Name: Die Erzeugung von Orgelanlage Medien und Anwendungen für das Studium Organspezifische Einflüsse auf Brustkrebs Metastasiertem Verhalten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Erzeugung von Organ-konditionierten Medien aus Lymphknoten, Knochen, Lunge und Gehirn von Mäusen. Diese ex vivo Methode ermöglicht die Untersuchung organspezifischer Faktoren auf das Metastasierungsverhalten von Brustkrebzellen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Canadian Breast Cancer Foundation-Ontario Region, der Canada Foundation for Innovation (Nr. 13199) und Spenderunterstützung von John und Donna Bristol durch die London Health Sciences Foundation (an A.L.A.) unterstützt. Stipendien und Stipendien wurden vom Ontario Graduate Scholarship-Programm (Provinz Ontario, an G.M.P. und J.E.C.), dem Canada Graduate Scholarship-Master-Programm (an M.M.P.), dem Canadian Institutes of Health Research (CIHR)-Strategic Training Program (an M.M.P., G.M.P und J.E.C.) und der Pamela Greenaway-Kohlmeier Translational Breast Cancer Research Unit am London Regional Cancer Program (an M.M.P., G.M.P., J.E.C. und Y.X.). A.L.A. wird durch einen CIHR New Investigator Award und einen Early Researcher Award des Ministeriums für Forschung und Innovation von Ontario unterstützt.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Canadian Council on Animal Care durchgeführt, unter Protokolle, die von der Western University Tiergebrauch Subcommittee genehmigt. 1. Organ Isolation (Lunge, Gehirn, Knochen, Lymphknoten) <ol><li> Bereiten vier sterile 50 ml konische Röhrchen (eine für jedes Organ isoliert werden), die etwa 30 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Pre-wiegen jedes Röhrchen PBS eine elektronische Waage. </li><li> Euthanize 6-12 Wochen alten Maus durch CO 2 Inhalation. 2 min , oder bis die Maus nicht mehr bewegt und die Atmung - Mäuse sollte etwa 1 in der CO 2 Kammer gelassen werden. Erfolgreiche Euthanasie kann durch einen Mangel an Herzschlag bestätigt werden, wenn von Hand mit einem Finger überprüft. Vermeiden Sie Zervikaldislokation da diese Methode der Blutgefäße des Halses führt zu Schwierigkeiten entfernen axillären Lymphknoten können bersten. Hinweis: Frühere Arbeiten haben speziell verwendetgesunde weibliche Nacktmäuse HSD: Athymischen NUDE Foxn1 nu 13. </li><li> In einer sterilen Kultur Haube Gewebe, legen Sie die Maus auf dem Rücken auf einer Polystyrol-Schaumpolster, verteilt die Glieder und verwenden Stifte sie an ihrem Platz zu halten. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette und Schere, schneiden Sie die Bauchhaut an der Mittellinie an den Genitalien und nach oben in Richtung auf den Mund geschnitten. Ziehen Sie die Bauchhaut aus den Bauchmuskeln zurück und an Ort und Stelle auf dem Polystyrolschaumstoffpolster Pin. </li><li> Suchen Sie den axillären, brachial und Leistenlymphknoten. Anmerkung: Die Lymphknoten werden normalerweise von Fettgewebe umgeben ist. Die Leistenlymphknoten sind am einfachsten zu finden, wie sie oberflächlich an der Kreuzung von zwei Blutgefäße auf der nach hinten gezogen Bauchhaut zu finden sind. Axillary und brachial Lymphknoten befinden sich tiefer in das Gewebe und erfordern sanfte Rangieren von Gewebe. <ol><li> Nachdem Sie die Lymphknoten gefunden haben, verwenden Sie die Schere sanft und vorsichtig die Lymphe schneiden nichtdes von der Haut, Fett und Behälter und aus der Maus zu entfernen. Um zu bestätigen, richtige Präparation, rollen die Zange über das entfernte Gewebe. Wenn ein harter Klumpen besteht, wenn die Zange über das Gewebe rollt, dann hat ein Lymphknoten wahrscheinlich erfolgreich entfernt wurde. </li><li> Legen entfernt Lymphknoten in eiskaltem PBS. </li></ol></li><li> Mit Hilfe der Pinzette und Schere, öffnen Sie die Bauchhöhle durch in einer Aufwärtsbewegung in Richtung der Brust durch die freiliegenden Bauchwand zu schneiden. Vorsichtig durch das Brustbein geschnitten, die Brusthöhle ausgesetzt wird. </li><li> Suchen Sie die Blende unterhalb der Lunge und die Membran geschnitten. Es sollte sich an den Rippen aufgrund der Spannung ziehen. </li><li> Heben Sie die Lungen von unten und schneiden Sie das darunter liegende Gewebe in Richtung der Luftröhre. Dies ermöglicht die Lunge frei aus der Brusthöhle entfernt werden. Entfernen Sie das Herz und die Lunge en bloc und in eiskaltem PBS. Das Herz kann aus den Lungen hier oder nur entfernt werden, bevor in Schritt 2 wiegen. </li><li> Entferne dasStifte, auf dem Polystyrolschaumstoffpolster mit der Maus an Ort und Stelle zu halten. Drehen Sie die Maus über und schneiden Sie die Haut des unteren Rückens den ganzen Weg über von Flanke zu flankieren. </li><li> ein steriles Stück Gaze Mit dem Torso der Maus, ziehen Sie die Rückenhaut der Maus über die Beine und Füße der Maus zu halten. </li><li> Mit dem gleichen Stück steriler Gaze, halten Sie die Unterschenkel an Ort und Stelle, sorgfältig das Sprunggelenk des Maus-Fuß brechen und schälen die Haut über dem Gelenk proximal zu dem Kniegelenk. </li><li> Mit einer Schere, entfernen Sie die Tibia frei aus dem Kniegelenk und in eiskaltem PBS. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.11) bis 1,12) mit entgegengesetzten Glied. </li><li> Mit einer Pinzette, halten Sie die Oberschenkel an Ort und Stelle, wegschneiden die Schere umgebenden Muskelgewebe verwenden und den Oberschenkelknochen zu entfernen, es in eiskaltem PBS platzieren. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.14) mit entgegengesetzten Extremität. </li><li> Mit einem neuen Stück steriler Gaze, halten Sie den Kopf der Maus an Ort und Stelle. Mit einer Pinzette und Schere, entfernen Sie die Haut sanft die s aussetzenKull. Mit einer Schere schneiden Sie vorsichtig die Hinterhaupts Schädel von oben in der Mitte in einer geraden und nach unten Linie die hintere Gehirn aufzudecken. </li><li> Mit einer Pinzette, eine Schaufel unter dem Gehirn in Richtung der vorderen und entfernen Sie das gesamte Gehirn. Legen Sie das Gehirn in eiskaltem PBS. </li><li> Wiederholen der Schritte 1.1) bis 1,17) für mindestens vier Mäusen. </li></ol> 2. Organ Wiegen <ol><li> Nach Organ Isolation, wiegen jedes PBS Rohr Lungen- und Hirngewebe enthält eine elektronische Waage. </li><li> Berechnen Sie die Gewichtsdifferenz durch die Pre-Isolierung Gewicht subtrahiert (PBS nur) aus dem Gewicht des PBS Rohr + Organe (Lunge und Gehirn). </li><li> Bestimmung der Menge an Medien benötigt Gewebefragmenten aus dem berechneten Gewichtsunterschied zu resuspendieren. Hinweis: Lungen- und Hirngewebe sind Gewicht normalisiert durch Aufwirbelung in einem 4: 1 Medien: Gewebe-Verhältnis (vol / wt). </li></ol> 3. Erzeugung von Lungen- und Brain- Anlage Medien <ol><li> In einem sterilen tAusgabe Kultur Kapuze, invertieren Röhrchen PBS, die Lunge oder Gehirn dreimal aus Organen und absaugen PBS Blut enthält Restblut zu entfernen. Wiederholen Sie mit frischem, kaltem PBS, bis eine Lösung ohne Anzeichen von Blut klar erscheint. </li><li> Platzieren Sie Lungen und Gehirn in getrennten 60 mm 2 Petrischalen aus Glas. Mit Hilfe von zwei sterile Skalpellklingen, zerkleinern Lunge oder Gehirn durch hin und her immer wieder schneiden , bis die Gewebefragmente etwa ~ 1 mm 3 groß sind. </li><li> F12-Medien mit 1x konzentriert mitogen Ergänzung und Penicillin (50 &amp; mgr; g / ml) / Streptomycin (50 ug / ml) ergänzt: Resuspendieren Gewebefragmente in geeigneten Volumen an Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (zuvor im Schritt 2.3 bestimmt). </li><li> In resuspendierten Lunge oder Gehirn Gewebefragmente zu einer Vertiefung einer 6-Well-Platte. </li><li> Gewebefragmente in Medien Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Nach der Inkubation collect konditionierten Medien für jedes Gewebe und feitere verdünnt durch Zugabe von drei äquivalenten Volumina von frischem Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 1.000 xg in verdünnten konditionierten Medien für jedes Organ bei 4 ° C für 15 min große Gewebetrümmer zu entfernen. Sammeln Medienüberstand und filtriert durch einen 0,22 &amp; mgr; m Spritzenfilter. </li><li> Pool konditionierten Medien von jedem Organ (dh., Der Lunge mit Lunge und Gehirn mit Gehirn) von mehreren Mäusen zu berücksichtigen Maus-zu-Maus - Variabilität. Aliquotieren und Speichern von Medien bei -80 ° C bis zur Verwendung konditioniert. </li></ol> 4. Erzeugung von Knochenmark-konditionierten Medien <ol><li> In einer sterilen Kultur Kapuze Gewebe, schneiden überschüssige Gewebe aus dem Knochen und entfernen Epiphyse (Endstücke) aus den Knochen mit einer Schere. </li><li> Mit einem 27 ½ G-Nadel, bündig Markhöhle der Knochen durch Drücken 1 ml PBS durch das Zentrum eines jeden Knochen. Dies ermöglicht es Ihnen Stromazellen des Knochenmarks (BMSC) in ein frisches Röhrchen mit PBS zu sammeln. </li><li> Zentrifuge bei 1,000 × g für 5 min bei 4 ° C und waschen BMSC zweimal mit PBS. Resuspendieren Stromazellen des Knochenmarks in 20 ml Knochen Stroma-Zellwachstumsmedium (DMEM: F12-Medium mit 1x ergänzt konzentriert mitogen zu ergänzen, Penicillin (50 &amp; mgr; g / ml) / Streptomycin (50 ug / ml) und 10% fötalem Boven Serum (FBS) ). </li><li> Platte 10 ml resuspendiert Stromazellen des Knochenmarks in einem T75-Kolben. Hinweis: Kombinieren und Plattenzellen aus jeweils 2 Mäusen in jeder T75-Flasche; für vier Mäusen werden zwei T75 - Flaschen benötigt wird (etwa 1 x 10 7 Zellen / Kolben). </li><li> Inkubieren für 24 Zellwachstumsmedien bone stromal h bei 37 ° C und 5% CO 2 Stromazellen des Knochenmarks in. Nach der Inkubation entfernen Medien aus beiden T75-Flaschen und in neue T75-Flasche, beschriften Sie diese Flasche als &quot;Floater Flask&quot;. In frischen Knochen Stromazellen Wachstumsmedien zur vorherigen 2 - Kolben und Inkubation alle 3 - Kolben bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Nachdem die Zellen erreichen etwa 70% Konfluenz (ca. 5 bis 7Tage) Passage Zellen. Um dies zu tun, entfernen Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS (3 ml jeder Wäsche). Entfernen PBS und 3 ml Trypsin / EDTA-Lösung, dass Trypsin zu gewährleisten, die gesamte Oberfläche des Kolbens abdeckt. Nachdem die Zellen die Kolben abheben (~ 2 - 3 min), stoppen Trypsinierung Reaktion durch Zugabe von 3 ml Knochen Stromazellen Wachstumsmedien). Zentrifuge 900 xg für 5 min bei 4 ° C, verwerfen Medien und resuspendieren Zellen in 10 ml frischem Zellwachstum Medien Knochen Stroma. </li><li> Pool - Zellen aus allen Flaschen und Passage 1: 5 in drei neue T75 - Kolben und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2. Nachdem die Zellen wieder einmal 70% erreichen, wiederholen Sie die Schritte 4.6 und Pool und Passage alle anhaftenden Zellen ein zweites Mal. Re-Platte alle Zellen zu vier T75 - Kolben und Inkubation 37 ° C und 5% CO 2. Knochen Stroma-Zellwachstumsmedien sollten für alle Schritte verwendet werden. </li><li> Lassen Zellen Konfluenz erreichen, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und fügen Knochen Stromazellen Sammlung Medien (DMEM: F12-Medium + 1x konzentriert Mitogen supplement + Penicillin (50 &amp; mgr; g / ml) / Streptomycin (50 ug / ml); 10 ml / T75) und sicherstellen, dass diese Medien frei von FBS ist. Sammeln Knochenmark-konditionierten Medien 72 Stunden später, filtriert durch ein 0,22-um-Filter, Pool, aliquoten und bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Falls gewünscht, bestätigen Antikörper gegen Maus - Sca-1, CD105, CD29 und CD73, CD44, unter Verwendung von Standardtechniken Durchflusszytometrie den Phänotyp der isolierten Stromazellen des Knochenmarks (BMSC) unter Verwendung von 13 , wie zuvor beschrieben. </li></ol> 5. Generation von Lymph Node-konditionierten Medien <ol><li> zu entfernen Restblut aus Lymphknoten und absaugen blutigen PBS in einer sterilen Kultur Haube Gewebe, invertieren PBS Rohr Lymphknoten dreimal enthält. Wiederholen Sie mit frischem, kaltem PBS, bis eine Lösung ohne Anzeichen von Blut klar erscheint. </li><li> Legen Lymphknoten in 60 mm 2 Petrischalen aus Glas. Mit Hilfe von zwei sterile Skalpellklingen, zerkleinern Lymphknoten wiederholt hin und her, bis das Schneiden tissue Fragmente sind etwa 1 mm 3 in der Größe. </li><li> In einem konischen Rohr, resuspendieren Gewebefragmente in 10 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640) Medium mit Penicillin (50 &amp; mgr; g / ml) supplementiert / Streptomycin (50 ug / ml), 5 x 10 -5 M β-Mercaptoethanol sterile ( 1,75 &amp; mgr; l / 500 ml Medium) und 10% FBS. </li><li> Zentrifuge bei 900 × g für 5 min bei 4 ° C und Resuspendierung alle Zellen in 30 ml Medium. 5 ml Medium / Vertiefung in einer 6-Well - Platte und Inkubation für 7 Tage bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Nach der 7-tägigen Inkubation verwerfen Medien, waschen anhaftenden Zellen mit 5 ml warmem PBS und 5 ml frisches Medium zu jeder Vertiefung. Lassen Zellen bis zur Konfluenz wachsen (ca. 5-7 Tage), trypsinize, bündeln alle Zellen, und der Durchgang, wie in Schritt 4.6 beschrieben. Re-Platte Zellen bis 6-Well-Platte. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. </li><li> Nach drei Passagen erlauben Zellen bis zur Konfluenz, waschen Vertiefungen dreimal mit PBS und 2 ml / Vertiefung DMEM wachsen: F12 + 1xkonzentrierte mitogen Ergänzung und Penicillin (50 &amp; mgr; g / ml) / Streptomycin (50 ug / ml), um sicherzustellen, dass dieses Medium frei von FBS ist. Sammeln Lymphknoten-konditionierten Medien nach 72 h, Pool, aliquoten und bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Falls gewünscht, kann bestätigen , Antikörper gegen Maus CD45 und gp38, unter Verwendung von Standard - Durchflusszytometrie Techniken , um den Phänotyp der isolierten Lymphknoten Stromazellen (LNSC) unter Verwendung von wie zuvor 13 beschrieben. </li></ol> 6. Verwendung von Organ-konditionierten Medien für Downstream-Assays mit Bezug zu Metastasiertem Verhalten von Krebszellen <ol><li> Sobald die organ konditionierten Medien wurde wie beschrieben erzeugt in den Schritten 1 bis 5, verwenden sie verschiedene Downstream Zell- und Molekularbiologie Assays durchzuführen, um den Einfluss der löslichen organ abgeleiteten Faktoren auf das metastatische Verhalten von Krebszellen zu bestimmen. Beispiele von Standardassays ( an anderer Stelle in der Literatur beschrieben) umfassen Protein - Arrays 13, das Zellwachstum Assays &lt;sup&gt; 13, Zellmigration Assays 13, tumorsphere Bildung 14 und RT-PCR 15. Die ursprüngliche Basismedium verwendet , um die organ konditionierte Medien zu erzeugen (dh unconditioned DMEM. F12 Medium mit 1x Ergänzung konzentriert Mitogen ergänzt und Penicillin (50 &amp; mgr; g / ml) / Streptomycin (50 ug / ml) als Negativkontrolle verwendet werden , . </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Metastasierung ist ein komplexer Prozess , bei dem eine Reihe von zellulären Ereignissen letztlich für Gewebe verantwortlich sind , Invasion und entfernten Tumor Einrichtung 4,30,31. Die ex vivo Modellsystem hier präsentiert werden können genutzt zu studieren zwei wichtige Aspekte des metastasierten Progression: Krebszelle Homing oder Migration auf ein bestimmtes Organ ( &quot;getting there&quot;) und das Wachstum in diesem Organ ( &quot;dort wachsen&quot;). Viele Studien haben sich auf die Ermittlun...

Brustkrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebs bei Frauen und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle 1. Brustkrebs hohe Mortalitätsrate ist vor allem auf das Scheitern der konventionellen Therapie zu lindern und Metastasen zu beseitigen; etwa 90% der durch Krebs verursachten Todesfälle sind auf Metastasen 2. die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der metastatischen Kaskade zu verstehen, ist sowohl von größter Bedeutung für die Entwicklung von Therapeutika in wirksamen frühen und späten Stadium von Brustkrebs. Frühere Forschung hat die vielstufige Natur der Metastasierung von Brustkrebs geholfen aufzuklären und es wird vermutet , dass das Ergebnis sowohl der Tumorprogression und Metastasierung auf Wechselwirkungen zwischen Krebszellen weitgehend abhängig ist und der Host - Umgebung 3. Klinische Beobachtungen zeigen , dass viele Krebsarten Organtropismus anzuzeigen, dh., Die Neigung vorzugsweise an spezifischen metastasieren organs.In der case von Brustkrebs breitet sich ein Patient die Krankheit in der Regel oder metastasiert bis 5 wichtigsten Sehenswürdigkeiten, wie der Knochen, Lunge, Lymphknoten, Leber und Gehirn 4-6. Viele Theorien wurden entwickelt, um diesen Prozess zu erklären, aber nur wenige haben den Test der Zeit überstanden. Ewing Theorie der Metastasierung, in den 1920er Jahren vorgeschlagen, die Hypothese aufgestellt dassdie Verteilung der Metastasierung auf mechanische Faktoren streng zurückzuführen war; wodurch Tumorzellen im ganzen Körper durch normale definierten physiologischen Blutflussmuster und einfach verhaften in der ersten kapillaren Bett getragen werden , stoßen sie auf 7. Im Gegensatz dazu 1889 Stephen Paget &quot;Saatgut und Boden&quot;, schlug Hypothese, dass zusätzliche molekulare Wechselwirkungen für das Überleben und das Wachstum von Metastasen verantwortlich waren, wobei Krebszellen ( &quot;Samen&quot;) sich nur etablieren können und proliferatein Organ Mikroumgebungen, die entsprechenden molekularen Faktoren ( &quot;Boden erzeugen 8 &quot;). Fast ein Jahrhundert später, Leonard Weiss unternahm eine Meta-Analyse von zuvor Autopsie Daten veröffentlicht und bestätigt Ewing-Vorhersage, dass viele Metastasen zum Zeitpunkt der Autopsie festgestellt wurden in den zu erwartenden Verhältnissen gefunden, dass, wenn metastasierendem Organtropismus wurde durch Blutflussmuster allein bestimmt zu erwarten wäre. Doch in manyinstances gab es weniger oder mehr Metastasen an bestimmten Stellen gebildet , dann würde durch Ewing vorgeschlagene mechanische Faktoren 9 zu erwarten. Diese Konten und Theorien besagen, dass bestimmte Organ Mikroumgebungen spielen eine entscheidende Rolle bei der Verbreitung Muster und das anschließende Wachstum und das Überleben von vielen Krebsarten, einschließlich Brustkrebs. Frühere Forschungsanstrengungen haben sich hauptsächlich auf Tumorzellen abgeleitet Faktoren konzentriert und ihren Beitrag zur Organtropismus bei Brustkrebs Metastasen beobachtet 10-12, jedoch wenig Forschung erforscht Faktoren aus dem Organ Mikro abgeleitet , die eine günstige Nische für die Einrichtung zur Verfügung stellen kannvon Brustkrebs Metastasen. Dies ist im Wesentlichen auf die technischen Herausforderungen der Komponenten des Organs Mikroumgebung in vitro zu studieren. Der aktuelle Artikel beschreibt ein umfassendes ex vivo Modellsystem zur Untersuchung des Einflusses von löslichen Bestandteilen des Lymphknotens studieren, Knochen, Lunge und Gehirn auf dem metastatischen Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen. Frühere Studien haben dieses Modellsystem validiert durch den Nachweis , dass verschiedene Brustkrebszelllinien Zelllinie spezifische und organspezifische bösartige Verhalten als Reaktion auf organ konditionierten Medien angezeigt werden , die auf ihre in vivo Metastasepotential 13 entspricht. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um lösliche Faktoren zu identifizieren und zu bewerten spezifischen organ abgeleitet, die eine Rolle bei der metastatischen Verhaltens von Brustkrebs und anderen Arten von Krebszellen, einschließlich Einflüsse auf das Wachstum, der Migration spielen kann, stielartigen Verhalten und Genexpression, sowie die Identifizierung vonmögliche neue therapeutische Ziele für Krebs. Dies ist das erste ex vivo Modellsystem , das verwendet werden kann , organspezifische metastatischen Verhalten im Detail zu untersuchen und die Rolle der organ abgeleiteten löslichen Faktoren in den Antrieb der Prozess der Krebsmetastasen zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>50 ml konische Röhrchen</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>339652</td><td>Steril halten</td></tr><tr><td>1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>Nacktmäuse steril halten</td></tr><tr><td></td><td>Harlan Laboratories</td><td>Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu</td><td>Anwendung im Alter von 6 - 12 Wochen</td></tr><tr><td>Polystyrolschaumkissen</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zu diesem Zweck kann der weggeworfene Deckel (~ 4 x 8 Zoll oder größer) eines Versandbehälters aus Polystyrolschaum verwendet werden. Durch Abwischen mit Ethanol sterilisieren.</td></tr><tr><td>Pinzetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td> Steril <td>halten</td></tr><tr><td>Scheren</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>Steril halten</td></tr><tr><td>Gaze-Pads</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td>Steril halten</td></tr><tr><td>60 mm2 Petrischalen aus Glas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7016560</td><td>Steril halten</td></tr><tr><td>Skalpellklingen</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95937A</td><td>Steril halten</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td>Warm bei 37 ° C C Wasserbad vor Gebrauch, steril halten&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Mito + Serum Extender</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td>Im Manuskript als "konzentriertes Mitogen-Supplement" bezeichnet. Steril halten</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Steril halten</td></tr><tr><td>Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Warm in 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch, steril halten&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051-500ML</td><td>Steril halten</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA-Lösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R-001-100</td><td>Warm in 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch, steril halten&nbsp;</td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturplatten</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>140675</td><td>Steril halten</td></tr><tr><td>0,22 μ; m Spritzenvorsatzfilter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359904</td><td>Steril halten</td></tr><tr><td>T75 Gewebekulturkolben</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>178905</td><td>Steril halten</td></tr><tr><td>Transwells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3464</td><td>Steril halten, Verwendung für Migrationsassays</td></tr><tr><td>Anti-Maus Sca-1</td><td>R& D Systems</td><td>FAB1226P</td><td>Einsatz bei 10 & micro; l/106 Zellen</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD105</td><td>R& D Systems</td><td>FAB1320P</td><td>Einsatz bei 10 & micro; l/106 Zellen</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD29</td><td>R& D Systems</td><td>FAB2405P-025</td><td>Einsatz bei 10 & micro; l/106 Zellen</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD73</td><td>R& D Systems</td><td>FAB4488P</td><td>Einsatz bei 10 & micro; l/106 Zellen</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD44</td><td>R& D Systems</td><td>MAB6127-SP</td><td>Einsatz bei 0,25 &; Mikro; g/106 Zellen</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>Anwendung bei 5 &; micro; l/106 Zellen</td></tr><tr><td>Anti-Maus gp38</td><td>eBioscience</td><td>12-5381-80</td><td>Anwendung bei 10 & Mikro; l/106 Zellen</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250&nbsp;</td><td>Steril halten</td></tr><tr><td>Protein-Arrays</td><td>RayBiotech Inc.</td><td>AAM-BLM-1-2</td><td>1 Array pro Medienbedingung (einschließlich Negativkontrolle) in dreifacher Ausführung</td></tr></tbody></table> verwenden

die erzeugung von orgelanlage medien und anwendungen für das studium organspezifische einflüsse auf brustkrebs metastasiertem verhalten

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

Brustkrebs metastasiert bevorzugt in den Lymphknoten, Knochen, Lunge, Gehirn und Leber bei Brustkrebspatientinnen. Frühere Forschungsbemühungen konzentrierten sich auf die Identifizierung von Faktoren, die Brustkrebszellen inhärent sind und für dieses beobachtete Metastasierungsmuster (den sogenannten Organtropismus) verantwortlich sind, jedoch ist viel weniger über Faktoren bekannt, die in bestimmten Organen vorhanden sind und zu diesem Prozess beitragen. Dies ist zum Teil auf einen Mangel an In-vitro-Modellsystemen zurückzuführen, die die Mikroumgebung des Organs genau rekapitulieren. Um dies zu adressieren, wurde ein ex vivo-Modellsystem etabliert, das die Untersuchung löslicher Faktoren ermöglicht, die in verschiedenen Organmikroumgebungen vorhanden sind. Dieses Modell besteht aus der Erzeugung konditionierter Medien aus Organen (Lymphknoten, Knochen, Lunge und Gehirn), die von normalen athymischen Nacktmäusen isoliert wurden. Das Modellsystem wurde validiert, indem gezeigt wurde, dass verschiedene Brustkrebszelllinien zelllinien- und organspezifisches malignes Verhalten als Reaktion auf organkonditionierte Medien zeigen, das ihrem in vivo metastasierenden Potenzial entspricht. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um spezifische lösliche Faktoren aus Organen zu identifizieren und zu bewerten, die eine Rolle beim Metastasierungsverhalten von Brust- und anderen Krebszellen spielen können, einschließlich Einflüssen auf Wachstum, Migration, stammartiges Verhalten und Genexpression, sowie zur Identifizierung potenzieller neuer therapeutischer Ziele für Krebs. Dies ist das erste ex vivo-Modellsystem, das verwendet werden kann, um organspezifisches Metastasierungsverhalten im Detail zu untersuchen und die Rolle spezifischer organabgeleiteter löslicher Faktoren bei der Steuerung des Prozesses der Krebsmetastasierung zu bewerten.

Die Erzeugung von Orgelanlage Medien Ein Übersichtsdiagramm / schematische Darstellung des Prozesses der organ Isolierung und Erzeugung von konditionierten Medien ist in Abbildung 1, mit repräsentativen photographischen Bildern des Verfahrens in Figur 2 gezeigt dargestellt. Es ist zu beachten , dass , wenn dieses Protokoll zunächst in der Entwicklung war, Leber aufgenommen wur...

Dieses Manuskript beschreibt ein ex vivo-Modellsystem, das aus organkonditionierten Medien besteht, die aus dem Lymphknoten, dem Knochen, der Lunge und dem Gehirn von Mäusen stammen. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um aus Organen gewonnene lösliche Faktoren und ihre Auswirkungen auf den Organtropismus und das Metastasierungsverhalten von Krebszellen zu identifizieren und zu untersuchen.

Die Erzeugung von Orgelanlage Medien und Anwendungen für das Studium Organspezifische Einflüsse auf Brustkrebs Metastasiertem Verhalten

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, konditioniertes Medium unter Verwendung von Mäuselymphknoten, Knochen, Lungen und Gehirnen zu erzeugen, um lösliche, organstammende Faktoren und ihre Auswirkungen auf das metastatische Verhalten von Krebszellen zu identifizieren und zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Metastasierung zu beantworten, beispielsweise: Wie beeinflussen organspezifische Faktoren das Wachstum, die Migration und die Genexpression von Krebszellen? Das Verfahren bietet eine einfache ex vivo-Plattform, die repräsentativ für organspezifische, in vivo vorkommende lösliche Faktoren ist und das Phänotyp und Verhalten von Krebszellen beeinflusst. Um die Lymphknoten zu isolieren, platzieren Sie zunächst eine sechs bis zwölf Wochen alte Maus auf einer Polystyrolschaumplatte in einer sterilen Zellkulturhaube und befestigen Sie die Gliedmaßen in ausgestreckter Position. Verwenden Sie anschließend Pinzette und Schere, um einen medianen Schnitt in der Bauchhaut von den Genitalien bis zum Mund vorzunehmen. Ziehen Sie danach vorsichtig die Haut von den Bauchmuskeln ab und befestigen Sie sie mit Nadeln an der Präparationsunterlage. Entfernen Sie mit einer Schere vorsichtig die Lymphknoten von Haut, Fett und Gefäßen und legen Sie die Knoten beim Sammeln in 30 Milliliter eiskaltes PBS. Wenn alle Lymphknoten gesammelt wurden, schneiden Sie mit Pinzette und Schere vorsichtig durch die freigelegte Bauchwand in Richtung Sternum, um die Brusthöhle freizulegen. Durchtrennen Sie das Zwerchfell.Heben Sie die Lungen von unten an und schneiden Sie das darunterliegende Gewebe in Richtung der Luftröhre. Überführen Sie anschließend die Lungen in einen neuen Behälter mit eiskalter PBS. Das Herz kann in diesem Schritt oder vor der Organwiegung von den Lungen entfernt werden.Um die Beinknochen zu gewinnen, platzieren Sie die Maus in Bauchlage und schneiden Sie die Haut quer über den unteren Rücken von einer Flanke zur anderen. Verwenden Sie danach ein steriles Stück Mullbinde, um den Rumpf sowie die Haut über den Beinen und Füßen zu erfassen. Halten Sie mit demselben Mullstück das Unterschenkelbein fest, während Sie vorsichtig das Sprunggelenk eines Fußes lösen, und ziehen Sie die Haut über dem Gelenk proximal in Richtung Knie zurück.Danach mit einer Schere die Tibia vom Kniegelenk entfernen und den Beinknochen in eiskaltem PBS platzieren. Nach der Gewinnung der zweiten Tibia den Femur mit einer Pinzette fixieren und mit der Schere das umgebende Muskelgewebe abschneiden. Anschließend den Beinknochen in eiskaltem PBS platzieren.Um das Gehirn zu entnehmen, verwenden Sie ein neues Stück steriler Gaze, um den Kopf zu halten, und entfernen Sie vorsichtig mit einer Schere und einer Pinzette die Haut, um den Schädel freizulegen. Verwenden Sie anschließend die Schere, um vom oberen Mittelpunkt des Schädels aus gerade nach unten entlang des Hinterhauptbeins zu schneiden, um das hintere Gehirn freizulegen. Heben Sie dann das Gewebe vorsichtig unterhalb des vorderen Schädels an und überführen Sie das gesamte Gehirn in eiskaltes PBS.Um das lungengestützte Kulturmedium zu erzeugen, drehen Sie die Röhrchen mit Lungenmaterial dreimal um, um restliches Blut aus den Organen zu entfernen. Anschließend ersetzen Sie die Waschflüssigkeit durch frisches, kaltes PBS und wiederholen diesen Schritt, bis die Kochsalzlösung blutfrei ist. Danach überführen Sie die Lungen in eine 60 Quadratmillimeter große Glas-Petri-Schale pro Maus und zerkleinern das Gewebe mithilfe von zwei sterilen Skalpellen durch wiederholtes Hin- und Herschneiden. Wenn die Gewebefragmente eine Größe von etwa einem Kubikmillimeter haben, werden die Stücke in dem entsprechenden Volumen an DMEM:F12-Medium, das mit Antibiotika ergänzt wurde, erneut suspendiert und die Gewebe pro Maus in einer Vertiefung einer sechswelligen Platte bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2 inkubiert. Nach 24 Stunden werden die gesamten Inhalte jeder Vertiefung in einzelne kegelförmige 50-Milliliter-Röhrchen überführt und das konditionierte Medium pro Röhrchen mit drei äquivalenten Volumina frischem DMEM:F12-Medium verdünnt. Die Röhrchen werden zentrifugiert, um eventuelle große Gewebereste zu entfernen.Anschließend das konditionierte Medium über ein 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter in ein einzelnes 50-Milliliter-Konischgefäß sammeln. Um konditioniertes Knochenmarkmedium herzustellen, die Knochen unter einer sterilen Gewebekulturhaube transferieren und überschüssiges Gewebe vom Knochen entfernen. Mit einer Schere die Epiphysen entfernen.Verwenden Sie anschließend eine Nadel mit einer Größe von 27,5, um einen Milliliter PBS durch die Markhöhle jedes Knochens in ein Gefäß mit frischem PBS zu spülen. Nachdem alle Knochenmarksstromazellen gesammelt wurden, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Nach dem letzten Waschschritt resuspendieren Sie das Pellet in 20 Milliliter Knochenstromazell-Wachstumsmedium, das mit 10 % fetalem Kälberserum ergänzt ist, und säen Sie jeweils 10 Milliliter Zellen pro T75-Flasche aus.Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 70 % erreicht haben, spülen Sie die Kulturen zweimal mit je drei Milliliter PBS. Heben Sie anschließend die Zellen mit drei Milliliter einer 0,025 %igen Trypsin/EDTA-Lösung ab, wobei darauf zu achten ist, dass die gesamte Flächen des Kolbens von der Trypsinlösung bedeckt wird. Nach zwei bis drei Minuten beenden Sie die enzymatische Reaktion durch Zugabe von drei Milliliter Knochen-Stromazellen-Wachstumsmedium und sammeln die Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen.Zentrifugieren Sie die Zellen. Suspendieren Sie das Pellet anschließend in 10 Milliliter frischem Medium. Überführen Sie die Zellen nun im Verhältnis 1:5 in drei neue T75-Flaschen, bis sie eine Konfluenz von 70 % erreichen.Anschließend die Zellen dreimal mit PBS wie eben gezeigt waschen und die Kulturen 72 Stunden lang mit einem serumfreien Sammelmedium für Stromazellen, das mit Mitogen und Antibiotika ergänzt ist, versorgen. Nach dem dritten Kulturtag das Medium durch einen 0,22-Mikron-Filter abfiltrieren. Die Stromazellen sollten in der Kultur anhaftend sein, wobei in den Stromazellkulturen aus Lymphknoten eine langgestreckte, fibroblastenähnliche Morphologie beobachtet wird, während die Knochenmark-Stromazellkulturen eine kleinere und rundere Morphologie aufweisen.Die Durchflusszytometrie-Analyse bestätigt, dass die lymphatischen Stromazellen überwiegend CD45-negativ und gp38-positiv sind. Knochenmark-Stromazellen sollten positiv für CD-44 und CD-29, schwach positiv für CD-105 und Sca-1 sowie negativ für CD-73 sein. Menschliche Brustkrebszellen mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen weisen unterschiedliche Migrations- und Wachstumsmuster gegenüber spezifischen Organbedingungen auf.Beispielsweise migriert in diesem repräsentativen Experiment die knochenaffine Variante 231-BoM bevorzugt in das konditionierte Knochenmarkmedium gegenüber den konditionierten Medien von Gehirn und Lunge. Ebenso migriert die lungensuchende Variante 231-LM2 bevorzugt in das konditionierte Lungenmedium gegenüber den konditionierten Medien von Knochenmark und Gehirn. Weiterhin zeigt die Echtzeit-qPCR-Analyse, dass die Exposition der parenteralen MDA-MB-231-Brustkrebszellen gegenüber konditioniertem Medium aus Knochenmark oder Lunge eine Hochregulation der Gene induziert, die mit knochen- oder lungenspezifischen Metastasen der Brustkrebszellen in vivo assoziiert sind.Wenn die Gewebegewinnung und die Einrichtung des konditionierten Mediums einmal beherrscht sind, können sie bei sachgemäßer Durchführung in zwei bis drei Stunden abgeschlossen werden. Die Subkultivierungsschritte an den folgenden Tagen benötigen 15 bis 30 Minuten pro Tag. Während der Durchführung dieser Verfahren ist es wichtig, stets daran zu denken, dass alles steril gehalten werden muss.Nach der Herstellung des konditionierten Mediums können weitere Methoden wie Proteinarrays, Zellwachstums- und Migrationsassays, Tumorsphärenbildung und RT-PCR durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Wirkung organspezifischer Faktoren auf das Verhalten von Krebszellen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern im Bereich der Brustkrebsforschung den Weg, um organspezifisches metastatisches Verhalten in einem ex vivo-Modellsystem zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man konditionierte Medien unter Verwendung der Knochen, Lungen und Gehirne von Mäusen herstellt.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit scharfen Dissektionswerkzeugen gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, beispielsweise durch die Anwendung einer präzisen und sorgfältigen Dissektionstechnik, während dieses Verfahrens.

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Dieses Video beschreibt eine Methode zur Erzeugung eines organkonditionierten Mediums, das aus der Leber der Maus gewonnen wurde. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um aus Organen gewonnene lösliche Faktoren und ihre Auswirkungen auf den Organtropismus und das Metastasierungsverhalten von Krebszellen zu identifizieren und zu untersuchen.

Organkonditioniertes Medium: Erzeugung von Medium aus entnommenen Organzellen für metastasierende Krebsstudien

Primärzellkultur unter Verwendung von intaktem Gewebe Organoiden stellt ein Modellsystem, das die multizellulären Mikroumgebung in vivo nachahmt. Wir entwickelten ein Serum-freien Primär Brustepithel Gewebekulturmodell, das gemischte Zellkultur-Linien und Exponate differenzierte Morphologie perpetuiert, ohne enzymatische Gewebezerstörung. Breast Organoiden lebensfähig bleiben für&gt; 6 Monate.

Nicht-enzymatische, Serumfreie Zellkultur von Pre-invasive Brustläsionen für Spontane Erzeugung Mammospheres

Protokolle für die Untersuchung Brustkrebs-Zellmigration, Proliferation und Kolonisierung in menschlichen Knochengewebe Explantation Modellsystem beschrieben.

Verfahren zur Kultivierung humaner Femur Gewebeexplantaten an Brustkrebs Zellbesiedlung des metastasierten Niche Studieren

Organoide, die sich aus den Meeressammrissen entwickelten, wurden bestrahlt und charakterisiert, um epitheliale Merkmale und Wechselwirkungen mit Immunzellen zu beurteilen. Bestrahlte Organoide können verwendet werden, um Wechselwirkungen mit Zellen besser zu bewerten, die zu der Rekrutierung von Tumorzellen in bestrahltem normalem Gewebe führen können.

Wachstum und Charakterisierung der bestrahlten Organoide aus den Brustdrüsen

Wir zeigen eine Methode zur Nekropsie und Zerlegung von Prostatakrebsmodellen der Maus, die sich auf die Prostatatumorsektion konzentriert. Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Erzeugung von Maus-Prostatatumor-Organoiden wird ebenfalls vorgestellt.

Generierung von Tumororganoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs

Ein Protokoll zur Erzeugung menschlicher primärer Endometrium-Organoide, die aus epithelialer und stromaler Zellen bestehen und Eigenschaften des nativen Endometriumgewebes beibehalten, wird vorgestellt. Dieses Protokoll beschreibt Methoden von der Erfassung des Gebärmuttergewebes bis zur histologischen Verarbeitung von Endometriumorganoiden.

Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden

Die Brustdrüse ist eine zweischichtige Struktur, die äußere myoepitheliale und innere luminale Epithelzellen umfasst. Präsentiert ist ein Protokoll zur Vorbereitung von Organoiden mit Differential-Trypsinisierung. Diese effiziente Methode ermöglicht es Forschern, diese beiden Zelltypen getrennt zu manipulieren, um Fragen über ihre Rolle in der Form und Funktion der Brustdrüse zu untersuchen.

Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Das Manuskript beschreibt eine Methodik für die Etablierung sowie das longitudinale Wachstumsmonitoring von spontanen Lungenmetastasen von orthotopisch injizierten Brusttumoren, die in allen Stadien der Metastasierungskaskade interveniert werden kann.

Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

In diesem Protokoll wird ein Ansatz zur Erzeugung von Epithelorganoiden aus primärem Normal- und Tumorbrustgewebe durch differentielle Zentrifugation erörtert. Darüber hinaus sind Anleitungen für die dreidimensionale Kultivierung sowie die Immunfluoreszenz-Bildgebung von eingebetteten Organoiden enthalten.

Erzeugung und Bildgebung von Epithelorganoiden von Mäusen und Menschen aus normalem und Tumor-Brustgewebe ohne Passaging

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Etablierung von humanen Brustorganoiden aus patienteneigenen Brusttumorresektionen oder normalem Brustgewebe bereitgestellt. Das Protokoll enthält eine umfassende Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Kultivieren, Einfrieren und Auftauen von Brustorganoiden aus menschlichen Patienten.

Etablierung und Kultivierung von patienteneigenen Brustorganoiden

Erfahren Sie die Erzeugung von Organ-konditionierten Medien aus Lymphknoten, Knochen, Lunge und Gehirn von Mäusen. Diese ex vivo Methode ermöglicht die Untersuchung organspezifischer Faktoren auf das Metastasierungsverhalten von Brustkrebzellen.

Die Erzeugung von Orgelanlage Medien und Anwendungen für das Studium Organspezifische Einflüsse auf Brustkrebs Metastasiertem Verhalten (Video) | JoVE Journal

Die Erzeugung von Orgelanlage Medien und Anwendungen für das Studium Organspezifische Einflüsse auf Brustkrebs Metastasiertem Verhalten

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