Ein-Schritt-Negative chromatographischer Reinigung von

Das übergeordnete Ziel dieser Reinigung besteht darin, funktionelles Helicobacter pylori-Neutrophilen-aktivierendes Protein oder HP-NAP in seiner nativen Form mit hoher Reinheit und hoher Ausbeute mittels Chargenchromatographie im Negativmodus mit Diethylaminoethyl-Ionenaustauscherharz zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass HP-NAP in einem einzigen Schritt in seiner nativen Form mit hoher Reinheit und hoher Ausbeute gereinigt werden kann. Die Negativreinigung von HP-NAP beginnt mit einem Chargenbindungsverfahren, bei dem die lösliche Proteinfraction aus bakteriellen Lysaten dem DEAE-Harz zugesetzt wird.

Das Gemisch wird inkubiert, um den Bindungsprozess von Proteinen an das Harz zu ermöglichen. Das im nicht gebundenen Anteil enthaltene HP-NAP wird anschließend durch Zentrifugation oder Schwerkraftfluss gewonnen. Die Bedeutung dieser Methode liegt in der 10:1-Prävention, Behandlung und Prognose von mit Helicobacter pylori assoziierten Erkrankungen sowie in der Krebsbehandlung.

Aufgrund der immunogenen und immunmodulatorischen Eigenschaften von HP-NAP. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten haben. Weil HP-NAP während der Sterilisation leicht aggregiert.

Den Ablauf wird Zhi-Wei Hong, ein Doktorand aus unserem Labor, demonstrieren. Bei vier Grad Celsius suspendieren wir 50 Milliliter des gemäß dem Textprotokoll hergestellten Zellpellets in 20 Milliliter eines Puffers mit niedrigem Salzgehalt auf Tris-Basis bei pH 9,0 unter Zusatz einer Proteaseinhibitor-Mischung. Es ist entscheidend, die Probe bei vier Grad Celsius zu halten, um Proteinaggregation während des Verfahrens zu verhindern.

Zerstören Sie die bakteriellen Zellen, indem Sie die Bakteriensuspension siebenmal bei vier Grad Celsius durch einen Hochdruckhomogenisator im Bereich von 15.000 bis 20.000 PSI leiten. Nachdem die lysierten Bakterien vorliegen, sollte die Probe sofort zentrifugiert werden. Überführen Sie die homogenisierten Proben in ein Zentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie das Zelllysat unverzüglich eine Stunde lang bei 30.000×g und vier Grad Celsius unter Verwendung einer Ultrazentrifuge, um die löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen zu trennen. Überführen Sie nach der Zentrifugation das Überstandsvolumen als lösliche Proteinfraktion in ein Becherglas. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der löslichen Proteinfraktion nach der Bradford-Methode mithilfe eines kommerziellen Kits und Rinderserumalbumin als Standard gemäß den Herstelleranweisungen.

Fügen Sie dann 177,6 µL einnormaler HCl zu 20 mL der löslichen Proteinfraction hinzu, um den pH-Wert von pH 9,0 auf pH 8,0 einzustellen. Geben Sie 20 mmol Tris-HCl, pH 8,0, und 50 mmol Natriumchlorid zur Proteinslösung, um eine endgültige Protein-Konzentration von 0,5 mg/mL zu erreichen. Um 15 mL DEAE-Harz vorzubereiten, suspendieren Sie 0,6 g trockenes DEAE-Harz-Pulver in 30 mL Tris-HCl-Puffer bei Raumtemperatur mindestens einen Tag lang.

Zentrifugieren Sie das Harz bei 10.000 × g und vier Grad Celsius für eine Minute und entfernen Sie danach den Überstand, um ihn zu verwerfen. Geben Sie anschließend 15 Milliliter Tris-HCl-Puffer hinzu. Nachdem die Zentrifugations- und Resuspendierungsschritte insgesamt vier weitere Male wiederholt wurden, lagern Sie die 15 Milliliter sedimentiertes Harz bei vier Grad Celsius für die spätere Verwendung.

Bei vier Grad Celsius 45 Milliliter der hergestellten löslichen Proteine zu Milliliter des Harzes geben und in einen 100-Milliliter-Becher mit Rührfisch überführen. Die Protein-Harz-Suspension mithilfe eines Rührgeräts eine Stunde lang bei vier Grad Celsius rühren. Danach die Protein-Harz-Suspension in eine Kunststoff- oder Glas­säule mit Hahn gießen und das Absinken des Harzes durch Schwerkraft ermöglichen.

Öffnen Sie den Hahn, um die Proteiniösung durch Schwerkraftfluss durch die Säule laufen zu lassen, bis der Flüssigkeitspegel in der Säule knapp über der Harzschicht steht. Sammeln Sie den Durchlauf als ungebundene Fraktion, die das gereinigte neutrophilenaktivierende Protein enthält. Geben Sie 15 Milliliter der eiskalten Tris-HCl-Pufferlösung in die Säule.

Öffnen Sie den Hahn erneut, um dem Waschpuffer durch Schwerkraftfluss zu ermöglichen, die Säule zu durchlaufen, bis der Flüssigkeitsspiegel in der Säule knapp über der Harzschicht steht. Sammeln Sie den Durchlauf als Waschfraktion. Wiederholen Sie die Wäsche mit eiskaltem Puffer insgesamt vier weitere Male, um zusätzliche Waschfraktionen zu sammeln.

Anschießend 15 Milliliter eiskaltes 20 Millimolar Tris-HCl pH 8,0, 1 Molares Natriumchlorid zur Säule geben. Das Durchflussvolumen wie zuvor als Elutionsfraktionen sammeln. Die Elutionsschritte insgesamt viermal wiederholen, um zusätzliche Elutionsfraktionen zu sammeln.

Die Wirkung des pH-Werts auf die Löslichkeit von HP-NAP in E.coli-Lysat wird hier gezeigt. Die Menge an HP-NAP, die in diesem löslichen Fraktion nachgewiesen wurde, war bei pH 7,5 bis 9,5 deutlich erhöht. Rekombinantes HP-NAP wurde nach Zelllyse bei pH 9,0 nahezu vollständig in der löslichen Fraktion zurückgewonnen.

Hier wird der Einfluss des pH-Werts auf die negative Reinigung von in E. coli exprimiertem rekombinantem HP-NAP mittels DEAE-Harzen im Batch-Modus gezeigt. Bei pH 8,0 war nur eine geringe Menge an HP-NAP in der Elutionsfraktion vorhanden. Die Menge an HP-NAP in den nicht gebundenen Fraktionen war bei pH 8,0 am höchsten.

Die optimale Menge an Proteinen, die auf das DEAE-Harz aufgetragen wird, beträgt 1,5 Milligramm Protein pro Milliliter Harz, um die maximale Kapazität des Harzes zur Absorption der Verunreinigungen aus E. coli zu erreichen. Bei pH 8,0 werden mit DEAE-Harzen im Batch-Modus sehr wenige Proteine außer HP-NAP in seiner nativen Form in der ungebundenen Fraktion zurückgewonnen. Die Reinheit von HP-NAP lag höher als 95 Prozent.

Das gereinigte HP-NAP faltet sich zu einem Multimer mit einer sekundären Struktur aus Alpha-Helices, wie durch das Gelfiltrationschromatogramm und das UV-Cirkulardichroismus-Spektrum im fernen UV-Bereich gezeigt wird. Ein lumineszenzabhängiger Chemilumineszenz-Assay zeigt, dass das gereinigte HP-NAP die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies durch Neutrophile auslösen kann. Wenn diese Techniken einmal beherrscht sind, können sie bei korrekter Durchführung innerhalb von fünf Stunden durchgeführt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man funktionelles HP-NAP in seiner nativen Form mit hoher Ausbeute und Reinheit mittels Negativmodus-Batch-Chromatographie mit DEAE- und Austauschharz reinigt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Puffer beim richtigen pH-Wert in dem Schritt der Sterilisation innerhalb der Batch-Chromatographie zu verwenden. Die Idee zu dieser Methode entstand erstmals, als wir versuchten, statt der Filtration andere chromatographische Ansätze zur Reinigung von HP-NAP in seiner nativen Form anzuwenden.

Obwohl diese Methode darauf ausgelegt ist, durch rekombinantes in E. coli exprimiertes HP-NAP zu wirken, kann sie auch auf andere bakterielle Expressionssysteme wie per-sida sep-tidas angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist ein schneller Code.

Zusätzlich sind die Schritte der Sterilisation und der Chargenchromatographie schwer zu erlernen, da diese bei vier Grad Celsius ohne Zeitverzögerung durchgeführt werden müssen. Falls ein für die Reinigung konzipiertes Protein für unsere Austauschchromatographie im Negativmodus geeignet ist, könnte dieses Verfahren auch als Ausgangspunkt für die Entwicklung eines Reinigungsprozesses angepasst werden.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der klinischen Forschung, die Möglichkeit der Verwendung von HP-NAP in der Krebstherapie sowie bei der Entwicklung von Impfstoffen, Arzneimitteln und Diagnostika für Helicobacter pylori-assoziierte Erkrankungen zu erforschen.