Mut, Aggression, und Shoaling Assays für Zebrabärblinge Behavioral Syndromes

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Methodik zur Beobachtung, Analyse und Interpretation von Kühnheit, Aggression und Schwarmverhaltenssyndromen bei Zebrafischen zu standardisieren. Direkt kann diese Methode Fragen der Evolutionstheorie, der Populationsstruktur und der Populationsdynamik beantworten. In Kombination mit interdisziplinären Techniken kann es auf Bereiche wie Pharmakologie, Toxikologie, Verhaltensgenetik und Endokrinologie angewendet werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Kombination aus Kühnheit, Aggression und Schwarmbildung viele gut untersuchte, leicht quantifizierbare Verhaltensweisen beim Zebrafisch umfasst. Und jeder Assay kann modifiziert werden, um alternative experimentelle Fragen zu beantworten. Beginnen Sie damit, den Zebrafisch nach dem Zufallsprinzip in das richtige Verhältnis von fokalen Fischen zu Reizfischen zu unterteilen.

Lagern Sie alle Fische in Zebrafish-Haltungsgestellen unter einem strengen Hell-Dunkel-Zyklus von 12 bis 12 Stunden. Füttern Sie täglich alle Fokal- und Reizfische mit Flockenfutter. Und füttern Sie Salinengarnelen nur einmal pro Woche an forschungsfreien Tagen.

Richten Sie anschließend drei Analysetanks im Labor ein. Einer für Aggression, Kühnheit und Schwarmbildung an Stellen, die die Möglichkeit für nachteilige äußere Reize minimieren. Und lassen Sie genügend Platz für eine Videokamera, um den gesamten Tank zu erfassen.

Richten Sie die Videokamera so ein, dass sie genügend Klarheit hat, um die Aquarienbeschriftungen zu sehen und subtile Verhaltensweisen der Fokusfische zu unterscheiden. Halten Sie die Kamera während aller Aufzeichnungen von Verhaltensassays in der gleichen Position mit voller Sicht auf den Tank, um unbeabsichtigte Unterschiede in der Verhaltensbewertung als Ergebnis unterschiedlicher Aufzeichnungen zu minimieren. Definieren Sie als Nächstes ein Kennzeichnungsschema, um das Datum, die Fischanzahl und die Assay-Nummer für alle Verhaltensassays zu verfolgen.

Beschriften Sie die Außenseite des Tanks mit Klebeband in Sichtweite der Kamera. Notieren Sie diese Informationen in einem Labornotizbuch, um schnell darauf zurückgreifen zu können und die Qualität in Zukunft zu kontrollieren. Richten Sie abschließend einen Akklimatisierungstank ein, der zwischen allen Assays sowie direkt nach der Entnahme der Personen aus dem Gehäusegestell verwendet wird.

Beginnen Sie mit einem rechteckigen 19-Liter-Tank mit den Maßen 30 x 15 x 10 Zentimeter. Statten Sie den Panzer mit einer außenliegenden, undurchsichtigen Trennwand aus, die drei Seiten des Aggressionspanzers umgibt, und lassen Sie die Vorderseite frei, um unerwünschte Reize von außen zu reduzieren. Teilen Sie den Tank mit äußeren Markierungen in vier gleich große rechteckige Quadranten ein.

Verwende Silikondichtungsmasse, um einen Spiegel im linken unteren Quadranten zu befestigen, der um 22,5 Grad geneigt ist und ein rechtwinkliges Dreieck gegen die linke Seite des Tanks bildet. Halten Sie frisches, gealtertes, auf 27,5 bis 28,5 Grad Celsius vorgewärmtes Wasser bereit, um es in den Aggressionstank zu geben, um sicherzustellen, dass die Temperatur des Wassers im Akklimatisierungstank und im Aggressionstank innerhalb von zwei Grad Celsius über dem Gehäusegestell liegt. Nehmen Sie einen Fokalfisch aus dem Stallgestell und setzen Sie ihn in ein separates Akklimatisierungsbecken, wo er sich 10 Minuten lang akklimatisiert.

Vergewissern Sie sich, dass die Videokamera auf den Aggressionstest-Tank fokussiert ist, und drücken Sie die Aufnahmetaste. Setzen Sie dann den Fokalfisch sofort durch Schröpfen aus dem Akklimatisierungsbecken in das Aggressionsbecken um. Nimm den Aggressionspanzer 10 Minuten und 30 Sekunden lang auf.

Setze dann den Fokusfisch aus dem Aggressionsbecken zurück in das Akklimatisierungsbecken. Wenn Sie sich die Aufzeichnung nach Abschluss des Assays ansehen, warten Sie 30 Sekunden, nachdem der Fisch als zusätzliche Eingewöhnungsphase in das Aquarium eingeführt wurde, bevor Sie das Verhalten bewerten. Bewerten Sie schließlich einen einzelnen Aggressionsassay mindestens zweimal, bis der Assay mit hoher Übereinstimmung zwischen den Iterationen bewertet wird.

Um den Fettigkeitstest einzurichten, besorgen Sie sich zunächst einen kleinen 1,5-Liter-Trapeztank mit einer Höhe von 15 Zentimetern und einer Ober- von 26,5 Zentimetern oben und 22,5 Zentimetern unten und einer Breite von 6 Zentimetern. Wickeln Sie undurchsichtiges Papier um drei Seiten des Tanks und lassen Sie die Vorderseite frei. Lege ein einzelnes dünnes Stück Klebeband außerhalb des Tanks an, um den oberen vom unteren Teil des Tanks abzugrenzen.

Stellen Sie als Nächstes sicher, dass die Temperatur des Wassers im Boldness-Tank innerhalb von zwei Grad Celsius über dem Gehäusegestell liegt. Setzen Sie den Fokalfisch aus dem Stallgestell in das Akklimatisierungsbecken und lassen Sie ihn 10 Minuten akklimatisieren. Stellen Sie sicher, dass die Videokamera auf den Fettdrucktest fokussiert ist, und drücken Sie die Aufnahmetaste auf dem Gerät.

Übertragen Sie den fokussierten Fisch sofort aus dem Akklimatisierungsbecken in das Kühnheitsbecken und nehmen Sie acht Minuten und 30 Sekunden lang auf. Wenn Sie sich die Aufzeichnung nach Abschluss des Assays ansehen, planen Sie eine zusätzliche Eingewöhnungsphase von 30 Sekunden ein, nachdem der Fisch in das Aquarium eingeführt wurde, bevor Sie bewerten. Bewerten Sie abschließend einen einzelnen Boldness-Assay mindestens zweimal, bis der Assay mit hoher Übereinstimmung zwischen den Iterationen bewertet wird.

Um den Schwarm-Assay einzurichten, besorgen Sie sich einen 76-Liter-Tank mit drei Kammern, die durch zwei mit Silikondichtung versiegelte Glastrennwände unterteilt sind. Markieren Sie mit Klebeband zwei Präferenzzonen, die sechs Komma drei fünf Zentimeter von jeder der Glastrennwände entfernt sind, die jede Reizzone kennzeichnen. Bringen Sie externe undurchsichtige Trennwände um drei Seiten des Untiefenbeckens an und lassen Sie die Vorderseite zur Betrachtung frei.

Wählen Sie als Nächstes Stimulus-Schwärme aus, die sich vor dem Test mindestens 12 Stunden lang akklimatisieren, und lassen Sie sie während des gesamten Experimentverlaufs im Schwarmbecken verbleiben. Setzen Sie den Fokalfisch aus dem Haltungsgestell durch Schröpfen in ein separates Akklimatisierungsbecken um, wo er sich 10 Minuten lang akklimatisiert. Setzen Sie dann den Fokalfisch durch Schröpfen aus dem Akklimatisierungsbecken in das mittlere Fach des Schwarmbeckens um.

Berücksichtigen Sie eine 10-minütige Akklimatisierungsphase vor einer 10-minütigen Beobachtungsperiode mit Lebendbewertung, in der die Schwarmfische so definiert werden, dass sie sich innerhalb der Präferenzzone in der Kammer befinden, in der sich der Zielschwarm befindet. Quantifizieren Sie als Nächstes die in jeder Präferenzzone verbrachte Zeit sowie die Zeit, die Sie in der zentralen Lautstärke verbracht haben. Nachdem die Assays abgeschlossen sind, werden die Fische in ein separates Endbecken umgesiedelt, das als endgültiges Bestimmungsbecken für alle verwendeten Fokalindividuen dient.

Dieses Protokoll untersuchte konsistente Assoziationen in Aggression, Kühnheit und Schwarmverhalten von Zebrafischen, um festzustellen, ob ein Verhaltenssyndrom vorliegt. Hier steht Komponente eins für Aggressionsverhalten, während Komponente zwei mit Kühnheitsverhalten verbunden ist. Da Aggressions- und Kühnheitsverhalten nicht durch dieselbe Komponente repräsentiert werden, kann daraus geschlossen werden, dass es beim Zebrafisch kein Aggressionsverhaltenssyndrom gibt.

Einmal gemeistert, kann das gesamte Protokoll eines Fokusfisches in 70 Minuten durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich und Ihr Team mit jedem Zielverhalten vertraut zu machen, um die Verzerrung des Beobachters zu minimieren. Wenn Sie dieselbe Videoaufnahme mehrmals bewerten, erhöht dies auch das Vertrauen in Ihre Ergebnisse.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden im pharmakologischen, genetischen oder physiologischen Bereich durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, welche internen und externen Faktoren Verhaltenssyndrome beeinflussen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kühnheit, Aggression und Schwarmverhaltenssyndrome bei Zebrafischen beobachtet, analysiert und interpretiert. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten!