Die Messung der Kohlendioxidproduktion von Radiolabeled Substrate in Drosophila melanogaster

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Kohlendioxid zu messen, das von intakten Fruchtfliegen produziert wird, die radioaktiv markierte Substrate wie Palmitinsäure oder Glukose setzen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen für Drosophila-Forscher zu beantworten, z. B. ob eine bestimmte Mutation den Energiestoffwechsel beeinflussen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie quantitative, empfindliche und reproduzierbare Messungen der Kraftstoffoxidation in einer kleinen Anzahl von Fruchtfliegen ermöglicht.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Montageschritte der Fliegenkapsel eine schnelle Manipulation von Kleinteilen erfordern, um eine ordnungsgemäße Konstruktion der Versuchsapparatur zu gewährleisten, bevor sich die Fliegen von der Narkose erholen. Kohlenstoff-14 ist ein niederenergetischer Beta-Emitter und hat eine geringe Reichweite in der Luft, aber es muss dennoch darauf geachtet werden, dass radioaktiv markierte Moleküle nicht verschüttet werden oder dass der Experimentator sie versehentlich verschluckt. Mischen Sie ein bis zwei radioaktiv markierte Mikrocurie-Substrate mit 15 Mikrolitern FD&C Number One blauem Lebensmittelfarbstoff und Wasser, um ein Gesamtvolumen von 25 Mikrolitern zu erhalten.

Pfeifenkopf: Das gesamte radioaktiv markierte Substrat und den blauen Farbstoff in den Boden eines leeren Fläschchens mit Fliegenfutter mischen. Da Fläschchen mit Fliegenfutter leicht umkippen, sollten Sie sie in einem Behälter aufbewahren, der ein Umkippen verhindert. Standard-Fliegenfutter in der Mikrowelle erhitzen, bis sich das Futter gerade verflüssigt hat.

15 bis 20 Sekunden bei hoher Leistung sind in der Regel ausreichend für ein Fläschchen mit 10 Millilitern Lebensmitteln. Geben Sie 975 Mikroliter des geschmolzenen Lebensmittels zu dem radioaktiv markierten Substrat und der blauen Farbstoffmischung und schwenken Sie sie schnell, während Sie die Gleichmäßigkeit der blauen Farbe überwachen, um eine vollständige Mischung zu gewährleisten. Die Pfeifenkopfspitzen müssen möglicherweise mit der Schere abgeschnitten werden, um das schmale Ende zu verbreitern und so eine genaue Pfeifenführung der geschmolzenen Eingeweide zu ermöglichen.

Lassen Sie die Lebensmittel 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen und vollständig fest werden. Zur Betäubung erwachsener Fliegen wird ein Kohlendioxid-Betäubungsapparat verwendet, der aus porösem Polyethylen besteht, das mit einer Acrylbasis verschmolzen und mit einem Kohlendioxidtank mit einem Druckregler verbunden ist. Fließen Sie Kohlendioxid mit fünf Litern pro Minute in das Betäubungsgerät.

Übertragen Sie die betäubten Fliegen in Fläschchen mit radioaktiv markiertem, blau gefärbtem Futter. Verschließen Sie jedes Fläschchen mit einem Schaumstoffstopfen und stellen Sie es waagerecht auf, bis die Fliegen aufwachen. Übertragen Sie die Fläschchen in einen Acrylbehälter mit Deckel.

Für die kurzfristige Fütterung werden die Hungerfliegen 18 bis 24 Stunden lang gefüttert, bevor sie auf radioaktiv markiertes Futter übertragen werden, um sicherzustellen, dass sie während des zwei- bis dreistündigen Fütterungsschritts fressen. Für eine langfristige Fütterung über einen Zeitraum von fünf bis sieben Tagen müssen die Fliegen nicht ausgehungert werden, aber der Versuchsleiter sollte den Wassergehalt des radioaktiv markierten Futters in den Fläschchen überwachen und mit einer Nadel und einer Spritze Wasser in die Fläschchen mit Trockenfutter geben. Wenn die Zeit der Fütterung mit radioaktiv markiertem Substrat vorbei ist, übertragen Sie die Fliegen auf unmarkiertes Futter, indem Sie sie in ein neues Fläschchen klopfen.

Eine anfängliche Verfolgungsphase von zwei bis vier Stunden ermöglicht es den Fliegen, radioaktiv markierte Nahrungspartikel von ihrer Nagelhaut zu reinigen, und ermöglicht die Verdauung von radioaktiv markierter Nahrung, die im Darm verbleibt. Überwachen Sie den Fortschritt der Nahrung durch den Darm, indem Sie die Fliegen visuell untersuchen, um nach blauen Abdomen zu suchen. Setzen Sie die Fliegen anschließend auf verschiedene Lebensmittelsorten oder Umgebungstemperaturen um.

Die Länge dieser Verfolgungsphase variiert mit dem durchgeführten Experiment. Bevor Sie die Kohlendioxid-Sammelapparatur herstellen, stellen Sie Materialien zusammen, um Fliegenkapseln zu konstruieren, bei denen es sich um Netzröhren handelt, die Fliegen enthalten, die mit C-14-Glukose oder C-14-Palmitinsäure markiert sind und für die Atmosphäre offen bleiben. Klemmen Sie eine Rasierklinge mit einem Hämostaten ein, erhitzen Sie sie in der Flamme eines Bunsenbrenners glühend heiß und schneiden Sie mit der erhitzten Klinge die oberen 50 Millimeter von 12 Millimeter x 75 Millimeter großen Polypropylenrohren ab, so dass 25 Millimeter lange Rohre mit rundem Boden übrig bleiben.

Bereiten Sie 35 Millimeter x 35 Millimeter große Quadrate aus 130 Mikron Nylonnetz vor. Schneiden Sie mehrere eineinhalb bis zwei Zoll lange Stücke transparentes Klebeband ab. Montieren Sie als Nächstes Materialien für die Kohlendioxid-Sammelvorrichtung.

Baue für jede Fliegenkapsel ein 20-Milliliter-Szintillationsfläschchen aus Glas, einen Stopfen mit Gummideckel und einem außermittigen Loch, eine Vertiefung in der Mitte und GFB-Mikrofaser-Filterpapier aus GFB-Glas zusammen. Führen Sie die mittlere Vertiefung durch das Loch im oberen Stopfen ein. Bereiten Sie 5%Kaliumhydroxid frisch am Tag der Anwendung vor.

Kurz bevor Sie die Fliegen für den Transfer in die Fliegenkapsel betäuben, falten Sie das kreisförmige GFB-Filterpapier und legen Sie es in die mittlere Vertiefung, die durch das Loch des oberen Gummistopfens gefädelt wird, und tränken Sie es mit 100 Mikrolitern 5% Kaliumhydroxid. Der Transfer von anästhesierten Fliegen in die Fliegenkapseln ist der schwierigste Schritt dieses Protokolls. Um den Erfolg zu gewährleisten, sollten Sie alle benötigten Materialien griffbereit haben und schnell arbeiten, um die Exposition der Fliegen gegenüber Kohlendioxid zu begrenzen und zu verhindern, dass Fliegen aufwachen und entkommen, bevor das Netz sicher auf dem Rohr befestigt wurde.

Nach den Inkubationen auf unmarkierten Medien werden die Fliegen mit Kohlendioxid betäubt. Bürsten Sie die betäubten Fliegen in den abgeschnittenen Polypropylenschlauch, verschließen Sie ihn mit dem Nylonnetz und kleben Sie das Netz mit transparentem Klebeband auf den Schlauch. In jeder Fliegenkapsel sollte die gleiche Anzahl von Fliegen für ein bestimmtes Experiment verwendet werden.

10 bis 20 Fliegen pro Fliegenkapsel produzieren ausreichend radioaktiv markiertes Kohlendioxid für die Messung durch Szintillationszählung. Übertragen Sie die Fliegenkapsel in das 20-Milliliter-Glasszintillationsfläschchen. Verschließen Sie das Glasfläschchen mit dem Stopfen mit Gummideckel und halten Sie eine Vertiefung in der Mitte, die mit Kaliumhydroxid gesättigtes GFB-Filterpapier enthält.

Falten Sie die breite Oberseite des Gummistopfens über die Lippe des Glasszintillationsfläschchens. Stellen Sie die Glasfläschchen mit den Fliegen in einen Acrylbehälter mit Deckel und inkubieren Sie sie für unterschiedliche Zeiträume. Öffnen Sie am Ende der Inkubation den Deckel des Glasfläschchens und geben Sie das mit Kaliumhydroxid gesättigte GFB-Filterpapier in ein Szintillationsfläschchen aus Kunststoff mit 4 Millilitern Szintillationscocktail.

Bereiten Sie zusätzliche Szintillationsfläschchen vor, eines mit unbenutztem GFB-Filterpapier als Hintergrund und ein bis zwei weitere Fläschchen mit 0,1 bis 0,5 Mikrocurie radioaktiv markiertem Substrat, um die Zählung pro Minute und Mikrocurie zu bestimmen. Messen Sie mit einem Szintillationszähler die Anzahl pro Minute für jede Probe gemäß dem Protokoll des Herstellers. Berechnen Sie anschließend die gesamte Kohlendioxidproduktion, wie im Protokolltext beschrieben.

Die Fliegen wurden 18 Stunden lang gefastet, zwei Stunden lang mit radioaktiv markierter Palmitinsäure gefüttert und dann in Gruppen von 12 oder 25 Tieren für drei oder sechs Stunden Inkubation auf radioaktiv markierte Kohlendioxidproduktion getestet. Wie in dieser Grafik gezeigt, war die Menge an Kohlendioxid, die von 25 Fliegen produziert wurde, fast doppelt so hoch wie die von 12 Fliegen, und die Menge jeder Gruppe verdoppelte sich, wenn die Inkubationszeit von drei auf sechs Stunden erhöht wurde. Das picomolare, radioaktiv markierte Kohlendioxid pro Fliege und Stunde war in jeder Gruppe nahezu gleich.

Da das Fasten den Abbau von Fettsäuren durch Beta-Oxidation stimuliert, sollte die Kohlendioxidproduktion aus der Fettsäureoxidation bei nüchternen Tieren im Vergleich zu gefütterten Tieren erhöht sein. Um dies zu testen, wurden 18-Stunden-Fastenfliegen zwei Stunden lang mit radioaktiv markierter Palmitinsäure gefüttert, in zwei Gruppen aufgeteilt und auf unmarkiertes Fliegenfutter oder 1%Agar übertragen. In zwei getrennten Experimenten produzierten Fliegen, die auf Agar gejagt wurden, signifikant mehr radioaktiv markiertes Kohlendioxid als Fliegen, die auf Nahrung gejagt wurden, was darauf hindeutet, dass die Beta-Oxidation bei den nüchternen Tieren erhöht war.

Im Anschluss an dieses Verfahren können ergänzende Methoden wie die Messung der gesamten Kohlendioxidproduktion und des gesamten Sauerstoffverbrauchs sowie die Berechnung des Atemaustauschverhältnisses durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. was die bevorzugte Brennstoffquelle ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie dieses Protokoll verwenden können, um die Auswirkungen einer bestimmten Mutation oder experimentellen Manipulation auf die Fähigkeit zu bestimmen, einen bestimmten Brennstoff als Energiequelle zu verwenden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioaktivität gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, Laborkitteln und Schutzbrillen sowie die Verwendung einer angemessenen Abschirmung sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.