Die Messung der Kohlendioxidproduktion von Radiolabeled Substrate in

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Kohlendioxid zu messen, das von intakten Fruchtfliegen unter Verwendung radioaktiv markierter Substrate wie Palmitinsäure oder Glukose produziert wird. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen für Drosophila-Forscher zu beantworten, beispielsweise, ob eine bestimmte Mutation den Energiestoffwechsel beeinflussen könnte. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie quantitative, empfindliche und reproduzierbare Messungen der Oxidation von Brennstoffen in einer geringen Anzahl von Fruchtfliegen ermöglicht.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Montage der Fliegenpod-Vorrichtung eine schnelle Handhabung kleiner Teile erfordert, um eine korrekte Konstruktion der Versuchsapparatur sicherzustellen, bevor die Fliegen sich von der Anästhesie erholen. Kohlenstoff-14 ist ein Betastrahler mit geringer Energie und hat eine kurze Reichweite in Luft, dennoch ist Vorsicht geboten, um ein Verschütten von radioaktiv markierten Molekülen oder eine versehentliche Aufnahme durch den Experimentator zu vermeiden. Mischen Sie ein bis zwei Mikrocurie radioaktiv markiertes Substrat mit 15 Mikrolitern FD&C Number One blauer Lebensmittelfarbe und Wasser, um ein Gesamtvolumen von 25 Mikrolitern zu erhalten.

Leiten Sie den gesamten mit Radioisotopen markierten Substrat- und Farbstoffgemisch in den Boden einer leeren Fliegenfutter-Röhrchen. Da Fliegenfutter-Röhrchen leicht umkippen, stellen Sie sicher, dass sie in einem Behälter aufbewahrt werden, der ein Umfallen verhindert. Erwärmen Sie herkömmliches Fliegenfutter in einem Mikrowellenofen, bis das Futter gerade verflüssigt ist.

15 bis 20 Sekunden auf hoher Leistungsstufe sind in der Regel ausreichend für ein Gefäß mit 10 Milliliter Nahrung. Geben Sie 975 Mikroliter der geschmolzenen Nahrung zur radioaktiv markierten Substrat- und Blaufärbemischung hinzu und schwenken Sie die Mischung schnell, während Sie die Gleichmäßigkeit der blauen Färbung überwachen, um eine vollständige Durchmischung sicherzustellen. Die Spitzen von Pipettenspitzen müssen möglicherweise mit einer Schere abgeschnitten werden, um das enge Ende zu verbreitern und so eine genaue Abfüllung der viskosen, geschmolzenen Nahrung zu ermöglichen.

Lassen Sie das Futter 20 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen und vollständig erstarren. Zur Betäubung erwachsener Fliegen wird ein Kohlendioxid-Betäubungsgerät verwendet, das aus porösem Polyethylen besteht, das mit einer Acrylunterseite verbunden ist und über einen Druckregler mit einer Kohlendioxid-Flasche verbunden wird. Leiten Sie Kohlendioxid mit einer Strömungsrate von fünf Litern pro Minute in das Betäubungsgerät.

Überführen Sie die betäubten Fliegen in Gefäße, die mit radioaktiv markiertem, blaufärbigem Futter gefüllt sind. Verschließen Sie jedes Gefäß mit einem Schaumstoffstopfen und legen Sie es horizontal, bis die Fliegen aufwachen. Danach bringen Sie die Gefäße in einen verschließbaren Acrylbehälter.

Bei der Kurzzeitfütterung sollten die Fliegen 18 bis 24 Stunden vor ihrer Übertragung auf radioaktiv markiertes Futter entwöhnt werden, um sicherzustellen, dass sie während des zwei- bis dreistündigen Fütterungsschritts fressen. Bei der Langzeitfütterung über einen Zeitraum von fünf bis sieben Tagen ist eine Entwöhnung nicht erforderlich; der Experimentator sollte jedoch den Wassergehalt des radioaktiv markierten Futters in den Röhrchen überwachen und mit einer Nadel und einer Spritze Wasser in Röhrchen mit trockenem Futter nachfüllen. Sobald die Fütterung mit dem radioaktiv markierten Substrat abgeschlossen ist, überführen Sie die Fliegen, indem Sie sie in ein neues Röhrchen übertragen, auf nicht markiertes Futter.

Eine anfängliche Spülphase von zwei bis vier Stunden ermöglicht es den Fliegen, radioaktiv markierte Nahrungspartikel von ihren Cuticula zu entfernen, und erlaubt die Verdauung der im Darm verbliebenen radioaktiv markierten Nahrung. Überwachen Sie den Fortschritt der Nahrung durch den Darm durch visuelle Kontrolle der Fliegen auf blaue Abdomina. Danach überführen Sie die Fliegen in verschiedene Nahrungstypen oder Umgebungstemperaturen.

Die Länge dieser Verfolgungsphase variiert je nach dem durchgeführten Experiment. Bevor die Apparatur zur Kohlendioxid-Sammlung hergestellt wird, sammeln Sie die Materialien, um Fliegenkammern zusammenzubauen, welche röhrenförmige Behälter mit Netzverschluss sind und Fliegen enthalten, die mit C-14 markierter Glukose oder C-14 markierter Palmitinsäure markiert wurden, und die der Atmosphäre offen bleiben. Spannen Sie eine Rasierklinge mit einer Pinzette ein, erhitzen Sie sie in der Flamme eines Bunsenbrenners, bis sie rotglühend ist, und schneiden Sie mit der erhitzten Klinge die oberen 50 Millimeter von 12 Millimeter mal 75 Millimeter großen Polypropylenröhrchen ab, sodass 25 Millimeter lange Röhrchen mit rundem Boden übrig bleiben.

Bereiten Sie 35 Millimeter mal 35 Millimeter große Quadrate aus 130 Mikrometer Nylonnetz vor. Schneiden Sie mehrere ein und einhalb bis zwei Zoll lange Stücke durchsichtiges Klebeband zurecht. Danach stellen Sie die Materialien für die Kohlendioxid-Sammelapparatur zusammen.

Stellen Sie für jede Fliegenkapsel ein 20-Milliliter-Glasküvettenfläschchen, einen mit Gummi überzogenen Stopfen mit exzentrischem Loch, ein Mittelgefäß und Glas-Mikrofaservliesfilterpapier der Güteklasse GFB zusammen. Führen Sie das Mittelgefäß durch das Loch im oberen Stopfen ein. Bereiten Sie frisch am Tag der Verwendung 5 % Kaliumhydroxid vor.

Kurz vor der Anästhesie der Fliegen für die Übertragung in die Fliegenkammer falten und platzieren Sie das runde GFB-Filterpapier in die mittlere Vertiefung, die durch das Loch des gummierten Stopfens geführt wird, und tränken Sie es mit 100 Mikrolitern 5%iger Kaliumhydroxidlösung. Das Übertragen der anästhesierten Fliegen in die Fliegenkammern ist der schwierigste Schritt dieses Protokolls. Um Erfolg zu gewährleisten, halten Sie alle benötigten Materialien griffbereit und arbeiten Sie schnell, um die Exposition der Fliegen gegenüber Kohlendioxid zu begrenzen und zu verhindern, dass die Fliegen aufwachen und entkommen, bevor das Netz sicher an dem Röhrchen befestigt wurde.

Nach der Inkubation auf nicht markierten Medien betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxid. Bürsten Sie die betäubten Fliegen in den abgeschnittenen Polypropylenbehälter, verschließen Sie diesen mit dem Nylongewebe und befestigen Sie das Gewebe mit durchsichtigem Klebeband am Behälter. Für ein bestimmtes Experiment sollte in jeder Fliegenkammer eine gleiche Anzahl von Fliegen verwendet werden.

10 bis 20 Fliegen pro Fliegenkammer erzeugen ausreichend radioaktiv markiertes Kohlendioxid, um es mittels Szintillationszählung zu messen. Überführen Sie die Fliegenkammer in eine 20-Milliliter-Glasküvette für die Szintillationszählung. Verschließen Sie die Glasflasche mit einem Gummistopfen, der ein Zentralküvettengefäß mit kaliumhydroxidgesättigtem GFB-Filterpapier enthält.

Die breite Oberseite des gummierten Stopfens über die Kante des Glas-Scintillationsgefäßes falten. Die Glasgefäße mit den Fliegen in einen verschließbaren Acrylbehälter stellen und für unterschiedliche Zeiträume inkubieren. Am Ende der Inkubation das Glasgefäß öffnen und das mit Kaliumhydroxid gesättigte GFB-Filterpapier in ein sechs Milliliter fassendes Plastik-Scintillationsgefäß überführen, das 4 Milliliter Szintillationscocktail enthält.

Bereiten Sie zusätzliche Szintillationsgefäße vor, eines davon mit unbenutztem GFB-Filterpapier als Hintergrundprobe sowie ein bis zwei weitere Gefäße mit 0,1 bis 0,5 Mikrocurie radioaktiv markiertem Substrat, um die Zählraten pro Minute pro Mikrocurie zu bestimmen. Messen Sie mithilfe eines Szintillationszählers die Zählraten pro Minute für jede Probe gemäß der Herstellerprotokollvorgabe. Berechnen Sie anschließend die gesamte Kohlendioxidproduktion, wie im Protokolltext beschrieben.

Die Fliegen wurden 18 Stunden lang gefastet, erhielten zwei Stunden lang radioaktiv markierte Palmitinsäure und wurden anschließend in Gruppen von 12 oder 25 Tieren auf die Produktion von radioaktiv markiertem Kohlendioxid über Inkubationszeiten von drei oder sechs Stunden getestet. Wie in diesem Diagramm dargestellt, war die Menge des von 25 Fliegen produzierten Kohlendioxids nahezu doppelt so hoch wie die von 12 Fliegen, und die Menge jeder Gruppe verdoppelte sich, wenn die Inkubationszeit von drei auf sechs Stunden erhöht wurde. Die picomolare Menge an radioaktiv markiertem Kohlendioxid pro Fliege und Stunde war in jeder Gruppe nahezu gleich.

Da das Fasten den Abbau von Fettsäuren durch β-Oxidation stimuliert, sollte die Produktion von Kohlendioxid aus der Oxidation von Fettsäuren bei gefasteten Tieren im Vergleich zu gefütterten Tieren erhöht sein. Um dies zu überprüfen, wurden 18 Stunden gefastete Fliegen zwei Stunden lang mit radioaktiv markierter Palmitinsäure gefüttert, in zwei Gruppen aufgeteilt und anschließend entweder auf nicht markiertes Fliegenfutter oder auf 1 % Agar überführt. In zwei separaten Experimenten produzierten die auf Agar gehaltenen Fliegen signifikant mehr radioaktiv markiertes Kohlendioxid als die auf Nahrung gehaltenen Fliegen, was darauf hindeutet, dass die β-Oxidation in den gefasteten Tieren erhöht war.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können ergänzende Methoden wie die Messung der gesamten Kohlendioxidproduktion und des gesamten Sauerstoffverbrauchs sowie die Berechnung des respiratorischen Austauschverhältnisses durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise welche bevorzugte Energiequelle genutzt wird. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie dieses Protokoll verwendet wird, um den Einfluss einer bestimmten Mutation oder experimentellen Manipulation auf die Fähigkeit zur Nutzung eines spezifischen Brennstoffs als Energiequelle zu bestimmen. Vergessen Sie nicht, dass der Umgang mit Radioaktivität gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, Laborkitteln und Schutzbrille sowie die Verwendung geeigneter Abschirmungen stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.