufgrund der Komplexität der Zellstruktur. Zählen und Plattieren basiert ausschließlich auf Zellzahl, die einzeln getrennten Zellen, wie beispielsweise Zelllinien gemeinsam ist, ist kein zuverlässiges Verfahren zur Organoide wenn nicht ein Normalisierungsverfahren angewendet wird. Normalisieren auf den Gesamtproteingehalt ist komplex aufgrund der Bewohner Proteinmatrix hergestellt. Diese Eigenschaften in Bezug auf die Zellzahl, Form und Zelltyp sollte in Betracht gezogen werden, wenn sekretiertes con AuswertungZelte aus der organoiden Masse. Dieses Protokoll wurde generiert ein einfaches Verfahren zur Kultur zu skizzieren und Dünndarm-Organoide mit mikrobiellen Krankheitserregern und pathogen associated molecular patterns (PAMPs) zu behandeln. Er betont auch die Normalisierungstechniken, die angewendet werden soll, wenn die Proteinanalyse nach einer solchen Herausforderung durchgeführt werden.

Wenn dieses Protokoll nach einer Darm Organoiden zu pflegen, charakteristische Kugel geformt Organoiden wird nach der Ernte vorhanden sein. Die Zugabe von R-spondin1 konditionierten Medien täglich wird das Wachstum und die Knospung der Organoide initiieren. Das Wachstum von Organoiden ist in 1A gezeigt - F, und ist repräsentativ für intestinale Organoide an den Tagen 1, 2, 4, 5, 6 und Tag 14. 1F inhomogenen Wachstumseige...

Hier wird ein Protokoll zu ernten, zu pflegen und zu behandeln Maus kleine Darm-Organoide mit pathogen associated molecular patterns (PAMPs) und Listeria monocytogenes beschrieben, sowie Betonung auf die Genexpression und die richtige Normalisierungstechniken für Protein.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Auswirkungen einer pathogenen Herausforderung auf Organoiden des Dünndarms zu messen, wobei der Schwerpunkt auf Normalisierungstechniken bezüglich der Gesamtzellzahl liegt. Diese Methode könnte helfen, zentrale Fragen in den Bereichen der angeborenen sowie der Schleimhautimmunologie zu beantworten, indem sie eine Möglichkeit bietet, Wirt-Pathogen-Interaktionen von Bakterien mit intestinalen Epithelzellen in vitro zu untersuchen. Unverzichtbar für dieses Verfahren ist die Methode zur Normalisierung gegenüber der Gesamtzellzahl, die notwendig ist, wenn organoidensekretierte Proteine mittels Techniken wie der ELISA gemessen werden. Um murine Dünndarmkrypten für die Organoidenkultur zu gewinnen, beginnen Sie damit, mit einem sterilen Objektträger vorsichtig die Zotten von der luminalen Oberfläche des Dünndarms abzukratzen. Schneiden Sie das Gewebe anschließend mit einer Präzisionsschere in Streifen von 1–2 Zentimeter Länge und geben Sie diese in einen 50-Milliliter-Konischkolben, der 10 Milliliter eiskaltes PBS enthält. Mischen Sie den Inhalt durch vorsichtiges Umstülpen und lassen Sie das Gewebe einige Minuten lang auf den Bo

the-ex-vivo-culture-pattern-recognition-receptor-stimulation-mouse

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Eine einfache Methode zur primären murinen Kolontumor organoide etablieren beschrieben. Dieses Verfahren nutzt die Eigenschaft, dass Kolontumorzellen überleben und wachsen in Organoiden in Medien, die begrenzte Wachstumsfaktoren, während normale Kolonepithelzellen nicht tun.

In-vitro-Kultur von Organoide Primäre Maus Kolontumoren

Verbesserte Bildgebungstechnologie ermöglicht die dreidimensionale Bildgebung von Organen während der Entwicklung. Hier beschreiben wir ein ganzes Organkultursystem, das eine Live-Bildgebung der sich entwickelnden Zotten im fötalen Mausdarm ermöglicht.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur Ex-vivo- Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Dünndarm Krypta Organoiden kultiviert ex vivo eine Gewebekultursystem, das Wachstum der Krypten abhängig Stammzellen und ihrer Nische rekapituliert. Wir haben eine Methode, um das metabolische Profil in Echtzeit in der primären Maus Krypta Organoiden testen. Wir fanden Organoiden aufrechtzuerhalten physiologischen Eigenschaften von ihrer Quelle definiert.

Echtzeit-Analyse von Stoffwechselprofil in Ex Vivo Maus Intestinale Crypt Organoide Kulturen

In diesem Videoprotokoll erklären wir Schritt für Schritt die lentivirale Transduktion in Organoiden des primären Darmepithels und die Verarbeitung und nachgelagerte Analyse dieser Kulturen mittels quantitativer RT-PCR, RNA-Microarray und Immunhistochemie.

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Die ex vivo Organkultur ermöglicht die Untersuchung biologischer Prozesse im Kontext der intakten Gewebearchitektur. Hier stellen wir eine Methode der ex vivo-Kultur des Dickdarms der Maus vor, die zur Untersuchung der angeborenen Immunität und der antimikrobiellen Wirtsabwehr im Darm verwendet werden kann.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organ Culture und seine Verwendung in Antimicrobial-Host Defense Studies

Dieses Protokoll bietet detaillierte Anweisungen zur Etablierung von murinen Dünndarmorganoiden, zur Isolierung angeborener Lymphzellen des Typs 1 aus der murinen Dünndarmlamina propria und zur Etablierung von 3-dimensionalen (3D) Kokulturen zwischen beiden Zelltypen, um bidirektionale Wechselwirkungen zwischen Darmepithelzellen und angeborenen lymphatischen Typ-1-Zellen zu untersuchen.

Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Etablierung eines murinen Kolonorganoidsystems zur Untersuchung der Aktivität und Funktion von Kolonstammzellen in einem Claudin-7-Knockout-Modell.

Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung von murinen Dünndarmkrypten und kultivieren intestinale 3D-Organoide aus den Krypten. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Generierung von Organoiden aus einer einzelnen intestinalen Stammzelle in Abwesenheit einer subepithelialen zellulären Nische.

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

Die Studie präsentiert eine Methode zur in-vitro-Untersuchung bakterieller Infektionen unter Verwendung von Gewebestammzell-abgeleiteten Intestinalorganoiden. Das Protokoll beschreibt, wie man Organoide in zwei Dimensionen kultiviert und differenziert, sie mit adhärent-invasiven Escherichia coli infiziert und wichtige Werte bewertet, darunter das Durchbrechen der Epithelbarriere, die Bildgebung der Infektion und die Antwort der epithelialen RNA.

Eine zweidimensionale Organoidkultur auf Invasin- oder Basementmembranextrakt zur Untersuchung von Wirts-Bakterien-Interaktionen

Wir beschreiben konfokale Bildgebungs- und Tracking-Pipelines, die auf zwei Reporterstrategien angewandt werden: Mosaikorganoide zur Auflösung einzelner Zellverhalten und Schicksalsreporter-Organoide zur Überwachung von Zelltypübergängen in menschlichen und murinen Darmorganoiden.

Live-Zell-Bildgebung und Einzelzell-Tracking zur Überwachung der klonalen Dynamik und Schicksalsübergänge in menschlichen und murinen Darmorganoiden

Lernen Sie die Ex-vivo-Kultur und Stimulation von Maus-Darm-Organoiden mit PAMPs und Listeria monocytogenes. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genexpression und Immunantworten im Darm.

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