Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Exosomen aus menschlicher Galle zu isolieren, um anschließende Analysen wie die Mikro-RNA-Profilierung durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Lebererkrankungen zu beantworten, beispielsweise den Nachweis eines bestimmten Gallenmarkers für Cholangiokarzinome oder andere biliäre Erkrankungen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer Robustheit und Reproduzierbarkeit.

Um eine endoskopische retrograde Cholangiopankreatographie, oder ERCP, durchzuführen, bringen Sie den Patienten zunächst in Rückenlage. Nach der Intubation und dem Einführen eines Duodenoskops durch den Mund des Patienten, führen Sie es in den zweiten Abschnitt des Duodenums ein und identifizieren die Papilla vateri. Kanülieren Sie selektiv den Ductus choledochus, indem Sie einen dreilumigen Sphinkterotom mit einem vorbestückten hydrophilen Führungsdrähtchen mit einem Durchmesser von 0,35 Zoll oder 0,9 Millimetern einführen.

Unter fluoroskopischer Kontrolle das Führungsdraht bis zum linken Lebergang vorziehen, anschließend das Sphinkterotom über fünf Zentimeter in den Ductus choledochus vorbringen, um eine stabile Position zu erreichen. Nach dem Entfernen des Führungsdrahts eine 10-Milliliter-Spritze an den Führungsdraht-Anschluss über die untere Sperre anschließen und mit 10 Millilitern Unterdruck die Galle aspirieren. Die mit Galle gefüllte Spritze entfernen, danach den Führungsdraht erneut einführen und Kontrastmittel über den Injektionsanschluss injizieren, um den Gallengangbaum sichtbar darzustellen.

Überführen Sie dann die gesammelte Galle in ein 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis, und falls eine spätere Lagerung geplant ist, zentrifugieren Sie die Probe bei 500 × g und vier Grad Celsius für 10 Minuten, bevor Sie sie bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Um unverzüglich mit der Exosomenisolierung fortzufahren, geben Sie 400 Mikroliter Galle in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 300 × g und vier Grad Celsius für 10 Minuten, um Zellen und zellulären Abfall zu pelletieren. Um das Überstand weiter zu klären, überführen Sie die Lösung in neue Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Proben bei 16.500 × g und vier Grad Celsius für 20 Minuten.

Anschießend im Sicherheitswerkbank das Überstand in eine Spritze aufnehmen und durch einen 0,2-Mikrometer-Polyethersulfon-Membranfilter filtrieren, um verbleibende Partikel größer als 200 Nanometer zu entfernen. Den filtrierten Überstand in Ultrazentrifugenröhrchen überführen und PBS hinzufügen, um die Röhrchen mindestens zu zwei Dritteln zu füllen, um ein Zusammenfallen der Röhrchen während der Zentrifugation zu verhindern. Die Exosomen durch Ultrazentrifugation bei 120.000 × g und vier Grad Celsius für 70 Minuten als Pellet abtrennen.

Ein kleines, gelbes Pellet enthält die Exosome. Verwerfen Sie den Überstand, indem Sie ihn vorsichtig abgießen, und desinfizieren Sie den Abfall durch Zugabe von Bleichmittel auf eine Endkonzentration von 10 % (Volumen pro Volumen). Danach 20 Minuten stehen lassen.

Für nachgeschaltete Experimente entweder die Pellets in einem kleinen Volumen einer geeigneten Lösung verarbeiten oder sie in 50 bis 100 Mikroliter PBS resuspendieren und bei minus 80 Grad Celsius für zukünftige Verwendung lagern. Nach der Herstellung von Kontrast-gefärbten Gittern für extrazelluläre Vesikel oder EVs gemäß dem schriftlichen Protokoll, Aufnahmen mit einem Elektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 80 Kilovolt beginnend bei einer Vergrößerung von 20.000 X und steigend bis 100.000 X anfertigen, um die Größe der Partikel zu bestimmen. Exosomen sind zu klein, um mit herkömmlicher Mikroskopie oder Durchflusszytometrie nachgewiesen zu werden; diese Abbildung zeigt jedoch die Ergebnisse einer typischen Nanopartikel-Tracking-Analyse oder NTA von Exosomen, die Konzentration und Größenverteilung messen, wobei im Durchschnitt 97 Nanometer in dieser isolierten menschlichen Gallenprobe gemessen wurden.

Die Elektronenmikroskopie kann ebenfalls verwendet werden, um die Größe der isolierten Partikel in menschlicher Galle zu bestätigen, und diese Abbildung zeigt ein typisches Ergebnis der Transmissions-Elektronenmikroskopie. Diese Western Blots wurden auf Proteine untersucht, die in Exosomen angereichert sind, wie beispielsweise das Tetraspanin CD63 und Tsg101. Diese Echtzeit-Amplifikationskurve zeigt eine Vielzahl von mikroRNA-Spezies, die aus Exosomen der menschlichen Galle extrahiert wurden.

Da Exosome keine zuverlässigen Standards wie 18S- oder 28S-rRNA oder Housekeeping-Gene besitzen, ist das Hinzufügen eines synthetischen microRNA wichtig für die Normalisierung. Die Exos-Isolierungstechnik kann innerhalb von drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gallenflüssigkeit von Patienten oder Tieren gewinnt und verarbeitet, um extrazelluläre Vesikel zu isolieren und zu analysieren.

Während der Wiederholung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Probe vor dem Einfrieren bei minus 80 zuerst bei 500 G und vier Grad zu zentrifugieren, falls keine Ultrazentrifugation durchgeführt werden kann. Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie Untersuchungen zu microRNA angewandt werden, um zusätzliche Fragestellungen wie etwa microRNA-Profile zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Gallenflüssigkeit äußerst gefährlich sein kann, da sie Hepatitis enthalten könnte, und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Schutzbrille getroffen werden sollten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

Nach ihrer Entwicklung ebnete die Technik den Weg für die Forschung im Bereich des Cholangiokarzinoms, um extrazelluläre Vesikel als potenzielle Biomarker in Gallenflüssigkeit von Patienten mit Gallengangsproblemen wie einer Obstruktion des PSA zu untersuchen.