Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Exosomen aus menschlicher Galle für weitere Analysen, einschließlich microRNA-Profiling, zu isolieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Lebererkrankungen zu beantworten, wie z. B. den Nachweis eines bestimmten Gallenmarkers für Cholangiokarzinome oder andere Gallenerkrankungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie robust und wiederholbar ist.

Um eine endoskopische retrograde Cholangiopankreatographie (ERCP) durchzuführen, beginnen Sie damit, den Patienten in Rückenlage zu bringen. Nachdem Sie ein Duodenoskop intubiert und durch den Mund des Patienten geführt haben, führen Sie es in den zweiten Teil des Zwölffingerdarms ein und identifizieren Sie die große Papille. Kanülieren Sie selektiv den gemeinsamen Gallengang, indem Sie ein dreilumiges Sphincterotom einführen, das mit einem 0,35-Zoll- oder einem 0,9-Millimeter-hydrophilen Führungsdraht vorgespannt ist.

Unter fluoroskopischer Kontrolle schieben Sie den Führungsdraht in den linken Lebergang und schieben Sie dann das Sphinkterotom fünf Zentimeter in den Gallengang vor, um eine stabile Position zu erreichen. Nachdem Sie den Führungsdraht entfernt haben, befestigen Sie eine 10-Millimeter-Spritze durch die untere Verriegelung an der Führungsdrahtöffnung und saugen Sie die Galle mit 10 Millilitern Unterdruck ab. Entfernen Sie die Spritze mit der Galle und injizieren Sie nach dem erneuten Einführen des Führungsdrahts Kontrastmittel durch die Injektionsöffnung, um den Gallenbaum zu trüben.

Füllen Sie dann die gesammelte Galle in ein 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis und zentrifugieren Sie die Probe bei 500 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten, bevor Sie sie bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Um sofort mit der Exosomenisolierung fortzufahren, geben Sie 400 Mikroliter Galle in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 300 g und vier Grad Celsius, um Zellen und Zelltrümmer zu sammeln. Um den Überstand weiter zu reinigen, wird die Lösung in frische Mikrozentrifugenröhrchen überführt und die Proben 20 Minuten lang bei 16.500 g und vier Grad Celsius zentrifugiert.

Sammeln Sie dann in einer Biosicherheitswerkbank den Überstand in einer Spritze und filtrieren Sie ihn durch einen 0,2-Mikrometer-Polyethersulfon-Membranfilter, um alle verbleibenden Partikel zu entfernen, die größer als 200 Nanometer sind. Übertragen Sie den gefilterten Überstand in Ultrazentrifugenröhrchen und verwenden Sie PBS, um die Röhrchen auf mindestens zwei Drittel zu füllen, um zu verhindern, dass die Röhrchen während der Zentrifugation kollabieren. Pelletieren Sie die Exosomen durch Ultrazentrifugation bei 120.000 g und vier Grad Celsius für 70 Minuten.

Ein kleines, gelbes Kügelchen enthält die Exosomen. Entsorgen Sie den Überstand durch vorsichtiges Dekantieren und desinfizieren Sie den Abfall durch Zugabe von Bleichmittel bis zu einer Endkonzentration von 10 Vol.-% pro Volumen. Anschließend 20 Minuten ziehen lassen.

Für nachgelagerte Experimente werden die Pellets entweder in einem kleinen Volumen geeigneter Lösung verarbeitet oder in 50 bis 100 Mikrolitern PBS resuspendiert und für die zukünftige Verwendung bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Nach der Herstellung von Gittern aus kontrastgefärbten extrazellulären Vesikeln (EVs) gemäß dem Textprotokoll werden Bilder mit einem Elektronenmikroskop mit einer Beschleunigungsspannung von 80 Kilovolt aufgenommen, beginnend bei einer Vergrößerung von 20.000 x und ansteigend auf 100.000 X, wenn die Größe der Partikel bestimmt wird. Exosomen sind zu klein, um mit normaler Mikroskopie oder Durchflusszytometrie nachgewiesen zu werden. Diese Abbildung zeigt jedoch die Ergebnisse einer typischen Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) von Exosomen, die die Konzentration und Größenverteilung messen, die in dieser isolierten menschlichen Gallenprobe durchschnittlich 97 Nanometer betrug.

Die Elektronenmikroskopie kann auch verwendet werden, um die Größe der isolierten Partikel in der menschlichen Galle zu bestätigen, und diese Abbildung zeigt ein typisches Transmissions-EM-Ergebnis. Diese Western Blots wurden auf Proteine untersucht, die mit Exosomen wie dem Tetraspanin CD63 und Tsg101 angereichert sind. Dieses Echtzeit-Amplifikationsdiagramm zeigt eine Vielzahl von microRNA-Spezies, die aus Exosomen der menschlichen Galle extrahiert wurden.

Da es bei Exosomen an verlässlichen Standards wie 18S- oder 28S-ribosomaler RNA oder Housekeeping-Genen mangelt, ist das Spiking einer synthetischen microRNA wichtig für die Normalisierung. Die ExOS-Isolierungstechnik kann bei richtiger Durchführung in drei Stunden durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Galle von Patienten oder Tieren gewinnen und verarbeiten können, um extrazelluläre Vesikel zu isolieren und zu analysieren.

Wenn Sie dieses Verfahren widerrufen, ist es wichtig, daran zu denken, die Probe bei 500 g und vier Grad zu zentrifugieren, bevor Sie sie bei minus 80 Grad einfrieren, wenn Sie nicht mit der Ultrazentrifugation fortfahren können. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie microRNA-Studien durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie microRNA-Profile zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Galle extrem gefährlich sein kann, da sie Hepatitis enthalten kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Schutzbrillen sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.

Nach ihrer Entwicklung ebnete die Technik den Weg für die Forschung auf dem Gebiet der Cholangiokarzinomforschung, um extrazelluläre Vesikel als potenziellen Biomarker in der Galle von Patienten mit Gallenproblemen wie z. B. Obstruktion von PSA zu erforschen.