Kutane Surgical Denervation: eine Methode zur Prüfung der Voraussetzung für die Nerven in Maus-Modellen der Haut-Krankheit

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Einfluss der Nerven auf normale und krankhafte Haut zu untersuchen. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen der normalen Hautbiologie zu beantworten, z. B. ob Hautnerven die Homöostase und die Krankheit beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie intakte und denervierte Hautproben desselben Tieres vergleichen können.

visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da Nerven schwer zu erkennen und zu entfernen sein können, da das umgebende Gewebe nur minimal geschädigt wird. Betäuben Sie zuerst die Maus und überprüfen Sie, ob sie die richtige Sedierungsebene erreicht hat, indem Sie die Zehenkneifung verwenden. Vergewissern Sie sich außerdem, dass die Maus eine normale Atmung und einen normalen Herzschlag aufweist.

Legen Sie das Tier nun auf ein Wärmekissen in einem aseptischen Operationsbereich. Entferne mit einer elektrischen Haarschneidemaschine vorsichtig die Haare von der dorsalen Seite, wo die Biopsie entnommen wird. Wischen Sie dann die rasierte Stelle mit Betadyne und Alkoholtüchern ab.

Stellen Sie sicher, dass alle Haarschnitte von der Stelle entfernt werden. Umreißen Sie nun die Biopsiestelle mit einem schwarzen Marker. Um Längsschnitte von Haarfollikeln zu erhalten, sollte der längere Rand der Biopsie in anteriorer bis hinterer Richtung parasetidal zur dorsalen Mittellinie verlaufen.

Führen Sie mit einem Skalpell eine Exzision in voller Dicke durch, ohne die darunter liegende Muskelfaszie zu beschädigen. Die Blutung ist in der Regel minimal. Die Biopsieprobe sollte die Epidermis, die Dermis, das Unterhautfett und den Panniculus carnosus umfassen.

Glätten Sie die herausgeschnittene Hautprobe auf einem trockenen Papiertuch mit der Dermisseite nach unten. Schneiden Sie das überschüssige Papiertuch ab und lagern Sie die Probe bis zu einer Stunde lang auf kaltem TBS, wenn andere Proben entnommen werden müssen. Zurück zur Maus: Vernähen Sie die Biopsiestelle mit 60 Nylonnähten, die etwa drei Millimeter voneinander entfernt sind.

Überwachen Sie dann die Maus in einem Bergungskäfig, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt. Verwenden Sie Analgetika in Übereinstimmung mit der ausgewiesenen institutionellen Tierpflege und befolgen Sie deren Richtlinien, wenn die Maus verzweifelt erscheint. Entfernen Sie innerhalb von sieben bis 10 Tagen nach der Operation die Nähte.

Fahren Sie mit der Verarbeitung der Biopsien für die Histologie oder die Whole-Mount-Färbung fort. Betäuben Sie das Tier, rasieren Sie die gesamte Rückenhaut und reinigen Sie den Bereich ähnlich wie bei der Biopsie. Machen Sie nun mit einem sterilen Skalpell einen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie von der Basis des Halses bis etwa einen halben Zentimeter über dem Schwanz.

Ziehen Sie die Haut auf der linken Seite mit einer sterilen stumpfen Pinzette vorsichtig von der Flanke weg, um das darunter liegende Gewebe von den Schulterblatt-Fettpolstern in der Nähe des Halses bis knapp über die hintere Extremität sichtbar zu machen. Bestimmen Sie nun den Nervus cutaneus dorsus unter einem Präparierlichtmikroskop. Diese erscheinen als weiße Stränge, die kaudal durch die durchscheinende Faszie der Rumpfwand wandern, bevor sie scharfe Kurven machen und in das lose Bindegewebe unter der Haut eindringen.

Anschließend wird mit einer ultrafeinen Pinzette der Nerv ausschließlich von der linken Seite des Tieres entfernt, die sich an den anatomischen Stellen T3 bis T12 befindet, indem man sie von der Stelle, an der sich ihre Segmente an der Rumpfwand biegen, zu ihren Eintrittsstellen in die Haut zupft. Richten Sie die Pinzette senkrecht aus und fassen Sie die Nerven etwa einen halben Zentimeter unterhalb ihrer Biegestellen. Sobald Sie gegriffen haben, ziehen Sie nach oben, damit sich die Nerven dehnen, und trennen Sie sich vom umgebenden Gewebe, um sie zu entfernen.

Vermeiden Sie es, die angrenzenden Blutgefäße zu beschädigen. Achten Sie darauf, das Gewebe während des gesamten Eingriffs feucht zu halten, indem Sie regelmäßig Tropfen mit 0,9%iger stiller Kochsalzlösung auftragen. Entfernen Sie weiterhin alle Nerven, die sich von der Rumpfwand bis zur Haut erstrecken, aber stören Sie nicht die Nerven in der dichten Faszie der Rumpfwand.

Entfernen Sie anschließend alle Nerven aus dem freiliegenden Hautlappen. Diese Fasern bilden die distalen Äste des dorsalen Hautnervs und erscheinen als weiße, verzweigte Stränge, die sporadisch im Bindegewebe auf der dermalen Seite des Hautlappens angeordnet sind. Um diese feinen Äste zu entfernen, positionieren Sie die Pinzette etwa parallel zur Hautoberfläche, fassen Sie den Nerv und zupfen Sie sie nach oben.

Entferne auf diese Weise alle sichtbaren Nerven. Durchstechen Sie nicht die Blutgefäße und die Haut. Bei diesem Schritt ist es wichtig, benachbarte Blutgefäße nicht zu reißen.

Wenn Sie einen Nerv mit einem angrenzenden Blutgefäß finden, folgen Sie ihm schließlich bis zu einem Bereich, in dem es kein benachbartes Gefäß gibt, und entfernen Sie es durch Zupfen. Lockern Sie nun die Haut auf der rechten Seite des dorsalen Mittellinienschnittes, entfernen Sie jedoch keine Nerven. Dies dient als kontralaterale Schein-Operationskontrolle.

Zum Schluss das Tier vernähen und postoperativ wie bisher überwachen. Später, Wochen nach der Operation, um den stabilen Nervenverlust zu bestätigen, stechen Sie vorsichtig mit einer sterilen Injektionsnadel in den denervierten Bereich. Achten Sie darauf, ob das Tier reagiert, typischerweise indem es zittert oder den Kopf dreht.

Wenn die Hautstelle stabil ennerviert wurde, zeigt das Tier keine oder nur eine geringe Reaktion. Entnahme von Hautbiopsien aus dem Bereich ohne Reaktion und der kontralateralen Scheinseite für übereinstimmende Versuchs- und Kontrollproben. Aus den Biopsien ist es wichtig, mehrere histologische Schnitte zu entnehmen, um mögliche Unterschiede in der Häufigkeit oder Morphologie der Berührungskuppel zwischen den scheinfarbenen und denervierten Proben zu identifizieren.

Der glebe one cree ERT2-Mausstamm ermöglicht das Targeting von Tamoxifen-induzierter genetischer Rekombination auf Hautbereiche, die eine hohe Aktivität des Igel-Signalwegs aufweisen, wie z. B. Touch-Dome-Epithelien. Diese Mäuse wurden gekreuzt, um Abolaxi-Reportermäuse dazu zu bringen, die Touch-Dome-Epithelien sichtbar zu machen. Knoten sind entscheidend für die Aufrechterhaltung sowohl normaler Touch-Domes als auch der zugehörigen Merkel-Zellen.

Dies wird experimentell durch den allmählichen Verlust der normalen Morphologie der Tastkuppel sowie durch den Verlust von Keratin-Acht-abgelagerten Zellen nach Denervierung gezeigt. Nerven sind auch entscheidend für die Förderung der Igel-Signalgebung in der Tastkuppel, wie sie durch Glebe one cree ERE2-Expressionen und die kollektivseitige Färbung von Beta-Müttern sowohl von scheiniger als auch von denervierter Haut überwacht wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dorsale Hautnerven operativ abliert, um zu testen, ob diese Nerven an der normalen Hautfunktion beteiligt sind oder ob sie die Krankheit modulieren.

Einmal gemeistert, kann diese Technik routinemäßig und zuverlässig mit minimalem Stress für das Tier durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können Methoden wie die Aminofluoreszenzfärbung verwendet werden, um zu bestätigen, ob Nerven vollständig von der Haut abgetragen werden und ob die Genexpression beeinflusst wird.