Name: Die Messung der Kohlendioxidproduktion von Radiolabeled Substrate in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die CO₂-Produktion aus markierten Substraten bei Drosophila melanogaster quantitativ messen. Diese Methode ermöglicht sensitive Analysen des Energiestoffwechsels und genetischer Mutationen.

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Der Autor dankt Dr. Mingjian Lu und Dr. Morris Birnbaum für hilfreiche Ratschläge und finanzielle Unterstützung von NIDDK (R21DK089391).

1. Herstellung von Fly Lebensmittel, die Radiolabeled metabolischen Substrate <ol><li> In einem Mikrozentrifugenröhrchen, mischen 1 bis 2 &amp; mgr; Ci radiomarkierte Substrat (D- [6- 14 C] -Glucose, D- [1- 14 C] -Glucose oder [1- 14 C] -palmitic Säure, 40 - 60 mCi / mmol) mit 15 ul FD &amp; C blau No. 1 Lebensmittelfarbstoff und H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 25 ul zu gleichen. ACHTUNG: Kohlenstoff-14 ist ein Niedrigenergie-Beta-Strahler und hat eine kurze Reichweite in der Luft. Achten Sie jedoch darauf durch den Experimentator Verschütten von radiomarkiertem Molekülen oder versehentliche Einnahme zu verhindern. Fly Essen Fläschchen umkippen leicht; sicher sein, sie in einem Behälter unterzubringen, die sie gegen Umkippen wird, vor allem, wenn radioaktive Markierung in flüssiger Form vorliegt (Schritt 1.2) oder in nicht verfestigten Essen (Schritt 1.4). Flies , die gefüttert werden oder wurden radioaktiv markierten Substraten zugeführt werden beginnen, kleine Mengen an radiomarkiertem CO 2 ausatmen. Diese Fliegen sollte in Acryl-Boxen in Abzügen gehalten werden, und eine kleine Schale KOH can in der Box für als CO 2 Wäscher Verwendung eingestellt werden. </li><li> Pipettieren alle des radiomarkierten Substrat und blauen Farbstoff-Mix in den Boden eines leeren Fliegen Essen Fläschchen (Höhe: 9,4 cm, Breite: 2,2 cm). </li><li> Wärme Standard Lebensmittel in einem Mikrowellenofen fliegen, bis Nahrung nur verflüssigt wird (15 bis 20 Sekunden bei Leistungspegel hoch für ein Fläschchen mit 10 ml Lebensmittel enthält). </li><li> In 975 ul geschmolzene Lebensmittel an die radiomarkierte Substrat / blauer Farbstoff-Mix und schnell wirbeln, Überwachung Einheitlichkeit der blauen Farbe vollständige Durchmischung zu gewährleisten. </li><li> Lassen Sie Lebensmittel zu kühlen und vollständig bei RT erstarren für 20 - 30 min. </li></ol> 2. Füttern Radiolabeled metabolischen Substrate Adult Fruchtfliegen <ol><li> Adult anästhesieren fliegt ein CO 2 betäubende Vorrichtung verwendet , bestehend aus porösem Polyethylen auf einer Acrylbasis geschmolzen und mit einem CO 2 -Tank mit einem Druckregler. Strömungs CO 2 in die betäubende Apparatur bei 5 l / min. <ol><li> Transfer Anesthetized fliegt in Fläschchen mit radioaktiv markierten, blau-gefärbten Lebensmittel (n = 15 - 30 Fliegen pro Flasche). Cap Fläschchen mit einem Schaumstoffstopper und ruhen horizontal bis Fliegen aufwachen. Transfer Fläschchen mit einem Deckel versehenen Acrylbehälter (180 cm x 180 cm x 240 cm hoch). </li></ol></li><li> Für kurzfristige Fütterung, verhungern Fliegen für 18 bis 24 Stunden vor dem Fliegen zu dem radiomarkierten Nahrung für eine 2 übertragen -. 3 h Zuführschritt T er Hunger Schritt ist wichtig , weil gefüttert Fliegen nicht zuverlässig essen eine neue Quelle der Nahrung zu ihnen präsentiert . Für langfristige Fütterung über den Verlauf von 5 - 7 Tage die, braucht nicht fliegt verhungert, aber der Experimentator sollte der Wassergehalt des radiomarkierten Nahrung in den Fläschchen entfernt untergebracht sind, in und mit einer Nadel und Spritze überwachen Wasser Fläschchen hinzufügen mit trockenen Lebensmitteln. </li><li> Transfer fliegt nach unmarkierten Nahrung durch &quot;Klopfen&quot;, um sie in ein neues Fläschchen. Eine erste Verfolgungsjagd Zeitraum von 2-4 h erlaubt Fliegen radiomarkierten Nahrungspartikel aus ihren Häutchen zu reinigen und ermöglicht die Verdauung von radioaktiven Markered Nahrung im Darm verbleiben. Überwachung der Fortschritte der Nahrung durch den Darm durch visuelle Inspektion von Fliegen für blaue Bäuche zu suchen. </li><li> Anschließend Transfer fliegt nach verschiedenen Arten von Lebensmitteln - oder Umgebungstemperaturen (12 24 h auf Standardnahrung oder 1% Agar für die Messung der Auswirkungen von im Vergleich zu nüchternen Zustand auf die Atmung gefüttert) (12 - 96 Stunden bei 18 ° C oder 30 ° C für die genetische Manipulationen mit temperaturempfindlichen GAL80 (GAL80 ts), für zB). Anmerkung: Die Länge dieser chase Zeit wird variieren mit dem Experiment durchgeführt wird. Für zB eine 96 Stunden Chase bei 30 ° C in Experimenten notwendig sein kann , GAL80 ts , um mit zu aktivieren vollständig GAL4-abhängige Transgen - Expression. </li></ol> 3. Herstellung der CO 2 -Sammlung Vorrichtung <ol><li> Montieren Sie Materialien zu konstruieren &quot;fliegen Pods&quot;, Mesh-capped Rohre , die mit 14 C-Glucose oder 14 C-Palmitinsäure und tha markierte Fliegen enthaltent wird in die Atmosphäre offen bleiben. Schneiden Sie die Top-50-mm von 12 mm x 75 mm Polypropylen-Röhrchen, so dass 25 mm lang, mit rundem Boden Rohre ab. Bereiten Sie 35 mm x 35 mm Quadrate von 130 &amp; mgr; m Nylon-Mesh. Außerdem erhalten transparente Band in einem Bandspender. </li><li> Montieren Sie Materialien für die CO 2 -collection Apparate. Für jede pod fliegen, ein 20-ml-Glas Szintillationsphiole, ein Gummi oberen Anschlag mit einem außermittig Loch montieren, ein Zentrum und durch das Loch in der oberen Stopfen Typ GF / B Glasmikrofaserfilterpapier (2,1 cm Durchmesser eingesetzt zu werden Kreis, 1 &amp; mgr; m Poren). GF / B Filterpapier wird wegen seiner hohen Nassfestigkeit und eine hohe Ladekapazität verwendet. </li><li> Bereiten Sie 5% KOH frisch am Tag der Nutzung. Kurz vor dem Schritt 3.4, falten und legen Sie den Kreis GF / B-Filterpapier in der Mitte gut, dass durch das Loch des Gummi oberen Stopfen mit Gewinde versehen ist und sättigen sie mit 100 ul 5% KOH. Siehe Abbildung 1. </li><li> Nach der Inkubation (s) an unmarkiertem Medien, anesthetize fliegt mit CO 2. Pinsel fliegt in der Cutoff-Polypropylen-Röhrchen, Kappe mit Nylon-Mesh, und verwenden Sie transparentes Band Mesh Rohr zu halten. Arbeiten Sie schnell fliegt aufwachen und Flucht zu vermeiden, bevor das Netz auf das Rohr sicher angebracht wurde. Eine gleiche Anzahl von Fliegen sollte für ein bestimmtes Experiment in jeder Fliegen pod verwendet werden; 10 - 20 Fliegen pro Fliege pod produzieren ausreichend radioaktiv markiertem CO 2 für die Messung durch Szintillationszählung (Schritt 4.1 unten). </li><li> Übertragen Sie die Fliege pod auf eine 20-ml-Glas Szintillationsphiole. Verschließen Sie die Glasflasche mit der Gummi oberen Stopper hält ein Zentrum Vertiefung mit KOH-gesättigten GF / B-Filterpapier. Falten Sie die breite Spitze des Gummi oberen Anschlag über die Lippe des Glasszintillationsröhrchen. Siehe Abbildung 1. </li><li> Set Glasfläschchen Fliegen in einem Deckel versehenen Acrylbehälter, und Inkubation für verschiedene Zeiträume (2 bis 12 Stunden funktioniert gut) enthält. </li></ol> 4. Analyse der Ergebnisse <ol><li> Beimdas Ende der Inkubation uncap Glasphiolen und Übertragungs KOH-gesättigtem GF / B-Filterpapier auf eine 6-ml-Plastik Szintillationsfläschchen 4 ml Szintillationscocktail enthielt. </li><li> Bei Bedarf einfrieren Fliegen im Fliegenhülsen auf Trockeneis und bei -80 ° C für die spätere Bestimmung der gespeicherten Substrate. Beachten Sie, dass diese Proben sind radioaktiv und müssen entsprechend gespeichert werden. </li><li> Bereiten Sie zusätzliche Szintillationsgefäße: eine nicht verwendete GF / B-Filterpapier enthält als Hintergrund dienen und 01.59 andere enthält 0,1-0,5 uCi radiomarkierte Substrat cpm / &amp; mgr; Ci zu bestimmen. </li><li> Messung der cpm für jede Probe einen Szintillationszähler unter Verwendung von nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Berechnen pmol 14 CO 2 / cpm und pmol 14 CO 2 pro fly pro Stunde. Ziehen Sie den Hintergrund cpm aus dem cpm-Wert für jede Probe. Von den ordentlichen radiomarkierte Substrat Daten, berechnen die Hintergrund-korrigierte cpm / &amp; mgr; Ci Probe gezählt. <ol><li> Verwenden Sie dieHersteller bereitgestellten spezifischen Aktivität und radiochemische Konzentration des radiomarkierten Substrats (beispielsweise 50 &amp; mgr; Ci / &amp; mgr; Mol und 0,1 &amp; mgr; Ci / &amp; mgr; l, jeweils) pmol / cpm zu berechnen. Verwenden Sie diesen Faktor Daten Hintergrund korrigierten fly - Pod aus cpm konvertieren 14 CO 2 / Probe pmol 14 CO 2 / Probe. Dann teilen Sie durch die Anzahl der Fliegen und der Anzahl der Stunden in der Flug Pod. </li></ol></li></ol>

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Der Autor erklärt keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Oxidation von spezifischen radiomarkierten Substraten in erwachsenen Drosophila melanogaster zu messen. Diese Technik ist einfach, quantitative, reproduzierbare und empfindlich, und es ergänzt die bestehenden Methoden , die Gesamt - CO 2 -Produktion und O 2 Verbrauch messen , weil sie verwendet werden , können die Nährstoff (s) zur ATP - Produktion oxidiert zu identifizieren. Die Messung von CO 2 aus der Oxidation von spezifischen radiomarkierten Substrate befreiten das hier beschriebene Verfahren unter Verwendung von komplementär zu Techniken , die Gesamt - CO 2 -Produktion messen. Gesamt - CO 2 -Produktion (V CO2) ermöglicht Abschätzung der Stoffwechselrate und, wenn die Gesamt O 2 -Verbrauch (V O2) bekannt ist, kann die Stoffwechselrate zu berechnen und die Kraftstoffquelle für die Oxidation geschätzt auf das Atmungsaustauschverhältnis basieren kann (V CO2 / V O2 = RER). WannKohlenhydrate sind ausschließliches Substrat, RER = 1, aber wenn Fettsäuren sind die ausschließliche Quelle, RER = 0,7, auf die Stöchiometrie der Reaktionen von Glucose und Lipidoxidation aufgrund. In Abwesenheit von Geräten Sauerstoffverbrauch in Drosophila 14 die oxidative Brennstoffquelle identifiziert werden können , nicht zu messen. Jedoch durch Kennzeichnung mit Spuren von einem radioaktiven Substrat oder einem anderen und Messraten von radiomarkiertem CO 2 -Produktion fliegt, kann man Rückschlüsse auf die Fähigkeit von Fliegen zeichnen einem gegebenen Substrat zu verschiedenen Zeitpunkten während eines Reizes oder über die Auswirkungen einer zu oxidieren Mutation auf Brennstoffoxidation gegeben. Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte in diesem Protokoll. Zunächst sollte darauf geachtet werden, wenn radioaktive Stoffe unter Verwendung von Leckagen und Verschmutzung von Forschungsbereichen zu vermeiden. Zweitens, wenn Fliegen während der Schritte 2.1 und 3.4 anesthetizing, sollte der Experimentator arbeiten schnell 2 Auswirkungen einer lang anhalt CO zu vermeidenBelichtung auf den Stoffwechsel und das Verhalten. Eine Gruppe von 20 Fliegen können anästhesiert und in ein neues Fläschchen oder in eine Fliege pod in 20 s oder weniger übertragen werden. Wenn Sie von einem Narkosegerät auf ein Lebensmittel Fläschchen übertragen, sollte das Fläschchen auf seiner Seite ausgeruht zu betäubten Fliegen verhindern, dass auf der Lebensmitteloberfläche stecken zu bleiben. Wenn Fliegen gefüttert radiomarkierten Nahrung im Laufe von mehreren Tagen, wie in Schritt 2.2 sind, sollte der Experimentator zu versichern, dass das Essen nicht austrocknet wie Fliegen empfindlich gegen Austrocknung sind. Das zugeführte oder nüchternen Zustand vor der Markierung, die Wahl des Etiketts, die Länge der Markierungszeit, die Zeitdauer, in der Flug pod, und die Methode der Anästhesie sind Parameter, die zur Fehlerbehebung und Modifikation unterzogen werden kann, wenn mit dieser Technik. Zunächst fliegt kurze Beschriftungszeiten unterworfen (2 - 3 h) sind keine wesentlichen Mengen an radiomarkiertem Lebensmittel zu konsumieren, es sei denn, vorher einer Fastenperiode ausgesetzt. Zweitens, die Wahl der Markierung ceinen Einfluss auf die Schlussfolgerungen einer ist in der Lage über metabolische Phänotypen zu ziehen. Zum Beispiel reflektiert radiomarkierten CO 2 -Produktion von D- [1- 14 C] -Glucose Oxidation durch den Zitronensäurezyklus oder der Pentosephosphat- Shunt, während radioaktiv markiertem CO 2 -Produktion von D- reflektieren kann [6- 14 C] -Glucose Oxidation durch den Zitronensäure - Zyklus nur 12,15,16. Feeding Fliegen mit einer radioaktiv markierten Tracer für eine essentielle Aminosäure 17,18 wäre eine gute Strategie sein , aus Proteinen abgeleitet Oxidation von Aminosäuren zu bewerten. Schließlich langen Markierungsperioden mit radioaktiv markierter Glukose auch die Möglichkeit des Einbaus dieses Vorläufers in andere Klassen von Molekülen wie Triglyceride 19 und Aminosäuren zu erhöhen , wie beispielsweise Alanin, die leicht mit Pyruvat Knotens ineinander. Dies kann durch die Radioaktivität in diesen verschiedenen Klassen von Molekülen 6 eingebaut Messung bewertet werden. Tatsächlich getrennten Kohorten von Fliegen können gefüttert rad werdeniolabeled Substrate in der gleichen Weise , und dann für das Fliegen pod Experimente oder die Messung von radioaktiven Marker verwendet , die gespeichert ist , und bleibt in Glykogen und Triglyceriden im fed und fasteten Bedingungen 6, zum Beispiel. Eine andere Strategie ist kurz Kennzeichnung Perioden zu verwenden, die wahrscheinlich die Oxidation der radiomarkierten Nahrung Nährstoffe zu offenbaren sich und nicht die Speicherformen dieser Nährstoffe. Drittens ist es auch möglich , dass zwei Gruppen von Fliegen identischen Raten von 14 CO 2 -Produktion über eine bestimmte Zeit haben könnte, aber sehr unterschiedlichen Raten zunächst. Daher die Variation der Menge an Zeit vergeht in der Flug pod ausgeben kann ein wichtiger Parameter zu ändern, wenn phänotypische Variation der Beurteilung. Schließlich ruft dieses Protokoll für die Verwendung eines kurzen Zeitraums von CO 2 Anästhesie bei Fliegen in die Fliegen pod Vorrichtung setzen. Es ist möglich , dass die CO 2 Anästhesie Stoffwechselfunktion im Verlauf der Flug pod Experiment beeinflussen können. Eine alternative einNSATZ Stickstoff Anästhesie verwendet werden, die nicht mehr als 20 metabolische Rate nicht beeinträchtigt. Wie bei jeder Technik, die ein solch komplexes System als Brennstoff Oxidation und metabolische Rate hat hier beschrieben, wobei das Verfahren Einschränkungen misst. Erstens ist es möglich , die in verschiedenen Gruppen fliegt unterschiedliche Mengen an radiomarkiertem Nahrungsmittel verbrauchen könnte und damit die CO 2 Sammelphase des Assays mit unterschiedlichen Ausgangsmengen Substrat würde ein. Dies kann zu einem gewissen Grad gesteuert werden, indem das Experiment mit großen Probengrößen durchführen und von Fliegen en masse füttern. Für kurze Beschriftungszeiten, fliegt mit ähnlichen blaugefärbte Mumm die radioaktive Markierung verbraucht haben und können sich auf die Jagd Teil des Experiments durchgeführt werden. Die Menge an radioaktiver Markierung in einer Gruppe von Fliegen übrigen kann auch am Ende des Versuchs und in getrennten Kohorten von Fliegen nach dem Ende der Zuführ- und Anfangs chase Periode gemessen werden. Zweitens sind die Aktivitätswerte zwischenGruppen von Fliegen in den Fliegenhülsen unterscheiden. Dies wird experimentell und berücksichtigt bestimmt werden, wenn die Daten zu interpretieren. Drittens ist diese Technik nicht die gesamte CO 2 -Produktion zu messen, nur die Produktion von einem bestimmten Nahrungs Nährstoff oder die Speicherform (en) dieser Nährstoff. Dieses Protokoll ist kein Ersatz für sondern komplementär zu Messungen des VCO 2 , weil es unterschiedliche und zusätzliche Informationen zur Verfügung stellt. Das hier beschriebene Verfahren misst ausgeatmeten, radiomarkierten CO 2 , die ein Produkt der Oxidation von Spurenmengen von spezifischen metabolischen Substraten ist. Durch Variieren der verwendeten Markierung - Glucose, Fettsäure oder Aminosäure - kann man immer raffiniertere Experimente entwerfen, um die Beiträge verschiedener Substrate Metabolismus unter verschiedenen physiologischen Bedingungen, wie Hunger und auf verschiedenen genetischen Hintergründen zu beurteilen. Zukünftige Anwendungen dieser Technik sind die Messung von metabolism in die Larven- und Puppenstadien der Entwicklung, zwei Stufen des Drosophila - Lebenszyklus , die durch extreme Nährstoffspeicherung und Abbau auszeichnen, respectively.

Die Arbeit im Modellorganismus Drosophila melanogaster hat wesentlich zum Verständnis der genetischen Prinzipien beigetragen, Entwicklungsprozesse, Wachstum, Alterung, Verhalten, Immunität und Krankheit beim Menschen 1,2. Eine Vielzahl von genetischen und zellbiologische Ansätze in Drosophila hat Fortschritte in diesen Bereichen angetrieben. Jedoch hat die Untersuchung des Stoffwechsels in der Fruchtfliege in Messstoffwechselparameter in einer so kleinen Tier langsamer, was zum großen Teil zu Schwierigkeiten entwickelt. Das Interesse an der Verwendung von Drosophila als Modell zur Untersuchung von menschlichen Krankheiten wie Diabetes und für das Verständnis der Beiträge des Stoffwechsels zu Wachstum und verschiedenen Pathologien hat das Feld geschoben zu entwickeln und metabolische Techniken für diesen Organismus 3,4 anzupassen. Zuverlässige Methoden sind nun für die Messung einer Reihe von Stoffwechselparametern in der Fruchtfliege erhältlich. Zum Beispiel ist es einfach, die Nahrungsaufnahme zu beurteilen <sbis&gt; 5, Ebenen gespeichert Triglyceriden und Glykogen, sowie zirkulierende Hämolymphe Glukosespiegel und dem Hauptzirkulations Zucker in der Fliege, Trehalose, die ein Disaccharid aus zwei Molekülen Glucose 4 zusammengesetzt ist. Verwendung von Stoffwechsel Tracer hat das Studium der Nährstoffaufnahme aus der Nahrung und der Umwandlung der absorbierten Nährstoffen, wie Glucose , um die Speicherformen Glykogen und Triglyceriden 6 aktiviert. Metabolic Raten können in der Taufliege durch die Messung des Sauerstoffverbrauchs 7,8 und Kohlendioxid (CO 2) Produktion beurteilt werden. Der Zitronensäurezyklus oxydiert zwei Kohlenstoffeinheiten, die den Zyklus als Acetyl-Coenzym A (CoA) eingeben können, die aus dem Stoffwechsel der diätetischen und gespeicherten Kohlenhydraten und Fettsäuren abgeleitet ist. Jede Runde des Zyklus erzeugt ein Molekül jedes von GTP (oder ATP) und den Elektronendonor FADH 2, drei Moleküle von NADH, und zwei Moleküle des Abfallproduktes CO 2. CO 2 -Produktion könnenabzuschätzen Grundumsatz verwendet werden. Gesamt - CO 2 -Produktion kann in Drosophila durch die Verwendung von im Handel erhältlichen oder handgemachten Respirometer 9-10,11 quantifiziert werden. Die Messung der gesamten CO 2 -Produktion, vor allem wenn sie mit Messung von O 2 -Verbrauch liefert wertvolle Einblicke in die Ganzkörper - Energie - Stoffwechsel. Allerdings ist diese Maßnahme nicht den Nährstoff identifizieren wird für Adenosintriphosphat (ATP) Produktion oxidiert. Drei Hauptklassen von Nährstoffen können die Zitronensäure-Zyklus nach der Umstellung geben zu Acetyl-CoA: Kohlenhydrate, Fettsäuren und Proteinen. Glucose-6-Phosphat, abgeleitet von Nahrungs Glucose oder Glycogen gespeichert, kann zu Pyruvat umgewandelt werden, die durch Pyruvat-Dehydrogenase decarboxyliert Acetyl-CoA zu bilden. Aufteilung der Fettsäuren aus der Nahrung stammen oder aus gespeicherten Triglyzeride durch ß-Oxidation Ausbeuten Acetyl-CoA, die dann den Zitronensäure-Zyklus eintritt. Endlicheine Mehrheit von Aminosäuren, die Zitronensäure-Zyklus nach der Umstellung zu Pyruvat, Acetyl-CoA oder Zitronensäurezyklus Zwischenprodukte wie Alphaketoglutarat eingeben. Nährstoff spezifischen Beitrag zur Energiestoffwechsel während der basalen und stimulierten Bedingungen kann durch die Verwendung von radioaktiven Tracern überwacht werden. Das Protokoll hier präsentiert wird zur Verwendung in Drosophila von einem Protokoll zur Beurteilung Oxidation in Zellen in Kultur gezüchtet 12,13 verwendet angepasst. Bei diesem Ansatz Fruchtfliegen gefüttert werden 14 C-radiomarkierten metabolischen Substrate (Kohlenhydrate, Fettsäuren oder Aminosäuren) in der Ernährung für eine kurze (Stunden) oder lang (Tage) Puls, auf unmarkierten Lebensmittel gejagt, und dann zu einem exponierten Kammer zum Einfangen der ausgeatmeten CO 2 als Bicarbonat Kaliumhydroxid (KOH) -gesättigtes Filterpapier enthält. Radioaktiv markiertes Bicarbonat kann durch Scintillationszählung quantifiziert werden. Unterschiede in der radiomarkierten-CO 2 -Produktion zwischen Experimental Gruppen von Fliegen können die Verwendung von verschiedenen Brennstoffen für die ATP-Produktion im Laufe eines längeren schnell oder intrinsische Unterschiede in der Kraftstoffmetabolismus zwischen Genotypen, zum Beispiel reflektieren.

<table><tbody><tr><td>PALMITINSÄURE, [1-14C]-, 50 & Mikro; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC075H050UC</td><td></td></tr><tr><td>GLUKOSE, D-[6-14C]-, 50 & Mikro; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC045X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Glukose, D-[1-14C]-, 50&Mikro; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC043X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Fläschchen, schmal, Polystyrol</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen-Röhrchen mit rundem Boden, 12 x 75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959AA</td><td></td></tr><tr><td>Mesh, Nitex Nylon, 120 & Mikro; m</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Szintillationsfläschchen aus Borosilikatglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-15</td><td></td></tr><tr><td>Kolbenverschluss mit außermittigem Loch</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882310-0000</td><td></td></tr><tr><td>Mittelschacht aus Polypropylen</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882320-0000</td><td></td></tr><tr><td>Whatman GF/B Glasmikrofaser-Filterpapier, Kreis, 2,1 cm Durchmesser</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-874-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td></td></tr> 6 <tr><td>ml Szintillationsfläschchen mit Push-On/Twist-Off-Kappen</td><td>National Diagnostics</td><td>SVC-06</td><td></td></tr></tbody></table>

die messung der kohlendioxidproduktion von radiolabeled substrate in<em&gt; drosophila melanogaster</em

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

Die Kraft der Drosophila Genetik wird zunehmend auf die Fragen der Hormon Signalisierungs- und Metabolismus und der Entwicklung von Modellen der menschlichen Krankheit in diesem Organismus angewendet. Empfindliche Verfahren für die Messung von Parametern, wie Stoffwechselraten sind erforderlich, um das Verständnis der Physiologie und Krankheiten bei Kleintieren wie der Fruchtfliege zu fahren. Das hier beschriebene Verfahren bewertet Brennstoffoxidation in einer kleinen Anzahl von erwachsenen Fliegen gefüttert Lebensmittel , die Spurenmengen von 14 C-markierten Substraten , wie beispielsweise Glucose oder Fettsäure. Nach der Fütterungszeit und zusätzliche experimentelle Manipulationen sind Fliegen kurze Rohre mit Mesh - capped übertragen, die in Glasfläschchen dann platziert werden , enthaltend KOH-gesättigtem Filterpapier , das Fallen abgeatmet, 2 radioaktiv markiertem CO aus der Oxidation von radiomarkierten Substraten wie Kaliumbicarbonat erzeugt, 3 KHCO. Diese radiomarkierten Bicarbonat wird durch Szintillationszählung gemessen. Dies ist aqengen, reproduzierbaren und einfachen Ansatz für die Untersuchung der Brennstoffoxidation. Die Verwendung von radiomarkierten Glucose, Fettsäuren oder Aminosäuren erlaubt die Bestimmung des Beitrags dieser verschiedenen Energiequellen zu den Energiestoffwechsel unter verschiedenen Bedingungen wie Fütterung und Fasten und in verschiedenen genetischen Hintergründen. Dies ergänzt andere Ansätze in vivo Energiestoffwechsel zu messen und sollte das Verständnis der Stoffwechselregulation fördern.

Die Menge der ausgeatmeten und eingefangen radiomarkierten CO 2 , die aus dem Metabolismus eines radioaktiven Substrat hergestellt wird , sollte die Anzahl der Fliegen in einer Fliege pod sowie die Zeit korrelieren die Tiere in der CO 2 - Sammelvorrichtung verbringen. Um dies zu testen, Fliegen , die 18 Stunden gefastet wurden für 2 h radiomarkierten Palmitinsäure (0,02 uCi / ul Nahrung) zugeführt und dann radioaktiv markiertem CO 2 -Produktion in Gruppen von 12 oder 25 Tiere für 3 oder 6 Stunden Inkubationen getestet. Die Menge an CO 2 von 25 Fliegen hergestellt war fast die doppelte Menge von 12 Fliegen hergestellt, und die Menge für jede Gruppe verdoppelt , wenn die Inkubationszeit von 3 h bis 6 h (2A) erhöht wurde. Die pmol 14 CO 2 / fliegen / h war in jeder Gruppe fast gleichwertig. Fasten stimuliert den Abbau von Fettsäuren durch ß oxidation; daher CO 2 -Produktion von Fettsäureoxidation sollte bei nüchternen Tieren im Vergleich mit gefütterten Tieren erhöht werden. Um festzustellen, ob dies der Fall war, 18 h gefastet Fliegen wurden für 2 h radiomarkierten Palmitinsäure zugeführt. Nach dieser kurzen Fütterungspuls wurden Fliegen in zwei Gruppen eingeteilt und es wurde 3 h auf unmarkierten fly Lebensmittel oder 1% Agar übertragen und dann Hülsen für 2 h zu fliegen übertragen. In zwei getrennten Versuchen Fliegen auf Agar erzeugt deutlich mehr radioaktiv markiertem CO 2 im Vergleich mit Fliegen auf Nahrung (2B) gejagt gejagt, was darauf hinweist , dass ß - Oxidation in den nüchternen Tiere erhöht. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Vorrichtung zum Sammeln ausgeatmeten Radiolabeled CO 2. Flies, die radioaktiv markierten metabolischen Substrate verbraucht sindplatziert in einem &quot;fliegen pod&quot; (FP), Rohr ein Cutoff-Zentrifuge mit Mesh (M) mit einer Kappe bedeckt. Die Fliege pod wird in ein Fläschchen 20 ml Glas-Scintillations gelegt und verschlossen mit einem Gummi oberen Stopfen (S), die eine außermittige Bohrung, durch die ein Zentrum ist gut positioniert (CW), die GF / B-Filterpapier enthält mit 100 ul gesättigten 5% KOH. Ausgeatmeten CO 2 reagiert mit dem KOH und wird auf dem Filterpapier als Bicarbonat gefangen. Gefangen, 2 radiomarkierten CO kann durch Szintillationszählung des gesättigten Filterpapier quantifiziert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig2.jpg" /> Abbildung 2. 14 CO 2 Produktion Korrelate mit der Zeit und die Anzahl der Fliegen in einemFly Pod und Reagiert auf Fed und fasteten Bedingungen. (A) Die Menge von 14 CO 2 in Fliegen erzeugt radiomarkierten Palmitat gespeist korreliert mit der Anzahl der Fliegen getestet (n = 12 (offene Balken) oder 25 (geschlossene Balken)) und die Zeit in einer Fliege pod verbracht (3 oder 6 Stunden ). Auf einer Pro-fly - Basis, hergestellt Fliegen 0,99, 1,13, 1,10 und 1,01 pmol 14 CO 2 / h (Daten in der gleichen Reihenfolge von links nach rechts als Grafik - Daten aufgeführt). (B) Flies , die auf Agar gejagt wurden oxidiert mehr radiomarkierten Palmitat als Fliegen , die auf Nahrung gejagt wurden. Die Daten stammen aus zwei Experimenten und sind als Mittelstandardabweichung, n = 16 - 17 Fliegen / Gruppe (Versuch 1); n = 10 Fliegen / Gruppe (Experiment 2). * P = 0,017, Student-t-Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Messung der Kraftstoffoxidation in Drosophila melanogaster, bei der Spuren von spezifischen radioaktiv markierten Stoffwechselsubstraten an Fliegen verfüttert werden. Das ausgeatmete radioaktivmarkierte CO 2, das bei der Oxidation von Brennstoffen entsteht, wird gesammelt und gemessen.

Die Messung der Kohlendioxidproduktion von Radiolabeled Substrate in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Kohlendioxid zu messen, das von intakten Fruchtfliegen unter Verwendung radioaktiv markierter Substrate wie Palmitinsäure oder Glukose produziert wird. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen für Drosophila-Forscher zu beantworten, beispielsweise, ob eine bestimmte Mutation den Energiestoffwechsel beeinflussen könnte. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie quantitative, empfindliche und reproduzierbare Messungen der Oxidation von Brennstoffen in einer geringen Anzahl von Fruchtfliegen ermöglicht.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Montage der Fliegenpod-Vorrichtung eine schnelle Handhabung kleiner Teile erfordert, um eine korrekte Konstruktion der Versuchsapparatur sicherzustellen, bevor die Fliegen sich von der Anästhesie erholen. Kohlenstoff-14 ist ein Betastrahler mit geringer Energie und hat eine kurze Reichweite in Luft, dennoch ist Vorsicht geboten, um ein Verschütten von radioaktiv markierten Molekülen oder eine versehentliche Aufnahme durch den Experimentator zu vermeiden. Mischen Sie ein bis zwei Mikrocurie radioaktiv markiertes Substrat mit 15 Mikrolitern FD&C Number One blauer Lebensmittelfarbe und Wasser, um ein Gesamtvolumen von 25 Mikrolitern zu erhalten.Leiten Sie den gesamten mit Radioisotopen markierten Substrat- und Farbstoffgemisch in den Boden einer leeren Fliegenfutter-Röhrchen. Da Fliegenfutter-Röhrchen leicht umkippen, stellen Sie sicher, dass sie in einem Behälter aufbewahrt werden, der ein Umfallen verhindert. Erwärmen Sie herkömmliches Fliegenfutter in einem Mikrowellenofen, bis das Futter gerade verflüssigt ist.15 bis 20 Sekunden auf hoher Leistungsstufe sind in der Regel ausreichend für ein Gefäß mit 10 Milliliter Nahrung. Geben Sie 975 Mikroliter der geschmolzenen Nahrung zur radioaktiv markierten Substrat- und Blaufärbemischung hinzu und schwenken Sie die Mischung schnell, während Sie die Gleichmäßigkeit der blauen Färbung überwachen, um eine vollständige Durchmischung sicherzustellen. Die Spitzen von Pipettenspitzen müssen möglicherweise mit einer Schere abgeschnitten werden, um das enge Ende zu verbreitern und so eine genaue Abfüllung der viskosen, geschmolzenen Nahrung zu ermöglichen.Lassen Sie das Futter 20 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen und vollständig erstarren. Zur Betäubung erwachsener Fliegen wird ein Kohlendioxid-Betäubungsgerät verwendet, das aus porösem Polyethylen besteht, das mit einer Acrylunterseite verbunden ist und über einen Druckregler mit einer Kohlendioxid-Flasche verbunden wird. Leiten Sie Kohlendioxid mit einer Strömungsrate von fünf Litern pro Minute in das Betäubungsgerät.Überführen Sie die betäubten Fliegen in Gefäße, die mit radioaktiv markiertem, blaufärbigem Futter gefüllt sind. Verschließen Sie jedes Gefäß mit einem Schaumstoffstopfen und legen Sie es horizontal, bis die Fliegen aufwachen. Danach bringen Sie die Gefäße in einen verschließbaren Acrylbehälter.Bei der Kurzzeitfütterung sollten die Fliegen 18 bis 24 Stunden vor ihrer Übertragung auf radioaktiv markiertes Futter entwöhnt werden, um sicherzustellen, dass sie während des zwei- bis dreistündigen Fütterungsschritts fressen. Bei der Langzeitfütterung über einen Zeitraum von fünf bis sieben Tagen ist eine Entwöhnung nicht erforderlich; der Experimentator sollte jedoch den Wassergehalt des radioaktiv markierten Futters in den Röhrchen überwachen und mit einer Nadel und einer Spritze Wasser in Röhrchen mit trockenem Futter nachfüllen. Sobald die Fütterung mit dem radioaktiv markierten Substrat abgeschlossen ist, überführen Sie die Fliegen, indem Sie sie in ein neues Röhrchen übertragen, auf nicht markiertes Futter.Eine anfängliche Spülphase von zwei bis vier Stunden ermöglicht es den Fliegen, radioaktiv markierte Nahrungspartikel von ihren Cuticula zu entfernen, und erlaubt die Verdauung der im Darm verbliebenen radioaktiv markierten Nahrung. Überwachen Sie den Fortschritt der Nahrung durch den Darm durch visuelle Kontrolle der Fliegen auf blaue Abdomina. Danach überführen Sie die Fliegen in verschiedene Nahrungstypen oder Umgebungstemperaturen.Die Länge dieser Verfolgungsphase variiert je nach dem durchgeführten Experiment. Bevor die Apparatur zur Kohlendioxid-Sammlung hergestellt wird, sammeln Sie die Materialien, um Fliegenkammern zusammenzubauen, welche röhrenförmige Behälter mit Netzverschluss sind und Fliegen enthalten, die mit C-14 markierter Glukose oder C-14 markierter Palmitinsäure markiert wurden, und die der Atmosphäre offen bleiben. Spannen Sie eine Rasierklinge mit einer Pinzette ein, erhitzen Sie sie in der Flamme eines Bunsenbrenners, bis sie rotglühend ist, und schneiden Sie mit der erhitzten Klinge die oberen 50 Millimeter von 12 Millimeter mal 75 Millimeter großen Polypropylenröhrchen ab, sodass 25 Millimeter lange Röhrchen mit rundem Boden übrig bleiben.Bereiten Sie 35 Millimeter mal 35 Millimeter große Quadrate aus 130 Mikrometer Nylonnetz vor. Schneiden Sie mehrere ein und einhalb bis zwei Zoll lange Stücke durchsichtiges Klebeband zurecht. Danach stellen Sie die Materialien für die Kohlendioxid-Sammelapparatur zusammen.Stellen Sie für jede Fliegenkapsel ein 20-Milliliter-Glasküvettenfläschchen, einen mit Gummi überzogenen Stopfen mit exzentrischem Loch, ein Mittelgefäß und Glas-Mikrofaservliesfilterpapier der Güteklasse GFB zusammen. Führen Sie das Mittelgefäß durch das Loch im oberen Stopfen ein. Bereiten Sie frisch am Tag der Verwendung 5 % Kaliumhydroxid vor.Kurz vor der Anästhesie der Fliegen für die Übertragung in die Fliegenkammer falten und platzieren Sie das runde GFB-Filterpapier in die mittlere Vertiefung, die durch das Loch des gummierten Stopfens geführt wird, und tränken Sie es mit 100 Mikrolitern 5%iger Kaliumhydroxidlösung. Das Übertragen der anästhesierten Fliegen in die Fliegenkammern ist der schwierigste Schritt dieses Protokolls. Um Erfolg zu gewährleisten, halten Sie alle benötigten Materialien griffbereit und arbeiten Sie schnell, um die Exposition der Fliegen gegenüber Kohlendioxid zu begrenzen und zu verhindern, dass die Fliegen aufwachen und entkommen, bevor das Netz sicher an dem Röhrchen befestigt wurde.Nach der Inkubation auf nicht markierten Medien betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxid. Bürsten Sie die betäubten Fliegen in den abgeschnittenen Polypropylenbehälter, verschließen Sie diesen mit dem Nylongewebe und befestigen Sie das Gewebe mit durchsichtigem Klebeband am Behälter. Für ein bestimmtes Experiment sollte in jeder Fliegenkammer eine gleiche Anzahl von Fliegen verwendet werden.10 bis 20 Fliegen pro Fliegenkammer erzeugen ausreichend radioaktiv markiertes Kohlendioxid, um es mittels Szintillationszählung zu messen. Überführen Sie die Fliegenkammer in eine 20-Milliliter-Glasküvette für die Szintillationszählung. Verschließen Sie die Glasflasche mit einem Gummistopfen, der ein Zentralküvettengefäß mit kaliumhydroxidgesättigtem GFB-Filterpapier enthält.Die breite Oberseite des gummierten Stopfens über die Kante des Glas-Scintillationsgefäßes falten. Die Glasgefäße mit den Fliegen in einen verschließbaren Acrylbehälter stellen und für unterschiedliche Zeiträume inkubieren. Am Ende der Inkubation das Glasgefäß öffnen und das mit Kaliumhydroxid gesättigte GFB-Filterpapier in ein sechs Milliliter fassendes Plastik-Scintillationsgefäß überführen, das 4 Milliliter Szintillationscocktail enthält.Bereiten Sie zusätzliche Szintillationsgefäße vor, eines davon mit unbenutztem GFB-Filterpapier als Hintergrundprobe sowie ein bis zwei weitere Gefäße mit 0,1 bis 0,5 Mikrocurie radioaktiv markiertem Substrat, um die Zählraten pro Minute pro Mikrocurie zu bestimmen. Messen Sie mithilfe eines Szintillationszählers die Zählraten pro Minute für jede Probe gemäß der Herstellerprotokollvorgabe. Berechnen Sie anschließend die gesamte Kohlendioxidproduktion, wie im Protokolltext beschrieben.Die Fliegen wurden 18 Stunden lang gefastet, erhielten zwei Stunden lang radioaktiv markierte Palmitinsäure und wurden anschließend in Gruppen von 12 oder 25 Tieren auf die Produktion von radioaktiv markiertem Kohlendioxid über Inkubationszeiten von drei oder sechs Stunden getestet. Wie in diesem Diagramm dargestellt, war die Menge des von 25 Fliegen produzierten Kohlendioxids nahezu doppelt so hoch wie die von 12 Fliegen, und die Menge jeder Gruppe verdoppelte sich, wenn die Inkubationszeit von drei auf sechs Stunden erhöht wurde. Die picomolare Menge an radioaktiv markiertem Kohlendioxid pro Fliege und Stunde war in jeder Gruppe nahezu gleich.Da das Fasten den Abbau von Fettsäuren durch β-Oxidation stimuliert, sollte die Produktion von Kohlendioxid aus der Oxidation von Fettsäuren bei gefasteten Tieren im Vergleich zu gefütterten Tieren erhöht sein. Um dies zu überprüfen, wurden 18 Stunden gefastete Fliegen zwei Stunden lang mit radioaktiv markierter Palmitinsäure gefüttert, in zwei Gruppen aufgeteilt und anschließend entweder auf nicht markiertes Fliegenfutter oder auf 1 % Agar überführt. In zwei separaten Experimenten produzierten die auf Agar gehaltenen Fliegen signifikant mehr radioaktiv markiertes Kohlendioxid als die auf Nahrung gehaltenen Fliegen, was darauf hindeutet, dass die β-Oxidation in den gefasteten Tieren erhöht war.Nach Durchführung dieses Verfahrens können ergänzende Methoden wie die Messung der gesamten Kohlendioxidproduktion und des gesamten Sauerstoffverbrauchs sowie die Berechnung des respiratorischen Austauschverhältnisses durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise welche bevorzugte Energiequelle genutzt wird. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie dieses Protokoll verwendet wird, um den Einfluss einer bestimmten Mutation oder experimentellen Manipulation auf die Fähigkeit zur Nutzung eines spezifischen Brennstoffs als Energiequelle zu bestimmen. Vergessen Sie nicht, dass der Umgang mit Radioaktivität gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, Laborkitteln und Schutzbrille sowie die Verwendung geeigneter Abschirmungen stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Forschung

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