Name: Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Exosomen aus menschlicher Galle mittels ERCP für microRNA-Profiling und Biomarkerforschung bei Lebererkrankungen. Diese robuste Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse.

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Diese Studie wurde durch einen K08 Award (DK090154-01) der National Institutes of Health (NIH; an F.M.S.) unterstützt.

Erhalten der Galle von Patienten durch ERCP (ERCP) bedarf der Zustimmung eines menschlichen Probanden Studienprotokoll vom Institutional Review Board. Alle hier vorgestellten Arbeit wurde von der Johns Hopkins University Institutional Review Board genehmigt. 1. exosome Isolation von Bile <ol><li> Führen Sie ERCP (ERCP). Der Patient wird in Rückenlage und intubieren. <ol><li> Übergeben Sie einen Duodendoskop durch den Mund des Patienten und legen Sie sie in den zweiten Teil des Duodenum und die großen Papille identifizieren. </li><li> kanülieren Selektiv Choledochus ein dreilumiger Papillotom vorbelastet mit einem 0,035 Zoll (0,9 mm) hydrophile Führungsdraht durch das Einfügen. </li><li> Schieben Sie den Führungsdraht unter Durchleuchtungskontrolle nach links Hepatikus da gelegentlich kann es schwierig sein, den Cysticus vom rechten Hepatikus zu unterscheiden, dann voraus, um denSphinkterotom 5 cm in den Gallengang eine stabile Position zu erwerben. </li><li> Entfernen Sie den Führungsdraht, fügen Sie eine 10 ml Spritze mit dem Führungsdrahtöffnung durch den Luer-Lock und aspirieren die Galle mit 10 ml Unterdruck. </li><li> Entfernen Sie die Spritze die Galle enthält, mit der ERCP fortzufahren, indem der Führungsdraht wieder einsetzen und Kontrastmittel durch die Injektionsöffnung Injizieren des Gallenbaum zu trüben. </li><li> Übertragen Sie die gesammelten Galle in einen 15-ml-Röhrchen auf Eis und auf Eis halten, bis sie bereit mit dem Zentrifugationsschritt, um fortzufahren. Vorsicht: Handschuhe tragen sich selbst und die Proben zu schützen! Behandeln Sie die Galle als eine mögliche Quelle der Infektion, wie es Hepatitis-A-Virus-Partikel enthalten kann! </li><li> Halten Sie die Probe (n) auf Eis. Entweder fahren Sie mit Schritt 1.2 oder Zentrifuge bei 500 × g bei 4 ° C für 10 min und dann einfrieren bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. Hinweis: Um diese Art und Weise gespeichert Proben für mehrere Jahre routinemäßig verwendet wurden mit 19 guten Ergebnissen. </li></ol&gt; </li><li> Transfer 400 ul Galle in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zu sammeln Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren, Transfer in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge die Probe (n) bei 16.500 × g für weitere 20 Minuten bei 4 ° C, um den Überstand von weiteren Trümmer zu löschen. Entsorgen Sie die Rohre in dem Biohazard Abfall. Alternativ drehen Sie die Proben in einer Ultrazentrifuge statt. </li><li> Sammeln Sie den Überstand und filtern Sie sie in einem Bio-Sicherheitsschrank mit einer Spritze durch einen 0,2 um Polyethersulfon (PES) Membranfilter, die eine gute Durchflussraten und niedrige Proteinbindung alle Partikel zu entfernen, die größer als 200 nm belassen. </li><li> Pipettieren der filtrierte Überstand Röhrchen Ultracentrifuge und PBS hinzufügen, so dass die Rohre mehr als 2/3 voll sind. Wenn die Röhren weniger Flüssigkeit enthalten als das, werden die Rohre während der Zentrifugation kollabieren! Tubes kann mehrmals gewaschen, autoklaviert und wiederverwendet werden. </li><li> Pellet Exosomen die durch Ultrazentrifugation bei 120.000 xg für 70 min bei 4 ° C. Nach der Zentrifugation Blick auf die Unterseite des Ultrazentrifugenröhrchen manchmal kleine gelbe Pellets sehen; dies sind die Exosomen. </li><li> Überstand verwerfen, indem sie vorsichtig dekantieren und den Abfall zu desinfizieren durch Bleichmittel auf eine Endkonzentration von 10% v / v Hinzufügen und lassen Sie es 20 Minuten lang stehen. </li><li> Für nachgeschaltete Experimenten gepuffert entweder die Pellet (s) in einem kleinen Volumen der geeigneten Lösung (dh Radioimmunpräzipitation - Assay (RIPA) Puffer für die Proteinisolierung, RNA Lysepuffer für miR isolation) oder resuspendieren es in 50-150 ul Phosphat verarbeiten Salzlösung (PBS) , die bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung (quantitative Echtzeit - Polymerase - Kettenreaktion (qRT-PCR) oder Proteinextraktion etc.) oder verwendet zur Charakterisierung der exosome Herstellung durch TEM oder Nanopartikel optische Analyse gespeichert werden kann entweder . </li></ol> 2. exosome Identifikation durchTransmissionselektronenmikroskopie (TEM) oder Kryo-EM <ol><li> Resuspendieren extrazellulären Vesikeln in 100 ul PBS pipettiert. Idealerweise verwenden Exosomen, die bei -20 ° C oder -80 ° C gelagert wurden nicht, vor allem wenn die Isolation zum ersten Mal durchgeführt wird. </li><li> Adsorbieren ein 20-ul-Aliquot (etwa 2 ug) bis 400 mesh Kohlenstoff beschichteten Parlodion Kupfergitter für 2 min und lassen bei RT trocknen. </li><li> Befestigen Sie den Exosomen in 1% (v / v) Glutaraldehyd (EM-grade) für 5 min bei RT durch Tropfen vorsichtig auf die getrocknete Zubereitung platzieren. </li><li> Waschen Sie die Gitter zweimal mit Wasser für 5 Minuten und dann Fleck EVs mit 1% Wolframatophosphorsäure (PTA) für 30 Sekunden gegenüber. </li><li> Erwerben Bilder mit einem Elektronenmikroskop mit einer Beschleunigungsspannung von 80 kV bei einer Vergrößerung von 20.000-Ausgangs und 100.000 · zu erhöhen, wenn die Größe der Partikel bestimmt wird. Hinweis: Andere preps wie Schichtung auf Formvar Kohlenstoff beschichteten 200 mesh Kupfer oder Nickel Gitter und Kontrastfärbung like 1% oder 2% Uranylacetat für 10-15 min sind möglich. </li><li> Für Kryo-EM, mischen, um ein 20-ul-Aliquot (etwa 2 ug) mit 60 &amp; mgr; l Protein G Gold 10 nm (Verhältnis 1: 3). Dies wird dazu beitragen, die exosome Durchmesser zu bestimmen. </li><li> Übertragen Sie die Proben auf glow-entladen C-Flach löchrigen Kohlenstoff Gitter und überschüssige Flüssigkeit zu entfernen durch Abtupfen. Frieren Sie die Gitter von ihnen sofort in flüssigem Ethan getaucht wird. </li><li> Montieren Sie die Gitter in einem cryoholder in flüssigem Stickstoff. </li><li> Erwerben Sie die Bilder bei 200 kV mit einer Vergrößerung von 20.000-und 100.000 ·. </li></ol> 3. exosome Identifizierung von Multi-Parameter-Nanopartikel-Optische-Analyse <ol><li> Resuspendieren der isolierten Exosomen in 100 ul PBS pipettiert. </li><li> Verdünnte Exosomen in 600 &amp; mgr; l PBS bei mehreren verschiedenen Verhältnissen (wie 1:50 1: 100, 1: 300, 1: 600 und 1: 1.200). </li><li> Visualisieren Sie die Exosomen durch Laserlichtstreuung mit dem entsprechenden Gerät und Software in Echtzeit nach manufacturer Protokoll 20. </li><li> Erhöhen Sie den Pegel der Kamera im Aufnahmemodus, bis alle Partikel sichtbar werden, dann stellen Sie den Fokus auf die Partikel glatt aussehen. </li><li> Während im Standard-Modus, um die Kamera auf das niedrigste Niveau zu verringern, dass die Partikel noch zu sehen ist, bei Bedarf Kamera-Auslöser und die Verstärkung einzustellen, dies zu erreichen. </li><li> Eine Sichtprüfung 20-100 Partikel sind auf dem Bildschirm sichtbar zu gewährleisten, wenn das Gerät nicht spülen und die Verdünnung in PBS einzustellen. </li><li> Dann stellen Sie die Aufnahmedauer auf einen Wert zwischen 30 bis 60 Sekunden. Nachdem das Video aufgenommen wird, stellen Sie die Verarbeitungsparameter, bis alle Partikel auf dem Bildschirm identifiziert werden und die Videodatei verarbeiten. </li></ol> 4. exosome Charakterisierung durch Western Blot <ol><li> Lyse exosome Pellets 2-5 ml Galle in 100 ul eiskaltem Radioimmunopräzipitation-Assay (RIPA) Puffer mit einem Proteaseinhibitor durch Auf- und Abpipettieren gründlich mischen Lysaten kräftig für 30 Sekundenauf einem Vortex die Proteine ​​wirksam zu solubilisieren. </li><li> Während die meiste Zeit nicht notwendig, puls Beschallung der Proben auf Eis mit 2 Impulsen für 10 sec jede volle Lyse sicherzustellen verwenden. </li><li> Pellet unlösliches Material durch Zentrifugation bei 15.000 × g bei 4 ° C für 5 min und Überstand in ein sauberes Röhrchen. </li><li> Bestimmung der Proteinkonzentration mit einem Verfahren der Wahl (dh Bicinchoninsäure (BCA), Coomassie modifizierte Lowry, 660 nm Protein Assay, etc.) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Das Verfahren ist nicht so wichtig, solange das gleiche Verfahren durchgängig verwendet wird, Ergebnisse zu erzielen, die über Experimente verglichen werden kann. </li><li> Last 50 ug Protein pro Probe in Laemmli-Puffer nach dem Erhitzen der Probe bei 95 ° C für 5 min in ein Bohrloch eines Polyacrylamidgels für die Elektrophorese (PAGE). </li><li> Elektrophorese der Proben auf den PAGE-Gele für 1,5 Stunden und übertragen Sie die getrennten Proteine ​​auf eine Nylonmembran. </li><li> BSperren der Membran (en) mit 5% fettfreier Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1% Tween 20 (TBS-T) 1 Stunde lang, dann inkubieren mit Exosom-spezifischen Antikörper wie Anti-CD63 und Anti-TSG-101 bei einer Verdünnung von 1: 500 bevorzugt O / N bei 4 ° C. </li><li> Waschen der Membranen mit TBS-T 3 x 10 min inkubieren, dann mit einem geeigneten, passenden HRP-konjugiertem sekundärem Antikörper in 5% Magermilch in TBS-T für 1-2 h bei RT. </li><li> Waschen der Membran (en) 3 x 5 min mit TBS-T und detektieren die spezifischen Proteine ​​mit Chemilumineszenz-Reagenzien nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Bild die Membranen mit Folie oder einem digitalen Bildgebungssystem gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li></ol> 5. MicroRNA Isolation von den isolierten Exosomen Hinweis: Isolierung von miRNA aus Gallen Exosomen ist eine modifizierte miRNA Isolation auf einem handelsüblichen Kit basierend durchgeführt, aber jede andere RNA Isolierungsverfahren können verwendet oder angepasst werden. <ol><li> In 300 &amp;# 181; l Lyse / Gebäude Puffer zum exosome Pellet (isoliert von 400 ul Galle), Wirbel, Pipette oder gehen durch eine Nadel / Spritze vollständig lysieren die Exosomen ein homogenes Lysat zu erhalten. </li><li> In 1/10 (30 &amp; mgr; l) Volumen von miRNA Homogenat Additive und gut mischen durch Vortexen oder das Rohr mehrere Zeit invertieren. </li><li> Inkubieren Sie die Mischung für 10 Minuten auf Eis. </li><li> Hinzufügen ein Volumen von Säure-Phenol: Chloroform gleich dem anfänglichen Homogenat (300 ul). </li><li> In 5 ul 5 fmol / ul Cel-miR 39 und Wirbel für 30-60 Sekunden. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 10.000 × g bei RT die wässrige zu trennen (oben) und organische (untere) Phasen. </li><li> aspirieren Sie vorsichtig die obere Phase durch Pipettieren und in ein frisches Röhrchen, während das Volumen übertragen Feststellung. Entsorgen Sie die organische Phase in den entsprechenden organischen Abfallbehälter. </li><li> Zur Bereicherung für kleine RNAs 1/3 Volumen von 100% Ethanol auf den wiederhergestellten wässrigen Phase hinzugeben und mischen durch gründliches Vortexen oder Umkehren des tumehrmals sein. </li><li> Pipettieren das Lysat / Ethanol-Mischung auf der Filterpatrone, bis zu 700 &amp; mgr; l zu einer Zeit. </li><li> Zentrifugieren Sie die Patronen für 15 s bei maximal 10.000 xg oder gelten Vakuum der Mischung durch den Filter passieren. </li><li> Das Filtrat und wenn das Lysat / Ethanol-Mischung 700 &amp; mgr; l übersteigt, übertragen Sie den Durchfluss in ein frisches Röhrchen und wiederholen Sie den Vorgang zu sammeln alle Filtrate. Diese Filter enthält RNA Fraktionen frei von kleinen RNAs und kann verwendet werden, um diese größere RNAs zu erholen. </li><li> In 2/3 Volumen von RT 100% Ethanol auf das Gesamt Filtrat und gründlich mischen durch Vortexen. </li><li> Pipettieren das Filtrat / Ethanol-Gemisch auf eine zweite Filterpatrone. Nach wie vor das maximale Volumen, das auf einmal angewendet werden kann, beträgt 700 &amp; mgr; l. </li><li> Zentrifuge für 15 Sekunden bei 10.000 × g oder Vakuum wird in Schritt 5.10 beschrieben. </li><li> Verwerfen Sie den Durchfluss durch, und wiederholen, bis das gesamte Filtrat / Ethanol-Mischung gefiltert wurde. </li><li> bewerben 70081; l miRNA Waschlösung 1 auf die Filterpatrone, Zentrifuge für 5-10 sec oder Vakuum anzuwenden und den Durchlauf verwerfen. </li><li> Waschen Sie den Filter mit 500 ul Waschlösung 2/3, wie in Schritt 5.16 getan. </li><li> Wiederholen Sie die Wäsche ein zweites Mal mit 500 ul Waschlösung 2/3, wie in Schritt 5.16, entsorgen Sie die Durchfluss und legen Sie den Filter wieder in das Sammelrohr. </li><li> Drehen die Filterpatrone für 1 min bei 10000 xg gesamte restliche Fluid aus dem Filter zu entfernen. </li><li> Übertragen, um die Filterpatrone in eine frische Sammelröhrchen und anzuwenden 100 &amp; mgr; l heißem (95 ° C) Nuklease-freies Wasser auf die Mitte des Filters. </li><li> Drehen Sie die Baugruppen für 20-30 sec bei maximaler Geschwindigkeit um die RNA zu erholen. </li><li> Sammeln des Eluats und sofort verwenden oder lagern bei -80 ° C. </li></ol>

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Keiner der Autoren hat konkurrierende finanzielle Interessen.

Um zuverlässig Exosomen isoliert von Galle nutzen, ist es wichtig, eine gleichbleibend hohe Qualität Isolierungsverfahren zu verwenden, um qualitativ hochwertige Proben im Gegenzug erhalten. Die Methodik in diesem Dokument definiert ist, eine gut etablierte Weg Exosomen und miRNA aus menschlichen Galle zu isolieren. Sie weist auf mehrere entscheidende Schritte bei der Charakterisierung der isolierten Exosomen, die bei einem Minimum sollte Elektronenmikroskopie oder Nanopartikel optische Analyse und Western-Blots umfasse...

Wie bei anderen biologischen Flüssigkeiten, also der Muttermilch, Plasma oder Urin, Galle enthält Exosomen, lipidreiche Vesikeln 1-4. Exosomen können biologische Funktionen in Empfängerzellen 5, 6, eine Form von Zell-Zell - Kommunikation induzieren oder zu verändern , die 4, Teil ihrer normalen Funktion 7-9 sein könnten. Exosomen können miRNA - Arten enthalten , die 10 eine wertvolle Quelle für Biomarker für die Diagnose zur Verfügung stellen kann. miRNAs Profile haben beträchtliche Aufmerksamkeit in den letzten Jahren als diagnostisches und prognostischen Marker für eine Vielzahl von Krankheiten 11-14 gewonnen. miRNA selbst kann in biologischen Flüssigkeiten, möglicherweise veröffentlicht von toten Zellen und die Menge der Schuppen Zellen gefunden werden kann, stark von einer zugrundeliegenden Krankheit beeinflusst werden. Die miRNA Profil von Exosomen geben nicht unbedingt die miRNA Profil der Ursprungszelle 6, 10, 15-17, noch Exosomen können miRNA Unterschriften tragen, die für die elterliche ce charakteristisch sein könntell eine Tumorzelle mögen. Tumor-abgeleitete Exosomen wurden im Plasma von Patienten mit Lungenadenokarzinom, Prostatakrebs und anderen Tumoren 8, 16, 18 identifiziert. Das Ziel dieser Methode ist die zuverlässige und robuste Isolierung der Exosomen aus menschlichen Gallenproben, weitgehend unabhängig von ihrer vorherigen Handhabungsverfahren. Es wurde Galle als eine zuverlässige Quelle von miRNA für die mögliche Diagnose von Erkrankungen des Gallengangs wie Cholangiokarzinom 19 zu verwenden , entwickelt. Es besteht aus mehreren Schritten Zentrifugation mit zunehmender Geschwindigkeit Exosomen zu isolieren und möglicherweise zu anderen biologischen Flüssigkeiten anwendbar.

<table><tbody><tr><td>0,2 &Mikro; m Membranfilter aus Polyethersulfon (PES)</td><td>Corning</td><td>431229</td><td></td></tr><tr><td>dünnwandige Polyallomer-Ultrazentrifugenröhrchen&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>SW40Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LM10-HS&nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software für die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVANA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor</td><td>Roche vertrieben von Sigma-Aldrich</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon PSQ</td><td>Millipore, Bedford MA</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD63 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tsg101</td><td>Abcam</td><td>ab30871</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation und profilierung von microrna-haltigen exosomen von human bile

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome Forschung in den letzten drei Jahren hat sich stark den Umfang einen Beitrag zur Identifizierung und Charakterisierung von Biomarkern und deren therapeutische Verwendungen ausgeweitet. Exosomen sind microRNAs (miRs) gezeigt enthalten kürzlich. Mirs haben sich als wertvolle Biomarker für diagnostische Zwecke entstanden sind. Als Probenentnahme in Kliniken und Krankenhäusern sehr unterschiedlich ist, variiert miRNA-Isolierung aus Voll Galle erheblich. Um das zu erreichen robuste, genaue und reproduzierbare miRNA Profile gesammelt Gallenproben auf einfache Weise erforderte die Entwicklung eines qualitativ hochwertigen Protokoll zu isolieren und Exosomen von Galle zu charakterisieren. Das Verfahren erfordert mehrere Zentrifugationen und einen Filtrationsschritt mit einer abschließenden Ultrazentrifugationsschritt die isolierten Exosomen zu pelletieren. Elektronenmikroskopie, Western-Blots, Durchflusszytometrie und Multi-Parameter-Nanopartikel-optische Analyse, soweit verfügbar, sind von entscheidender Bedeutung Charakterisierung Schritte, um die Qualität der E zu validierenxosomes. Für die Isolierung von miRNA aus diesen Exosomen, das Lysat mit einem unspezifischen, synthetische miRNA aus einer Spezies , wie Caenorhabditis elegans Spiking, das heißt, Cel-miR-39 , ist wichtig für die Normierung der RNA - Extraktionseffizienz. Die Isolierung von Exosomen von Gallenflüssigkeit nach dieser Methode ermöglicht die erfolgreiche miRNA Profilierungs von Gallenproben für mehrere Jahre bei -80 ° C gelagert.

Da Exosomen zu klein sind, durch regelmäßige Mikroskopie nachgewiesen werden oder Durchflusszytometrie, Elektronenmikroskopie oder Nanopartikel optische Analyse durchgeführt werden. Die Nanopartikel optische Analyse hat den Vorteil gegenüber der Elektronenmikroskopie, dass es auch quantitative und bietet Größenverteilung und Konzentration. Das Gerät führt einen fein fokussierten Laserstrahl durch ein Glasprisma in die Probe. Die Brownsche Bewegung der isolierten Vesikeln wird über eine E...

Gallenflüssigkeit ist eine wertvolle Quelle für extrazelluläre Vesikel/Exosomen, die potenziell wichtige Biomarker enthalten. Dieses Protokoll stellt eine robuste Methode zur Isolierung von Exosomen aus menschlicher Galle für weitere Analysen, einschließlich miRNA-Profiling, dar.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Exosomen aus menschlicher Galle zu isolieren, um anschließende Analysen wie die Mikro-RNA-Profilierung durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Lebererkrankungen zu beantworten, beispielsweise den Nachweis eines bestimmten Gallenmarkers für Cholangiokarzinome oder andere biliäre Erkrankungen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer Robustheit und Reproduzierbarkeit.Um eine endoskopische retrograde Cholangiopankreatographie, oder ERCP, durchzuführen, bringen Sie den Patienten zunächst in Rückenlage. Nach der Intubation und dem Einführen eines Duodenoskops durch den Mund des Patienten, führen Sie es in den zweiten Abschnitt des Duodenums ein und identifizieren die Papilla vateri. Kanülieren Sie selektiv den Ductus choledochus, indem Sie einen dreilumigen Sphinkterotom mit einem vorbestückten hydrophilen Führungsdrähtchen mit einem Durchmesser von 0,35 Zoll oder 0,9 Millimetern einführen.Unter fluoroskopischer Kontrolle das Führungsdraht bis zum linken Lebergang vorziehen, anschließend das Sphinkterotom über fünf Zentimeter in den Ductus choledochus vorbringen, um eine stabile Position zu erreichen. Nach dem Entfernen des Führungsdrahts eine 10-Milliliter-Spritze an den Führungsdraht-Anschluss über die untere Sperre anschließen und mit 10 Millilitern Unterdruck die Galle aspirieren. Die mit Galle gefüllte Spritze entfernen, danach den Führungsdraht erneut einführen und Kontrastmittel über den Injektionsanschluss injizieren, um den Gallengangbaum sichtbar darzustellen.Überführen Sie dann die gesammelte Galle in ein 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis, und falls eine spätere Lagerung geplant ist, zentrifugieren Sie die Probe bei 500 × g und vier Grad Celsius für 10 Minuten, bevor Sie sie bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Um unverzüglich mit der Exosomenisolierung fortzufahren, geben Sie 400 Mikroliter Galle in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 300 × g und vier Grad Celsius für 10 Minuten, um Zellen und zellulären Abfall zu pelletieren. Um das Überstand weiter zu klären, überführen Sie die Lösung in neue Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Proben bei 16.500 × g und vier Grad Celsius für 20 Minuten.Anschießend im Sicherheitswerkbank das Überstand in eine Spritze aufnehmen und durch einen 0,2-Mikrometer-Polyethersulfon-Membranfilter filtrieren, um verbleibende Partikel größer als 200 Nanometer zu entfernen. Den filtrierten Überstand in Ultrazentrifugenröhrchen überführen und PBS hinzufügen, um die Röhrchen mindestens zu zwei Dritteln zu füllen, um ein Zusammenfallen der Röhrchen während der Zentrifugation zu verhindern. Die Exosomen durch Ultrazentrifugation bei 120.000 × g und vier Grad Celsius für 70 Minuten als Pellet abtrennen.Ein kleines, gelbes Pellet enthält die Exosome. Verwerfen Sie den Überstand, indem Sie ihn vorsichtig abgießen, und desinfizieren Sie den Abfall durch Zugabe von Bleichmittel auf eine Endkonzentration von 10 % (Volumen pro Volumen). Danach 20 Minuten stehen lassen.Für nachgeschaltete Experimente entweder die Pellets in einem kleinen Volumen einer geeigneten Lösung verarbeiten oder sie in 50 bis 100 Mikroliter PBS resuspendieren und bei minus 80 Grad Celsius für zukünftige Verwendung lagern. Nach der Herstellung von Kontrast-gefärbten Gittern für extrazelluläre Vesikel oder EVs gemäß dem schriftlichen Protokoll, Aufnahmen mit einem Elektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 80 Kilovolt beginnend bei einer Vergrößerung von 20.000 X und steigend bis 100.000 X anfertigen, um die Größe der Partikel zu bestimmen. Exosomen sind zu klein, um mit herkömmlicher Mikroskopie oder Durchflusszytometrie nachgewiesen zu werden; diese Abbildung zeigt jedoch die Ergebnisse einer typischen Nanopartikel-Tracking-Analyse oder NTA von Exosomen, die Konzentration und Größenverteilung messen, wobei im Durchschnitt 97 Nanometer in dieser isolierten menschlichen Gallenprobe gemessen wurden.Die Elektronenmikroskopie kann ebenfalls verwendet werden, um die Größe der isolierten Partikel in menschlicher Galle zu bestätigen, und diese Abbildung zeigt ein typisches Ergebnis der Transmissions-Elektronenmikroskopie. Diese Western Blots wurden auf Proteine untersucht, die in Exosomen angereichert sind, wie beispielsweise das Tetraspanin CD63 und Tsg101. Diese Echtzeit-Amplifikationskurve zeigt eine Vielzahl von mikroRNA-Spezies, die aus Exosomen der menschlichen Galle extrahiert wurden.Da Exosome keine zuverlässigen Standards wie 18S- oder 28S-rRNA oder Housekeeping-Gene besitzen, ist das Hinzufügen eines synthetischen microRNA wichtig für die Normalisierung. Die Exos-Isolierungstechnik kann innerhalb von drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gallenflüssigkeit von Patienten oder Tieren gewinnt und verarbeitet, um extrazelluläre Vesikel zu isolieren und zu analysieren.Während der Wiederholung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Probe vor dem Einfrieren bei minus 80 zuerst bei 500 G und vier Grad zu zentrifugieren, falls keine Ultrazentrifugation durchgeführt werden kann. Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie Untersuchungen zu microRNA angewandt werden, um zusätzliche Fragestellungen wie etwa microRNA-Profile zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Gallenflüssigkeit äußerst gefährlich sein kann, da sie Hepatitis enthalten könnte, und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Schutzbrille getroffen werden sollten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.Nach ihrer Entwicklung ebnete die Technik den Weg für die Forschung im Bereich des Cholangiokarzinoms, um extrazelluläre Vesikel als potenzielle Biomarker in Gallenflüssigkeit von Patienten mit Gallengangsproblemen wie einer Obstruktion des PSA zu untersuchen.

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Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Papier zeigt Methoden zur Isolierung, Aufreinigung und Detektion von Exosomen, sowie Techniken für die Analyse ihrer molekularen Inhalten. Diese Methoden sind anpassungsfähig für Exosom Isolation von beiden Zellkulturmedien und biologischen Flüssigkeiten, und kann darüber hinaus Analyse molekularer Inhalte auch in funktionellen Studien nützlich sein.

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

Das Vorhandensein von stabilen microRNAs (miRNAs) in exosomes hat immense Interesse als neue Art der interzellulären Kommunikation erzeugt, für ihre potenziellen Nutzen als Biomarker und als Weg für eine therapeutische Intervention. Hier zeigen wir exosome Reinigung von Blut und Kulturmedien durch quantitative PCR gefolgt, um miRNAs transportiert identifizieren.

Reinigung und microRNA Profiling von Exosomen aus Blut und Kultur Medien Abgeleitet

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Extraktion von kleinen RNAs aus menschlichem Serum. Wir haben diese Methode verwendet, um microRNAs von Krebsserum für den Einsatz in DNA-Arrays isolieren und auch Singleplex quantitative PCR. Das Protokoll nutzt Phenol und Guanidiniumthiocyanat Reagenzien mit Modifikationen, um qualitativ hochwertige RNA ergeben.

Isolierung von Kleine-kodierenden RNAs von Human Serum

Es werden Techniken beschrieben, die ein Gradientenverfahren zur Trennung von Exosomen von Partikeln des humanen Immundefizienzvirus (HIV) beschreiben. Dieses Verfahren wurde verwendet, um Exosomen weg von HIV-Partikeln im menschlichen Plasma von HIV-infizierten Personen zu isolieren. Die isolierten Exosomen wurden auf ihren Zytokin-/Chemokingehalt analysiert.

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Dieses Protokoll beschreibt die Machbarkeit, miRNA-Profiling in Exosomen, die im Plasma von NSCLC-Patienten freigesetzt werden, durch ein kommerzielles Exosomen-Isolationskit mit Proteinase K- und RNAse-Behandlungen durchzuführen, um eine Kontamination mit zirkulierenden miRNAs zu vermeiden und ihre Biomarker-Eigenschaften bei NSCLC zu bewerten.

Exosomalen miRNA-Analyse in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) der Patienten Plasma durch qPCR: ein gangbarer Flüssiges Biopsy-Tool

MicroRNAs spielen eine wichtige regulatorische Rolle und werden als neue therapeutische Targets für verschiedene menschliche Krankheiten entstehen. Es hat sich gezeigt, dass miRNAs in Lipoproteinen hoher Dichte durchgeführt werden. Wir haben ein vereinfachtes Verfahren entwickelt, um schnell gereinigter HDL für miRNA-Analyse von Humanplasma geeignet isolieren.

Schnelle und vereinfachte Verfahren für Hochdurchsatz-Isolierung von miRNA aus Highly Purified High Density Lipoprotein

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Quantifizierung von kleinen RNAs mit hohem Dichtheits-Lipoprotein.

Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification

Extrazelluläre Vesikel im Blut wurden als neuartige Biomarker für verschiedene Krankheiten vorgeschlagen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Isolierung von großen Mikrovesikeln aus Plasmamembranen aus peripheren Blutproben und deren anschließende Analyse mittels konventioneller Durchflusszytometrie und Western Blotting vor.

Isolierung und Charakterisierung von Mikrovesikeln aus peripherem Blut

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll exosomen von Plasma und Serum mit reduzierter CO Reinigung nicht Exosomal Blut zu reinigen. Das optimierte Protokoll beinhaltet Ultrafiltration, Protease Behandlung und Größe Ausgrenzung Chromatographie. Verbesserte Reinigung von exosomen Vorteile nachgeschalteten Analysen, einschließlich genauere Quantifizierung von Vesikeln und Proteomic Charakterisierung.

Proteinverdauung, Ultrafiltration und Größe Ausgrenzung Chromatographie, die Isolation der Exosomen aus menschlichem Blutplasma und Serum zu optimieren

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie extrazelluläre MicroRNAs von Zellkulturmedien für kleine RNA Bibliotheksbau und Sequenzierung der nächsten Generation zu reinigen. Verschiedenen Qualitätskontrolle Checkpoints werden beschrieben, Leser zu verstehen, was beim Arbeiten mit niedrigen Eingabesamples wie ExRNAs zu erwarten.

Isolieren, Sequenzierung und Analyse von extrazellulären MicroRNAs aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Eine Exosom ist eine neue Generation von Drug Delivery Träger. Wir etabliert eine Exosom Isolierung Protokoll mit hoher Ausbeute und Reinheit für SiRNA Lieferung. Wir auch Eindringmittel gekennzeichneten unspezifische SiRNA in Exosomen gekapselt und die zelluläre Aufnahme von SiRNA geladen Exosomen in Krebszellen untersucht.

Vorbereitung der Exosomen SiRNA Lieferung an Krebszellen

Erfahren Sie die Isolierung von Exosomen aus menschlicher Galle mittels ERCP für microRNA-Profiling und Biomarkerforschung bei Lebererkrankungen. Diese robuste Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

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