Name: Ein-Schritt-Negative chromatographischer Reinigung von Helicobacter pylori Neutrophil-aktivierendes Protein überexprimiert in Escherichia coli Im Batch-Modus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Erfahren Sie die einstufige negative Chromatographie zur Reinigung von Helicobacter pylori Neutrophil-aktivierendem Protein in nativem Zustand mit hoher Ausbeute. Diese Methode nutzt DEAE-Ionenaustauscherharze im Batch-Verfahren.

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Wir danken Dr. Chao-Sheng Cheng von der National Tsing Hua University, Taiwan, für die Durchführung der Messung des Zirkulardichroismus. Wir danken auch Dr. Evanthia Galanis und Dr. Ianko D. Iankov von der Mayo Clinic, USA, für die Bereitstellung des monoklonalen Anti-HP-NAP-Antikörpers. Wir danken Dr. Han-Wen Chang und Dr. Chung-Chu Chen vom Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, für die Beratung bei der IRB-Anwendung, Herrn Te-Lung Tsai vom Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, für die Überwachung der Analyse isolierter Neutrophilen und Frau Ju-Chen Weng von der National Tsing Hua University, Taiwan, für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des taiwanesischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 und NSC98-2311-B-007-006-MY3), des Joint Research Program der National Tsing Hua University und des Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1) und des Forschungsprogramms der National Tsing Hua University (104N2052E1) unterstützt.

Menschliches Blut wurde von gesunden Freiwilligen mit vorheriger schriftlicher Einwilligung nach Aufklärung und Zustimmung von der Institutional Review Board der National Tsing Hua University in Hsinchu, Taiwan gesammelt. 1. Expression von rekombinantem HP-NAP in E. coli <ol><li> Bereiten Sie das Plasmid pET42a-NAP die DNA - Sequenz von HP-NAP von H. enthält , pylori 26695 Stamm wie zuvor beschrieben 16. Herstellung der Plasmide, die die DNA-Sequenz von HP-NAP mit den gewünschten Punktmutationen enthalten, wie beschrieben (siehe Protokoll, Schritt 8). </li><li> Transformation 10 ng der oben genannten DNA - Plasmide in E. coli BL21 (DE3) kompetente Zellen durch Hitzeschock für 45 Sekunden bei 42 ° C, streak die Zellen auf LB-Medium (LB) Agarplatten , enthaltend 50 &amp; mgr; g / ml Kanamycin, und Inkubation der Platten bei 37 ° C für 16 Stunden. </li><li> Beimpfen einzelne Kolonien in einzelne Röhrchen mit 5 ml LB-Brühe mit 50 ug / ml Kanamycin und wachsen sie als Vorkulturen bei 37 ° C für 16 Stunden mit bei 170 Umdrehungen pro Minute schütteln. </li><li> Beimpfen von 2 ml der oben Vorkultur Zellen in 200 ml LB-Brühe, die 50 ug / ml Kanamycin in einem 1-l-Kolben. Inkubieren des beimpften Kulturkolben bei 37 ° C für 2 h mit bis die Absorption bei 600 bei 170 rpm Schütteln nm etwa 0,4-0,5 durch einen UV / VIS-Spektrophotometer detektiert erreicht. </li><li> Hinzufügen 80 ul 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) in der obigen Kultur bis zu einer Endkonzentration von 0,4 mM, die Expression von HP-NAP zu induzieren. Inkubieren der Kultur für 3 h, bis die Absorption bei 600 nm etwa 1,6-1,7 erreicht hat. </li><li> Zentrifuge die Zellen bei 6.000 × g bei 4 ° C für 15 min den Überstand zu entfernen. Lagern Sie das Zellpellet bei -70 ° C bis zur Reinigung. </li></ol> 2. Herstellung der löslichen Proteinfraktion, die HP-NAP Anmerkung: Alle der folgenden Schritte durchgeführt werden bei 4 ° C. <ol><li> Resuspendieren 50 ml der Zell pEllet in Protocol Schritt 1.6 hergestellt, in 20 ml 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM NaCl, enthaltend 0,13 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0.03 mM N-alpha-Tosyl-L-Lysinyl-Chlormethylketon (TLCK) und 0,03 mM N-Tosyl-L-phenylalaninyl-Chlormethylketon (TPCK) bei 4 ° C , wie zuvor beschrieben 16. </li><li> Stören die Bakterienzellen durch die Bakteriensuspension durch einen Hochdruckhomogenisator bei einem Bereich von 15.000 bis 20.000 psi für 7-mal bei 4 ° C betrieben verläuft. </li><li> Zentrifuge das Zelllysat bei 30000 × g bei 4 ° C für 1 Stunde die löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen zu trennen, indem eine Ultrazentrifuge. Den Überstand als lösliche Proteinfraktion in ein Becherglas. </li><li> Messung der Proteinkonzentration der löslichen Proteinfraktion von der Bradford-Methode eines kommerziellen Kits mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard verwendet, gemäß der Anweisungen des Herstellers. </li><li> In 177,6 ul 1 N HCl in 20 ml the lösliche Proteinfraktion aus Protocol Schritt 2.3 erhaltenen 8,0 pH im Bereich von pH 9,0 bis sein pH-Wert einzustellen. </li><li> Hinzufügen 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl zu der obigen Proteinlösung auf die endgültige Proteinkonzentration machen 0,5 mg / ml sein. </li></ol> 3. Reinigung von rekombinantem HP-NAP Von E. coli durch Negativ - Modus Batch - Chromatographie mit DEAE Ionenaustauscherharze <ol><li> Vorbereitung 15 ml DEAE-Harze. <ol><li> Abwiegen 0,6 g trockenes Pulver aus DEAE-Harze und suspendieren sie in 30 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl bei Raumtemperatur für mindestens 1 Tag. </li><li> Zentrifugieren des Harzes bei 10.000 x g bei 4 ° C für 1 min. </li><li> Entfernen und den Überstand verwerfen. </li><li> 15 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl. </li><li> Wiederholen Protokoll 3.1.2 bis 3.1.4 vier weitere Male Schritte. </li><li> Lagern Sie die 15 ml siedelten Harz (50% ige Aufschlämmung in 30 ml Tris-Puffer) bei 4 ° C für die spätere Verwendung. Hinweis: Alle folgenden Schritts werden bei 4 ° C durchgeführt. </li></ol></li><li> Hinzufügen 45 ml der löslichen Proteine ​​in Protokolls hergestellt Schritt 2,6-15 ml des Harzes und rühre das Protein / Harzaufschlämmung mit einem Magnetrührer bei 4ºC für 1 Stunde. </li><li> Gießen das Protein / Harz-Aufschlämmung in eine Plastik- oder Glassäule mit einem Absperrhahn versehen. Lassen Sie das Harz unter Schwerkraft absetzen. </li><li> Öffnen des Absperrhahns die Proteinlösung zu ermöglichen, durch die Kolonne durch Schwerkraftströmung zu laufen, bis der Flüssigkeitspegel in der Säule unmittelbar oberhalb der Harz ist. Sammeln Sie die Flow-Through als der ungebundenen Fraktion, die das gereinigte HP-NAP enthält. </li><li> 15 ml eiskaltem 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl in die Säule. </li><li> Öffnen des Absperrhahns der Waschpuffer zu ermöglichen, durch die Kolonne durch Schwerkraftströmung zu laufen, bis der Flüssigkeitspegel in der Säule unmittelbar oberhalb der Harz ist. Sammeln Sie die Flow-Through als Waschfraktion. </li><li> Wiederholen Protokoll 3,5-3,6 vier weitere Male die Schritte, die zusätzlichen Waschfraktionen zu sammeln. </li><li> 15 ml eiskaltem 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl in eine Säule. </li><li> Öffnen des Absperrhahns der Elutionspuffer zu ermöglichen, durch die Kolonne durch Schwerkraftströmung zu laufen, bis der Flüssigkeitspegel in der Säule unmittelbar oberhalb der Harz ist. Sammeln Sie die Flow-Through als Elutionsfraktion. </li><li> Wiederholen Protokoll 3,8-3,9 vier weitere Male die Schritte, die zusätzlichen Elutionsfraktionen zu sammeln. </li></ol> 4. Puffer Exchange und Endotoxin Entfernung von HP-NAP Gereinigt durch Negativ-Modus Batch-Chromatographie mit DEAE Resins Hinweis: Das gereinigte HP-NAP in E. ausgedrückt coli muss ausgesetzt werden , den Austausch und Endotoxin Entfernung zum Puffern vor Neutrophilen zu stimulieren. <ol><li> Führen Dialyse Puffer des gereinigten HP-NAP nach Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) zu ändern, pH 7,2, bei 4 ° C durch einen Dialyseschlauch mit Molekulargewichtsgrenze von 14 kDa verwendet , wie zuvor beschrieben 24. </li><li> Filtern Sie die dialysiert HP-NAP durch eine syringe Filter mit einem positiv geladenen, hydrophilen Membran angebracht auf eine 20 ml Einwegspritze mit Raten von 2,5 bis 4 ml / min bei 4 ° C im Bereich Strömungs Endotoxin zu entfernen. </li></ol> 5. Charakterisierung der molekularen Eigenschaften von gereinigtem rekombinantem HP-NAP durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), Western Blotting, Native-PAGE, Gelfiltrationschromatographie und Circulardichroismus-Spektroskopie <ol><li> Analyse des gereinigten rekombinanten HP-NAP durch SDS-PAGE und Western Blotting mit Hybridomkulturüberständen enthält monoklonaler Maus - Antikörper MAb 16F4 25 , wie zuvor beschrieben 24. </li><li> Analysieren Sie den gereinigten HP-NAP durch native-PAGE und Gelfiltrationschromatographie seinen oligomeren Status zu prüfen , wie zuvor 26 beschrieben. </li><li> Analysieren Sie den gereinigten rekombinanten HP-NAP durch Circulardichroismus - Spektroskopie seine Sekundärstruktur zu untersuchen , wie zuvor 26 beschrieben. </li></ol> 6. Bewertung der Reinheit des HP-NAP durch Silberfärbung eines SDS-PAGE-Gel <ol><li> Bereiten Sie die Befestigungslösung, Sensibilisierungslösung, Silberlösung, Entwicklungslösung, Stopplösung und Waschlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers einer Silberfärbung Kit. </li><li> Führen Silberfärbung eines SDS-PAGE-Gel nach den Anweisungen des Herstellers einer Silberfärbung Kit. </li><li> Erwerben, um das Bild des Gels mit einem Abbildungssystem. </li></ol> 7. Messung der ROS-Produktion aus Neutrophilen induziert durch HP-NAP <ol><li> Isolieren menschlicher Neutrophile aus humanem heparinisiertem Blut durch Dextran - Sedimentation durch Dichtegradientenzentrifugation gefolgt , wie zuvor beschrieben 24. </li><li> Die Messung der ROS-Produktion von neutrophilen Granulozyten stimuliert mit HP-NAP durch eine Luminol-abhängige Chemilumineszenz Assay. <ol><li> Schalten Sie auf einem Plattenlesegerät und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C. Legen Sie einleer flachen Boden 96-Well-Platte, weiß im Inneren der Plattenleser Kammer, so dass sie auf 37 ° C zu erwärmen. </li><li> Bereiten Sie die Stimulus Mischungen in D-PBS, pH 7,2, enthaltend 0,9 mM CaCl 2, 0,5 mM MgCl 2 und 13,3 &amp; mgr; M 5-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion (Luminol) mit der Anwesenheit und Abwesenheit von 0,67 uM Endotoxin entfernt HP-NAP, hergestellt aus Protokoll Schritt 4.2. </li><li> Stellen Sie die Konzentration von humanem Neutrophilen hergestellt aus Protocol Schritt 7,1-2 x 10 6 Zellen / ml in D-PBS, pH 7,2, enthaltend 5 mM Glukose. </li><li> In 50 ul Neutrophilen-Suspension in jede Vertiefung der 96-Well-Platte, während. </li><li> Zugabe von 150 &amp; mgr; l der Stimulus Mischungen aus Protokolls hergestellt Schritt 7.2.2 in die Vertiefung mit Neutrophilen in einem Zeitintervall von 5 Sekunden pro Vertiefung. </li><li> Messen der Emission von Chemilumineszenz für 5 sec pro Vertiefung über einen Zeitraum von 3 Stunden durch einen Plattenleser. </li></ol></li></ol> 8.Aufbau von DNA-Plasmiden HP-NAP Mutants durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) -basierte Standort direkte Mutagenese Hinweis: PCR-basierte Website-direkte Mutagenese wurde im Grunde erzeugt , wie zuvor 27 beschrieben mit der Ausnahme , dass die &quot;stille&quot; Restriktionsstellen an die Mutagenese - Primer eingeführt wurden durch ortsgerichtete Mutagenese (SDM) -Assist Software 28. <ol><li> Führen PCR-Reaktion. <ol><li> Werden 10 ng von Plasmid pET42a-NAP, 1 uM Mutagenese - Primer - Paare , die in Tabelle 1, 200 uM Desoxynucleosidtriphosphate (dNTPs) und 3 Einheiten von High-Fidelity PCR Enzymmischung in ein PCR - Röhrchen entionisiertes Wasser enthielt, was eine endgültige Volumen von 25 &amp; mgr; l. </li><li> Initiieren Sie die PCR-Zyklen bei 95 ° C für 10 min , um die Matrizen - DNA zu denaturieren , und 12 Amplifikationszyklen bei 95 ° C für 1 Minute folgt, m T kein -5 ° C für 1 Minute und 72 o C für 6 min. </li><li> Beenden Sie die PCR-Zyklen mitein Temperschritt bei T m pp -5 o C für 1 Minute und ein Verlängerungsschritt bei 72 ° C für 30 min. </li></ol></li><li> Behandlung von 15 &amp; mgr; l des PCR-Produktes mit 0,4 &amp; mgr; l DpnI-Restriktionsenzym bei 37 ° C für 2 Stunden und dann analysieren 2 ul der Dpn I-behandelten PCR-Produkt durch Agarose-Gelelektrophorese. </li><li> Screen-Mutanten. <ol><li> Transformieren 2 &amp; mgr; l des PCR - Produkts in E. coli DH5 kompetenter Zellen durch Hitzeschock für 45 Sekunden bei 42 ° C. </li><li> Verbreiten Sie die transformierten Zellen auf einer LB-Platte, die 50 ug / ml Kanamycin und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 16 Stunden. </li><li> Isolieren der Plasmid-DNA aus den Bakterienkolonien einen handelsüblichen alkalischen Lyse-Kit nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Behandeln die Plasmid-DNA isoliert in Protocol Schritt 8.3.3 mit XhoI-Restriktionsenzym, das Vorhandensein der gewünschten stille Mutationen zu verifizieren dem Protokoll des Herstellers entsprechend. </li><li> Ablauf derPlasmid-DNA durch das Protokoll Schritt 8.3.4 mit T7-Promotor-Primer bestätigte die Korrektur der kodierenden Sequenzen von HP-NAP-Mutanten dem Protokoll des Herstellers entsprechend bestätigen. </li></ol></li></ol>

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<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biotechnol%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC biotechnol. 8 (91), (2008).</li>
<li>Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDM-assist+software+to+design+site-directed+mutagenesis+primers+introducing+%27silent%27+restriction+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites.</a> BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).</li>
</ol>

HWF und YCY sind Erfinder der Patente TW I 432579 und US 8,673,312 für das Verfahren zur einstufigen Aufreinigung des neutrophilenaktivierenden Proteins Helicobacter pylori . Alle im Manuskript beschriebenen Materialien werden für Forschungszwecke zur Verfügung stehen. Die Autoren bestätigen, dass dies nichts daran ändert, dass sie sich an alle Richtlinien der JoVE zum Austausch von Daten und Materialien halten.

Die negativen Modus batch - Chromatographie mit DEAE Anionenaustauscherharze präsentierten zur Reinigung von rekombinantem HP-NAP überexprimiert in E coli geeignet. Die pH - Werte der Puffer in den Schritten der Zell - Lyse und Reinigung verwendet werden , sind sehr kritisch , um die Löslichkeit von HP-NAP in E. , um sicherzustellen , coli - Lysaten und effiziente Trennung von rekombinantem HP-NAP von Wirtszellverunreinigungen, respectively. Bakterielle Zellen sollten bei einem pH von 9,0, und...

Helicobacter pylori (H. pylori) ist eine Hauptursache von Gastritis und Magengeschwüren. Dieses Bakterium ist auch als Karzinogen beim Menschen von der Internationalen Agentur für Krebsforschung, Teil der Weltgesundheitsorganisation im Jahr 1994 eingestuft Es wurde geschätzt , dass die Prävalenz von H. pylori - Infektion ist 70% in den Entwicklungsländern und 30-40% in den Industrieländern 1. Auch wenn die Infektionsrate von H. pylori wird in den Industrieländern abnimmt, die Infektionsrate von H. pylori in den Entwicklungsländern ist 2 immer noch hoch. Die Standardbehandlung H. auszurotten pylori - Infektion besteht aus der Verabreichung eines Protonenpumpenhemmers, PPI, und zwei Antibiotika, Clarithromycin und Amoxicillin oder Metronidazol 3. Allerdings ist der Anstieg der Antibiotikaresistenz in der H. pylori verwandtes Geschwür Therapie die Entwicklung neuer Strategien drängt o zu verhindernr die Infektion zu heilen. Entwicklung von präventiven und / oder therapeutischen Impfung gegen H. pylori könnte einen alternativen Ansatz bieten H. zu steuern pylori - Infektion. Neutrophilen-aktivierende Protein Helicobacter pylori (HP-NAP), ein wichtiger Virulenzfaktor von H pylori, wurde zuerst in Wasserextrakten von H. identifiziert pylori mit der Fähigkeit , Neutrophile zu aktivieren , um an endotheliale Zellen anheften und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) 4 herzustellen. Neutrophile Infiltration der Magenschleimhaut in H. gefunden pylori - infizierten Patienten mit aktiver Gastritis kann bei der Entzündung und Gewebeschädigung des Magens führen. So Neutrophilen eine pathologische Rolle spielen , indem sie die Aktivierung HP-NAP kann eine Magenentzündung zu induzieren, die weiter Geschwür oder H. verursacht pylori -assoziierten Magenerkrankungen. Dennoch ist HP-NAP ein potentieller Kandidat für die klinische Anwendung 5,6. Aufgrund der immunogene und immunmodulatorische Proschaften von HP-NAP könnte dieses Protein verwendet werden, um Impfstoffe, therapeutische Mittel und Diagnose-Tools zu entwickeln. Eine klinische Studie wurde unter Verwendung von rekombinantem HP-NAP als eine der Komponenten eines Proteins Impfstoff gegen H. durchgeführt pylori. Dieser Impfstoff besteht aus rekombinanten HP-NAP, Cytotoxin-assoziierte Gen A (CagA) und vacuolating cytotoxin A (VacA) Proteine ​​mit Aluminiumhydroxid formuliert und hat sich weiter beim Menschen sicher und immunogen zu sein 7 gezeigt. Auch wirkt HP-NAP als ein potenter Immunmodulator T - Helfer Typ 1 (Th1) -polarisierte Immunantworten für die Krebstherapie 8 und nach unten zu regulieren Th2-vermittelte Immunreaktionen durch allergische Reaktionen und parasitäre Infektionen 9,10 ausgelöst auszulösen. Wie für die Diagnostik, wurde Serum - Antikörper gegen HP-NAP in H. zu erkennen rekombinanten HP-NAP-basierten ELISA angewendet pylori - infizierten Patienten 11. Eine Studie zeigte , dass der Pegel des HP-NAP-spezifische Antikörper in Seren von H. pylori -infizierten Patienten mit Magenkrebs als die 12 von Patienten mit chronischer Gastritis signifikant höher war. Eine andere Studie zeigte auch , dass Serumantikörper gegen HP-NAP mit der Anwesenheit von nicht-Cardia Adenokarzinom des Magens 13 verbunden sind. So können rekombinante HP-NAP-basierten ELISA Serum - Antikörper gegen HP-NAP für die Prognose von Magenkrebs in H. zu erkennen , anzuwenden pylori - infizierten Patienten. Zusammengenommen können das gereinigte HP-NAP weiter für die Prävention, Behandlung verwendet werden, und die Prognose von H. pylori -assoziierte Erkrankungen sowie Krebstherapie. Unter den verschiedenen zur Reinigung von rekombinantem HP-NAP Methoden exprimiert in Escherichia coli (E. coli) in seiner nativen Form berichtet so weit, einem zweiten Reinigungsschritt beteiligt Gelfiltrationschromatographie hochreines HP-NAP zu erhalten , ist erforderlich 14-16 . Hier wird ein Verfahren unter Verwendung von negativen Modus batch-Chromatographie mitDiethylaminoethyl (DEAE) Ionenaustauscherharzen wird zur Reinigung von HP-NAP beschrieben überexprimiert in E. coli mit hoher Ausbeute und hoher Reinheit. Dieses Reinigungsverfahren wurde auf die Bindung von Wirtszellproteinen basieren und / oder anderen Verunreinigungen als HP-NAP auf das Harz. Bei pH 8,0, fast keine andere Proteine ​​außer HP-NAP werden aus der ungebundenen Fraktion gewonnen. Diese Reinigung Ansatz unter Verwendung von DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie in negativen Modus ist einfach und zeitsparend durch Reinigung von rekombinantem HP-NAP über Einstufen-Chromatographie durch die Erhebung von der ungebundenen Fraktion ermöglicht. Neben HP-NAP mehrere andere Biomoleküle, wie beispielsweise 17 Viren, Immunoglobulin G (IgG) 18, Hämoglobin 19, Proteinphosphatase 20 und Virulenzfaktor Flagellin - 21, wurden auch durch Ionenaustauschchromatographie zu reinig in negativer berichtet Modus. Der negative Modus wird für die Ionenaustauschchromatographie bevorzugt, wenn die Verunreinigungen gering sindvorhandenen Komponenten in der Probe unterzogen , bis 22 gereinigt werden. Die Anwendung der negativen Chromatographie bei der Reinigung von natürlichen oder rekombinanten Biomoleküle wurde 23 vor kurzem überprüft. Der vorliegende Bericht liefert eine Schritt für Schritt - Protokoll für die Expression von rekombinanten HP-NAP in E. coli, Lyse der Zellen und die Reinigung von HP-NAP unter Verwendung von negativen Modus batch - Chromatographie mit DEAE - Ionenaustauschharze. Wenn ein Protein für die Reinigung erwünscht für Ionenaustauschchromatographie in Negativmodus geeignet ist, könnte das beschriebene Protokoll auch als Ausgangspunkt für die Entwicklung eines Reinigungsverfahrens angepasst werden.

<table><tbody><tr><td><stark>Material</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET42a-NAP&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>erstellt wie in den Ergänzenden Daten von Refernce 15&nbsp; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>C6000-03</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Amresco</td><td>25389-94-0</td><td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>MD Biomedical Inc</td><td>101-367-93-1</td><td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20</td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td>Protease-Inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>N-alpha-Tosyl-L-lysinyl-chlormethylketon (TLCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7254</td><td>Protease-Inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>N-Tosyl-L-phenylalaninyl-chlormethylketon (TPCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4376</td><td>Protease-Inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Proteinstandard (Rinderserumalbumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5619&nbsp;</td><td>ein Standardprotein für den Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>DEAE&ndash; Sephadex &nbsp; A-25-Chlorid Form</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Spectrum/Por Dialyseschlauch</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132720</td><td>mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;</td></tr><tr><td>Acrodisc&reg; Geräte mit Mustang&reg; E-Membran</td><td>Pall</td><td>MSTG25E3</td><td>für die Entfernung von Endotoxinen; betrieben bei Flussraten von 1 bis 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td></tr><tr><td>monoklonaler Maus-Antikörper MAb 16F4</td><td>N/A</td><td>N/A</td>, <td>aufgebracht gegen den gereinigten HP-NAP des H. pylori-Stammes NCTC 11637, wie in Abbildung 23 beschrieben; &nbsp; Ein Geschenk von Dr. Evanthia Galanis und Dr. Ianko D. Iankov von der Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28989335</td><td>für die Gelfiltrationschromatographie http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td></tr><tr><td>PlusOne Silberfärbekit, Protein</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1150-01</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1440-02</td><td>für die Dichtegradientenzentrifugation zur Aufreinigung humaner Neutrophilen http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002</td></tr><tr><td>Flacher Boden 96-Well-Platte weiß</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>236108</td><td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>lichtgeschützt http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Erweitern &nbsp; Long-Template-PCR-System</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11681834001</td><td>Quelle für High Fidelity PCR Enzymmix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Dpn I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>18265-017</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Produktnummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung<</td><td></td><td></td><td>br/> &nbsp;</td></tr><tr><td>U-2800 Doppelstrahl-UV/VIS-Spektralphotometer</td><td>Hitachi&nbsp;</td><td>N/A</td><td>nicht mehr auf dem Markt und aufgerüstet auf ein neues Modell http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C3 Hochdruck-Homogenisator</td><td>Avestin Inc</td><td>C315320</td><td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td></tr><tr><td>Hitachi Koki himac CP80WX allgemeine Ultrazentrifuge</td><td>Hitachi Koki Co</td><td>90106401</td><td>zur Trennung der löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen aus E. coli Lysaten http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td></tr><tr><td>&Auml; KTA FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1900-26</td><td>für die Gelfiltrationschromatographie http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td></tr><tr><td>Aviv Modell 62ADS CD Spektralphotometer</td><td>Aviv Biomedical</td><td>N/A</td><td>vom Markt genommen und auf ein neues Modell http://www.avivbiomedical.com/circular.php</td></tr><tr><td>LAS-3000 Bildgebungssystem</td><td>aufgerüstet Fujifilm</td><td>N/A</td><td>abgekündigt und ersetzt http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td></tr><tr><td>Wallac 1420 (Victor2) Multilabel-Zähler</td><td>Perkin-Elmer</td><td>1420-018</td><td>für die Chemilumineszenzdetektion http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</td></tr></tbody></table>

ein-schritt-negative chromatographischer reinigung von<em&gt; helicobacter pylori</em&gt; neutrophil-aktivierendes protein überexprimiert in<em&gt; escherichia coli</em&gt; im batch-modus

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori Neutrophilen-aktivierendes Protein (HP-NAP) ist ein wichtiger Virulenzfaktor von Helicobacter pylori (H. pylori). Es spielt eine entscheidende Rolle in H. pylori induzierte Magenentzündung durch verschiedene angeborene Leukozyten einschließlich Neutrophile, Monozyten und Mastzellen aktiviert werden . Die immunogene und immunmodulatorische Eigenschaften von HP-NAP machen es zu einem möglichen diagnostischen und Impfstoffkandidaten für H. pylori und ein neuer Medikamentenkandidaten für die Krebstherapie. Um erhebliche Mengen an gereinigtem HP-NAP für seine klinische Anwendung, ein effizientes Verfahren dieses Protein mit hoher Ausbeute und Reinheit zu erhalten, verwendet zu reinigen eingerichtet werden muss. In diesem Protokoll haben wir ein Verfahren zur einstufigen negativen chromatographischen Reinigung von rekombinantem HP-NAP überexprimiert in Escherichia coli (E. coli) unter Verwendung von Diethylaminoethyl (DEAE) Ionenaustauscherharzen beschrieben (z. B. Sephadex) in Batch-Modus. Rekombinante HP-NAP bildet fast 70% des Gesamtproteins in E. coli und wird nahezu vollständig in der löslichen Fraktion nach Zelllyse bei pH 9,0 gewonnen. Unter der optimalen Bedingung bei einem pH von 8,0, wird der Großteil der HP-NAP in der ungebundenen Fraktion gewonnen , während die endogenen Proteine ​​aus E. coli effizient durch das Harz entfernt. Dieses Reinigungsverfahren unter Verwendung von negativen Modus batch - Chromatographie mit DEAE - Ionenaustauschharze ergibt funktionelle HP-NAP aus E. coli in seiner nativen Form mit hoher Ausbeute und Reinheit. Das gereinigte HP-NAP könnte weiter zur Verhütung, Behandlung verwendet werden, und die Prognose von H. pylori -assoziierte Erkrankungen sowie Krebstherapie.

Die schematische Darstellung des experimentellen Verfahrens negativer Reinigung rekombinanter HP-NAP exprimiert in E. coli durch DEAE - Ionenaustauschharze in Batch - Modus verwendet , ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Reinigungsverfahren auf die Bindung von Wirtszellproteinen basieren und / oder anderen Verunreinigungen als HP-NAP auf das Harz. Bei pH 8,0 fast keine andere Proteine ​​außer HP-NAP in nativer Form aus der ungebundenen Fraktion (2A</s...

Eine hohe Ausbeute Verfahren zur einstufigen negativen Reinigung von rekombinanten Helicobacter pylori in Escherichia coli Neutrophile aktivierendes durch Verwendung Diethylaminoethyl Harze im Batch - Modus überexprimiert Protein (HP-NAP) beschrieben ist. HP-NAP durch dieses Verfahren gereinigt ist vorteilhaft für die Entwicklung von Impfstoffen, Medikamente oder Diagnostika für H. pylori -assoziierte Krankheiten.

Ein-Schritt-Negative chromatographischer Reinigung von<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrophil-aktivierendes Protein überexprimiert in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Im Batch-Modus

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Das übergeordnete Ziel dieser Reinigung besteht darin, funktionelles Helicobacter pylori-Neutrophilen-aktivierendes Protein oder HP-NAP in seiner nativen Form mit hoher Reinheit und hoher Ausbeute mittels Chargenchromatographie im Negativmodus mit Diethylaminoethyl-Ionenaustauscherharz zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass HP-NAP in einem einzigen Schritt in seiner nativen Form mit hoher Reinheit und hoher Ausbeute gereinigt werden kann. Die Negativreinigung von HP-NAP beginnt mit einem Chargenbindungsverfahren, bei dem die lösliche Proteinfraction aus bakteriellen Lysaten dem DEAE-Harz zugesetzt wird.Das Gemisch wird inkubiert, um den Bindungsprozess von Proteinen an das Harz zu ermöglichen. Das im nicht gebundenen Anteil enthaltene HP-NAP wird anschließend durch Zentrifugation oder Schwerkraftfluss gewonnen. Die Bedeutung dieser Methode liegt in der 10:1-Prävention, Behandlung und Prognose von mit Helicobacter pylori assoziierten Erkrankungen sowie in der Krebsbehandlung.Aufgrund der immunogenen und immunmodulatorischen Eigenschaften von HP-NAP. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten haben. Weil HP-NAP während der

one-step-negative-chromatographic-purification-helicobacter-pylori

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Ein-Schritt-Negative chromatographischer Reinigung von Helicobacter pylori Neutrophil-aktivierendes Protein überexprimiert in Escherichia coli Im Batch-Modus (Video) | JoVE Journal

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