Expression und Reinigung von virusähnlichen Partikeln zur Vakzinierung

Hier stellen wir ein Protokoll für die Synthese von virusähnlichen Partikeln entweder Baculovirus oder Säuger-Expressionssystemen und Ultrazentrifugation Reinigung. Dieser hochgradig anpassbare Ansatz wird verwendet, um virale Antigene als Impfstoff Ziele in eine sichere und flexible Art und Weise identifizieren.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Aufreinigung von virusähnlichen Partikeln (VLPs), die von Säugetier- oder Insektenzellexpressionssystemen exprimiert und sezerniert werden. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich eines Impfstoffs beantworten, z. B. wie konformationsrelevante virale Antigene auf sichere und flexible Weise exprimiert und gereinigt werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass keine Proteinfällung mit Polyethylenglykol oder die Vorbereitung von Schichten mit mehreren Dichten zur Konzentration von VLPs erforderlich ist.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Identifizierung viraler Antigene als Impfstoffziele geben kann, können VLPs auch als Werkzeuge für die Krankheitsdiagnose und Serologie verwendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da eine Glycerinunterlage in VLP-Resuspensionsschritten schwer zu erlernen ist, da Anfänger möglicherweise nicht die richtige Technik anwenden. Bereiten Sie am Tag der Transvektion Liposomen- und DNA-Lösungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers vor.

Transvektieren Sie die DNA-Zellen mit einer DNA-Zusammensetzung von ein bis eins bis zwei von HA bis NA bis Gag und einer DNA-Gesamtmenge von 40 Mikrogramm pro T150-Kolben. Wiederholen Sie diesen Schritt, um neun T150-Kolben mit einem Gesamtvolumen von 200 Millilitern herzustellen. Anschließend werden die DNA- und Liposomenlösungen in serumfreien Transvektionsmedien ohne Antibiotika verdünnt, so dass jeder Kolben ein Gesamtvolumen von 24 Millilitern enthält.

Stellen Sie die Kolben wieder in den Inkubator und bewahren Sie die Zellen und das Transvektionskulturmedium bis zu dem Tag auf, an dem ein virusähnliches Partikel (VLP) geerntet wird. Der Überstand wird in konische 50-Milliliter-Röhrchen überführt, um die Kultur 72 bis 96 Stunden nach der Transvektion aus den Zellen zu ernten. Schleudern Sie die Zellen nach unten, um die Zelltrümmer zu pelletieren.

Sammeln Sie die Überstände und filtern Sie sie durch eine 0,22-Mikron-Ausgießmembran. Zuvor präparierte Spodoptera frugiperda oder Sf9-Zellen in Suspension in Spinnerkolben durch kontinuierliches Rühren bei 130 U/min auf einem Mehrpunkt-Rührplattensystem kultivieren. Das Kulturvolumen wird für eine ordnungsgemäße Belüftung auf nicht mehr als der Hälfte des Volumens des Spinnerkolbens gehalten.

Als nächstes exprimieren Sie CHIK-VLPs, indem Sie 250 Milliliter Sf9-Zellen in einem Spinnerkolben mit einer Dichte von zwei mal zehn auf die sechs Zellen pro Milliliter mit zuvor vorbereiteten rekombinanten Baculoviren infizieren und die Zellen in einen 28-Grad-Inkubator zurückführen. Verwenden Sie den Trypanblau-Ausschluss, um festzustellen, ob die Zellviabilität auf 70 bis 80 % gesunken ist. Nach Bestätigung werden die Kulturen direkt aus der Suspension in konische 50-Milliliter-Röhrchen überführt und die Zellen nach unten geschleudert. Sammeln Sie die Überstände und filtrieren Sie sie vor der Sedimentation durch eine 0,22-Mikron-Gießmembran.

Sterilisieren Sie sechs 25 Millimeter x 89 Millimeter große Ultrazentrifugenröhrchen mit 70 % Ethanol. Stellen Sie dann sicher, dass das Ethanol vollständig getrocknet ist. Laden Sie 32 Milliliter Überstände in die sauberen Röhrchen.

Unterlegen Sie anschließend die Überstände vorsichtig mit drei Millilitern sterilem 20%igem Glycerin und PBS. Unterlegen Sie das Glycerin langsam, um eine Störung der dünnen Dichteschicht zwischen dem Glycerin und der VLP-Lösung zu vermeiden. Eine zu schnelle Abgabe des Glycerins führt dazu, dass sich das Glycerin und die VLP-Lösungen vermischen, wodurch die VLP-Sedimentation reduziert wird.

Stellen Sie sicher, dass die Röhren ausbalanciert sind, und beginnen Sie dann mit dem Schleudern. Nach vier Stunden nehmen Sie die Röhrchen aus der Zentrifuge. Saugen Sie den Überstand an und achten Sie darauf, dass sich das Pellet nicht aus dem Rohr löst.

Resuspendieren Sie die sedimentierten VLPs in mindestens 100 Mikrolitern am Boden der Röhrchen mit sterilem PBS, indem Sie sanft und langsam auf und ab pipettieren. Die Resuspension des VLP-Pellets sollte mit sanfter, langsamer, wiederholter Aspiration und Ausstoßung von PBS mit einer Pipette erfolgen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen, um den VLP-Verlust zu begrenzen.

Lagern Sie abschließend die resuspendierten VLPs. Die VLP-Volumina und die Gesamtproteinausbeute aus einem herkömmlichen BCA-Assay wurden aus einer Vielzahl von SVP- und VLP-Konstrukten gewonnen. Die CHIK SVP-Ausbeute aus Sf9-Zellen liegt zwischen 0,008 und 0,016 Milligramm Gesamtprotein pro Milliliter Überstandsvolumen.

Während die Produktion durch 293 T-Zellen von Säugetieren eine zehnfache Reduktion des Proteins ergibt. Diese elektronenmikroskopische Aufnahme zeigt, dass HA Gag Core Influenza VLPs erfolgreich exprimiert, assembliert und als VLPs gereinigt werden. Nun, wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, nur gesunde und lebensfähige Zellkulturen zu transvetieren und zu infizieren, da dies die Gesamtproteinexpression beeinflusst.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie BCA-, ELIZA- und HA-Assays durchgeführt werden, um den Gesamtproteingehalt, den spezifischen Antigengehalt und die Expression des funktionellen HA zu messen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einer Ultrazentrifuge gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Auswuchten der Röhrchen, die Verwendung nur der empfohlenen Rotoren und Drehzahlen und die ordnungsgemäße Aufsicht über neues Laborpersonal bei der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.