Das
18. Mai 2016
Hier wird ein Protokoll zu ernten, zu pflegen und zu behandeln Maus kleine Darm-Organoide mit pathogen associated molecular patterns (PAMPs) und Listeria monocytogenes beschrieben, sowie Betonung auf die Genexpression und die richtige Normalisierungstechniken für Protein.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Auswirkungen einer pathogenen Herausforderung auf Organoiden des Dünndarms zu messen, wobei der Schwerpunkt auf Normalisierungstechniken bezüglich der Gesamtzellzahl liegt. Diese Methode könnte helfen, zentrale Fragen in den Bereichen der angeborenen sowie der Schleimhautimmunologie zu beantworten, indem sie eine Möglichkeit bietet, Wirt-Pathogen-Interaktionen von Bakterien mit intestinalen Epithelzellen in vitro zu untersuchen. Unverzichtbar für dieses Verfahren ist die Methode zur Normalisierung gegenüber der Gesamtzellzahl, die notwendig ist, wenn organoidensekretierte Proteine mittels Techniken wie der ELISA gemessen werden. Um murine Dünndarmkrypten für die Organoidenkultur zu gewinnen, beginnen Sie damit, mit einem sterilen Objektträger vorsichtig die Zotten von der luminalen Oberfläche des Dünndarms abzukratzen. Schneiden Sie das Gewebe anschließend mit einer Präzisionsschere in Streifen von 1–2 Zentimeter Länge und geben Sie diese in einen 50-Milliliter-Konischkolben, der 10 Milliliter eiskaltes PBS enthält. Mischen Sie den Inhalt durch vorsichtiges Umstülpen und lassen Sie das Gewebe einige Minuten lang auf den Boden des Kolbens absinken. Aspirieren Sie dann das PBS und waschen Sie die Streifen dreimal erneut mit jeweils 10 Milliliter frischem PBS, jedes Mal auf die gleiche Weise. Am Ende der letzten Waschung stellen Sie den Kolben zehn Minuten lang auf Eis. Ersetzen Sie anschließend das PBS durch 25 Milliliter PBS, ergänzt mit 2 Millimolar EDTA, und inkubieren Sie den Kolben 45 Minuten lang in einem Eisbad auf einer Schüttelplattform. Am Ende der Inkubation lassen Sie die Gewebestreifen auf den Boden des Kolbens absinken und ersetzen das PBS-EDTA durch 10 Milliliter PBS, ergänzt mit 10 % FBS. Schütteln Sie den Kolben zehnmal kräftig von Hand. Lassen Sie das Gewebe anschließend erneut absinken und überführen Sie den Überstand in einen 15-Milliliter-Konischkolben, der mit „Fraktion 1“ beschriftet ist. Schütteln Sie das Gewebe fünfmal erneut in PBS mit FBS und überführen Sie jedes Mal den Überstand in einen neuen Fraktionskolben. Nach der letzten Schüttelung zentrifugieren Sie alle Proben und resuspendieren die Pellets in jeweils fünf Milliliter prägewärmtem DMEM/F12 ohne zusätzliche Wachstumsfaktoren. Zentrifugieren Sie die Proben erneut und aspirieren Sie jeweils vier Milliliter des Überstands aus jedem Kolben. Resuspendieren Sie die Pellets in dem letzten verbleibenden Milliliter Medium und verwenden Sie 20-Mikroliter-Aliquote aus jeder Fraktion, um die Krypten und das Zelltrümmermaterial auf Objektträgern zu visualisieren. Nachdem Sie die geeigneten Fraktionen kombiniert haben, um das höchstmögliche Verhältnis von Krypten zu Trümmern zu erreichen, zentrifugieren Sie die gepoolten Fraktionen und aspirieren Sie den Überstand bis auf die letzten 50–100 Mikroliter. Unter Beibehaltung der Kolben auf Eis geben Sie 1 Milliliter Proteinkollagenmatrix zu den gepoolten Fraktionen hinzu und pipettieren langsam auf und ab, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter der Proteinkollagenmatrix/Krypten-Suspension in die Mitte jedes Wells einer 37
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Gewinnung, Kultivierung und Behandlung von Organoiden aus dem murinen Dünndarm mit pathogenassoziierten molekularen Mustern (PAMPs) und Listeria monocytogenes beschrieben. Besonderes Augenmerk liegt auf der Genexpression und geeigneten Normalisierungstechniken für die Proteinanalyse.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Mikrobiologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Maus-Dünndarm-Organoide sind wertvoll für die Erforschung der Darmbiologie.
- Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) spielen eine Rolle bei immunologischen Reaktionen.
- Das Verständnis der Genexpression ist entscheidend, um experimentelle Ergebnisse zu interpretieren.
- Normalisierungstechniken sind unerlässlich für eine genaue Proteinanalyse.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung für die Arbeit mit Organoiden des murinen Dünndarms bereitstellen.
- Die Wirkung von PAMPs und Listeria monocytogenes auf diese Organoiden untersuchen.
- Die Bedeutung der Genexpressionsanalyse und -normalisierung hervorheben.
Verwendete Methoden
- Gewinnung von Maus-Dünndarm-Organoide.
- Pflege von Organoide-Kulturen unter spezifischen Bedingungen.
- Behandlung von Organoiden mit PAMPs und Listeria monocytogenes.
- Analyse von Genexpression und Protein-Normalisierungstechniken.
Hauptergebnisse
- Die erfolgreiche Kultivierung und Behandlung von Organoiden wurde erreicht.
- Nach der Behandlung wurden Veränderungen in der Genexpression beobachtet.
- Normalisierungstechniken verbesserten die Genauigkeit der Proteinanalyse.
- Das Protokoll kann auf verschiedene Studien im Bereich der Darmbiologie angewendet werden.
Schlussfolgerungen
- Das beschriebene Protokoll eignet sich zur Untersuchung von Darmorganoiden.
- PAMPs und Listeria monocytogenes beeinflussen die Genexpression signifikant.
- Angemessene Normalisierungstechniken sind entscheidend für zuverlässige Ergebnisse.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Ex-vivo-Maus-Dünndarm-Organoide bieten ein physiologisch relevantes System, um Wirt-Pathogen-Interaktionen und angeborene Immunsignale in Schleimhautgeweben zu untersuchen. Der Schwerpunkt des Protokolls auf der Normalisierung gegenüber der Gesamtzellzahl behebt eine entscheidende Herausforderung bei der Erzeugung reproduzierbarer, quantitativer Daten aus heterogenen Organoide-Kulturen. Diese Fähigkeit stärkt das Vorhersagevertrauen in frühen Entdeckungsphasen und bei der Zielvalidierung für immunologische und mikrobiomorientierte therapeutische Programme.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die mechanistische Untersuchung von Pathogen-erkennenden Rezeptorwegen in primären epithelialen Kontexten.
- Unterstützt die biologische Ent风险bewertung durch die Modellierung komplexer Wirt-Pathogen-Interaktionen ex vivo.
- Erleichtert die funktionelle Zielvalidierung für Modulatoren der angeborenen Immunität.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit für die Weiterentwicklung immunologischer Wirkstoffe.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Organoid-Systeme für die nachgeschaltete Untersuchung immunmodulatorischer Substanzen vor.
- Beantwortet die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch rigorose Normalisierungstechniken.
- Ermöglicht die quantitative Messung sezernierter Proteine und unterstützt damit eine zuverlässige Bewertung von Substanzen.
- Ermöglicht die Skalierbarkeit und Wiederverwendung der Plattform in verschiedenen Entdeckungsprogrammen.
Translationale und präklinische Forschung
- Entspricht der krankheitsrelevanten Schleimhautbiologie zur translationellen Erforschung von Biomarkern.
- Bietet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung in Studien zur Immunfunktion und Barrierefunktion.
- Reduziert Risiken bei Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem physiologisch relevante epitheliale Reaktionen modelliert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll integriert sich in die Entdeckungskette von der frühen Hypothesenprüfung über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Validierung für Programme zur Schleimhautimmunologie und zu Wirt-Mikrobe-Interaktionen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von angeborenen Immunsignalkaskaden und Wirt-Pathogen-Mechanismen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte für die Analyse sekretierter Proteine in Organoid-Assays.
- Analytik: Ermöglicht die Normierung an die Gesamtzellzahl und verbessert so die Vergleichbarkeit zwischen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit der in-vivo-Schleimhautbiologie zur Abstimmung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen wiederverwendbaren, auf Organoiden basierenden Workflow für Immunologie- und Mikrobiom-F&E-Portfolios.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Target-Validierung.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Normalisierung und Quantifizierung in komplexen Organoid-Systemen.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffiziente Portfoliofortschritte.
- Portfolio-Impact: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Immunologie- und Mikrobiom-Aktiva.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Organoidkultur und epithelialen Biologie.
- Benötigt Zugang zu spezialisierten Zellkultur- und Proteinquantifizierungsgeräten.
- Setzt eine standardisierte Normalisierung und Analyseprotokolle über Teamgrenzen hinweg voraus.
- Kann Anpassungen für verschiedene Organoidtypen oder Krankheitsmodelle erfordern.
- Die Heterogenität des Organoidwachstums und der Matrixzusammensetzung kann die Reproduzierbarkeit des Assays beeinträchtigen.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Mus musculus Small Intestinal Crypt Harvest
3:57
Organoid Plating for Pathogen Associated Molecular Patters (PAMP) and L. monocytogenes Challenge
6:58
Results: Representative Mouse Intestinal Organoid Culture and Stimulation
8:29
Conclusion
