Die Injektion von syngenen murinen Melanomzellen ihre metastatische Potential in der Lunge zu bestimmen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Methode zur Herstellung von metastasierenden Tumoren in schwarzen sechs Mäusen zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Immuntherapie zu beantworten, z. B. wie Untersuchungsmittel die Immunantwort in der Lunge beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Metastasen vernimmt.

Die Ergebnisse sind also zuverlässig und relativ konsistent. Zu Beginn werden Kulturen von B16-BL6-Melanomzellen, die eine Konfluenz von etwa 70 % aufweisen sollten, in eine sterile Haube gegeben. Geben Sie anschließend einen Milliliter 05%iges Trypsin-EDTA in jede Schale und lassen Sie die Zellen eine Minute lang stehen.

Nachdem Sie diese Lösung aspiriert haben, fügen Sie jeder Platte einen Milliliter Trypsin hinzu und geben Sie die Zellen dann wieder in den Inkubator. Bringen Sie die Zellen nach 10 Minuten in eine sterile Haube und geben Sie vier Milliliter serumfreies RPMI-Medium auf jede Platte. Sammeln Sie dann die Zellen mit einer sterilen motorisierten Pipette.

Um Klumpen aufzulösen, die die Auswurfnadel möglicherweise verstopfen könnten, drücken Sie die Spitze der Pipette gegen den Boden der Platte und stoßen Sie die Zellen aus. Nachdem Sie diesen Vorgang mehrmals wiederholt haben, sammeln Sie die Zellen wieder und geben Sie sie in ein konisches Röhrchen von 15 Milliter. Entnehmen Sie dann eine Probe der Zellsuspension, geben Sie sie in ein Hämozytometer und bestimmen Sie die Zelldichte.

Verteilen Sie die Zellsuspension gleichmäßig auf vier 15-Milliliter-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen und dekantieren anschließend den Überstand. Fahren Sie fort, jedes der Röhrchen mit einer anderen Zelldichte zu markieren – 0,063, 0,125, 0,25 oder 0,5 Millionen Zellen pro Milliliter.

Geben Sie dann ein angemessenes Volumen an freiem Serum-RPMI zu jedem Konus, um diese Endkonzentrationen zu erzeugen. Bestätigen Sie die gewünschten Zelldichten mit einem Hämozytometer. Als nächstes verteilen Sie 500 Mikroliter jeder Suspension in markierte 1,8-Milliliter-Röhrchen, die auf Eis gelegt werden.

Nachdem alle B16-BL6-Zellsuspensionen vorbereitet wurden, wählen Sie eine Maus aus. Halten Sie es am Schwanz fest und führen Sie das Tier mit dem Hinterteil voran in einen Rückhaltebehälter. Wenn sich der Oberkörper der Maus in der Hauptkammer und ihr Schwanz außerhalb des Geräts befindet, ziehen Sie das Tier zum Ende des Fixiergeräts.

Setzen Sie dann den Kolben ein und drücken Sie weiter auf den Kolben, bis die Maus fest sitzt. Sobald das Tier an Ort und Stelle ist, drehen Sie die Maus um 90 Grad, so dass eine der seitlichen Schwanzvenen nach oben zeigt. Reinigen Sie dann mit einem Alkoholpad die Seite des Mausschwanzes, an der die Vene am sichtbarsten ist, kräftig.

Zur Vorbereitung der Injektion sammeln Sie zunächst 300 Mikroliter der 0,5 Millionen Zellen pro Milliliter Suspension in einer Spritze. Werfen Sie anschließend Blasen aus der Spritze aus, indem Sie sie umdrehen, mit der Seite schnippen und den Kolben drücken. Sobald die Blasen entfernt wurden, werfen Sie die Zellkultur aus, um ein endgültiges Volumen von 250 Mikrolitern in der Spritze zu erhalten.

Fahren Sie fort, den Mausschwanz mit der nicht-dominanten Hand zu verlängern. Halten Sie ihn so, dass der Zeigefinger das proximale Ende des Schwanzes anhebt und der Daumen den distalen Teil drückt. Führen Sie die Nadel mit der dominanten Hand in einem winzigen Winkel nach unten in die Vene in Richtung des distalen Endes des Schwanzes ein.

Führen Sie dann die Nadel weiter ein und stellen Sie sie so ein, dass sie dem Winkel der Schwanzvene entspricht. Nachdem die Nadel etwa einen Zentimeter in die Schwanzvene eingeführt wurde, beginnen Sie, den Kolben zu drücken, während Sie die Spritze ruhig halten. Stoppen Sie Blutungen, indem Sie Gaze gegen die Eintrittsstelle halten.

Sobald die Zellsuspension ausgestoßen wurde, entfernen Sie die Nadel aus der Vene und entsorgen Sie sie. Entfernen Sie als Nächstes den Kolben aus dem Rückhaltesystem und legen Sie die Maus in einen Empfängerkäfig. Dieses Protokoll zielte darauf ab, die optimale Anzahl von B16-BL6-Zellen zu identifizieren, die injiziert werden sollten, um ein nützliches Modell für metastasiertes Melanom zu erstellen.

Hier sind experimentelle Herde dargestellt, die durch Pfeile angezeigt werden, die sich zwei bis drei Wochen nach der Injektion von fünf verschiedenen Zelldichten in der Lunge bilden. Wenn 500.000 Zellen pro Milliliter injiziert wurden, bedeckten die Herde die Lunge vollständig. In dem hier gezeigten Beispiel wurden 102 Herde gezählt.

Im Gegensatz dazu war die Lunge nur spärlich mit Herden bedeckt, wenn 62.500 Zellen pro Milliliter bzw. 125.000 Zellen pro Milliliter injiziert wurden. Diese Dichten führten zu einer Anzahl von Lungenherden von eins und 17. Mit dieser Methode wurde festgestellt, dass die optimale Konzentration der zu injizierenden Zellen 250.000 Zellen pro Milliliter betrug.

Diese Dichte führte zu Lungen mit etwa 65 Herden, eine Anzahl, bei der die Organe weder vollständig noch zu spärlich von Herden bedeckt waren. Eine weitere Aufzählung dieser Daten zeigt eine annähernd lineare Beziehung zwischen Lungenherden und einer Zellkulturdichte von über 125.000 Zellen pro Milliliter, wie hier gezeigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als einer Stunde durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der Mäuse, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Beim Versuch des Eingriffs ist es wichtig, daran zu denken, zu versuchen, eine entsprechende Anzahl von Zellen pro Maus zu injizieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden durchgeführt werden, wie z. B. die Verabreichung von Medikamenten, um Fragen zu beantworten, wie sich potenzielle Therapien auf eine Reihe von resultierenden Herden auswirken. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Krebsforscher, die Bestandteile von metastasierendem Krebs beim Melanom bei sechs schwarzen Mäusen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man B16-BL6-Zellen sammelt und vorbereitet, Mäuse zurückhält, Nadeln vorbereitet und eine entsprechende Anzahl von Zellen in jede Schwanzvene injiziert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Säugetierkulturen und Nadeln äußerst gefährlich sein kann und dass immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Vermeiden von Nadelstichen und das Tragen von Schutzausrüstung.