Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge

Das übergeordnete Ziel dieser Mikroinjektionstechnik ist es, transgene und genomeditierte Stichlinge zu erzeugen, um die Gen- und Enhancerfunktion zu testen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Entwicklungs- und Evolutionsgenetik zu beantworten, z. B. wie Gene und Enhancer funktionieren, um Körpermuster zu erzeugen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie effizient transgene Fische für die funktionelle genetische Analyse erzeugt.

Nach der Aufbereitung von zwei Plasmiden und mRNA gemäß dem Textprotokoll werden mindestens vier Mikropipettennadeln aus Borosilikatglas gezogen. Vertikal in einem Kapillarbehälter aufbewahren, dessen scharfe Enden nach unten zeigen. Um bis zu hundert Stichlingscheier zu befruchten, fügen Sie 50 Mikroliter Samenlösung hinzu und rühren Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig um, um sicherzustellen, dass alle Eizellen befruchtet werden.

Während Sie auf Eis arbeiten, füllen Sie mindestens drei Nadeln zurück, indem Sie 0,5 Mikroliter Injektionslösung in das stumpfe Ende der Nadel pipettieren und abtropfen lassen. Schalten Sie in der Zwischenzeit das Durchlichtlicht für das Präpariermikroskop ein und platzieren Sie eine 13 Quadratzentimeter große Glasplatte auf dem Mikroskoplichtsockel mit einem 15 Zentimeter großen Gipssägeblatt auf der Glasplatte. Richten Sie die Säge senkrecht zum Injektionsgerät aus, wobei die Vertiefungen zum Nadelhalter zeigen, schalten Sie dann den Schaltkasten ein und stellen Sie sicher, dass der Druck auf ca. 175 Kilopascal eingestellt ist.

Legen Sie die Injektionsdauer auf 180 Millisekunden fest. Lösen Sie dann den Nadelhalter, führen Sie dann eine gefüllte Nadel in den Halter ein, bis der Widerstand des Gummihalters spürbar ist, und ziehen Sie den Nadelhalter fest, bis er fingerfest ist. Stellen Sie dann den Nadelwinkel auf ca. 45 Grad ein.

Verwenden Sie die Bedienelemente des Mikromanipulators, um die Nadel so einzustellen, dass das Ende im Sichtfeld zentriert ist. Vergrößern Sie die Kamera auf ca. 40-fache Vergrößerung und fokussieren Sie sich auf die Spitze der Nadel, die das Glas darunter nicht berühren sollte. Fassen Sie mit einer Uhrmacherzange die Spitze der Nadel zwei bis drei Pinzetten breit vom Ende entfernt und brechen Sie die Spitze vorsichtig in einem Winkel von 60 Grad.

Drücken Sie dann mehrmals auf das Einspritz-Fußpedal, um zu testen, ob die Nadel gebrochen ist. Nach ein paar Fingertipps sollten winzige rote Tröpfchen aus dem Ende herauskommen. Verwenden Sie eine Einweg-Transferpipette, um ein paar Tropfen Stichlingswasser auf die Glasplatte zu geben.

Senken Sie die Nadel vorsichtig in das Wasser und erhöhen Sie dann den Gegendruck, bis ein schwacher Strahl rosa Flüssigkeit aus der Nadel austritt. Ziehen Sie die Nadel so weit wie möglich zurück, damit sie bei der Vorbereitung der Embryonen nicht beschädigt wird. Etwa 25 Minuten nach der Befruchtung verwenden Sie zwei 10-Mikroliter-Pipettenspitzen, um fünf bis 10 Embryonen aus dem Gelege zu nehmen und auf die Glasplatte zu übertragen.

Trennen Sie die Embryonen mit den Pipettenspitzen vorsichtig in einzelne Vertiefungen des Sägeblatts, wobei Sie vorsichtig sind, nicht die Embryonen zu punktieren. Fügen Sie dann mit einer Transferpipette so viel Stichlingswasser hinzu, dass die Embryonen bedeckt sind. Entfernen Sie dann nach drei bis fünf Sekunden den größten Teil des Wassers, so dass nur ein kleines Volumen jeden Embryo bedeckt.

Beginnen Sie mit dem am weitesten entfernten Embryo, schieben Sie die Glasplatte und zoomen Sie so heran, dass er etwa 25 Prozent des Sichtfelds ausfüllt. Senken Sie die Nadel in das Sichtfeld und drehen Sie den Embryo dann mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze vorsichtig, um das Blastomer zu identifizieren, eine körnige, leicht gelbliche, erhabene Beule aus Zytoplasma auf der Oberseite des Eigelbs. Drehen Sie den Embryo so, dass das Blastomer direkt senkrecht zum Ende der Nadel steht.

Senken Sie die Nadel langsam und gleichmäßig ab und üben Sie Druck aus, um das Corion zu durchstechen, und führen Sie die Nadel in das Zytoplasma ein, ohne sie durch das darunter liegende Eigelb zu drücken. Drücken Sie das Fußpedal drei- bis viermal, um zu injizieren, so dass ein roter Bolus mit leicht diffusen Rändern etwa 1/8 des Durchmessers des Zytoplasmas ausfüllt. Eine scharfe Nadel senkrecht zum Corion zu haben, erleichtert diesen Schritt.

Die Begrenzung der Wasserzugabe hilft, den Corion weich zu halten. Und schließlich erhöht die Ausrichtung auf das Zytoplasma die Wahrscheinlichkeit, ein transgenes Tier zu erhalten. Verwenden Sie die Steuerung des Mikromanipulators, um die Nadel zurückzuziehen, und halten Sie den Embryo mit der 10-Mikroliter-Pipettenspitze fest, wenn er an der Nadel klebt.

Nachdem Sie die Nadel zurückgezogen haben, schieben Sie die Glasplatte, um den nächsten Embryo mit der Nadel auszurichten, und wiederholen Sie die Injektion. Wenn alle Embryonen injiziert wurden, verwenden Sie die Transferpipette mit abgeschnittenem Ende, um Wasser auf die Platte zu geben. Verwenden Sie dann eine Transferpipette, um die Embryonen zu sammeln und sie in eine 150 Millimeter große Petrischale zu legen, die mit Stichlingswasser gefüllt ist.

Inkubieren Sie die Embryonen bei 18 Grad Celsius. Einen Tag nach der Injektion das Stichlingswasser vorsichtig abgießen und durch frisches Wasser ersetzen. Auf tote oder missgebildete Embryonen prüfen und entfernen, um eine Kontamination zu vermeiden.

Wie hier dargestellt, führt die erfolgreiche Injektion bei Transgenen, die eine Enhancer-Aktivität aufweisen, zu einer spezifischen zellulären Expression des Transgens. Zum Beispiel in den Brust- und Mittelflossen und der Chord. Injizierte Fische können dann ausgekreuzt werden, um stabile Linien wie diese rückenstabile Linie zu produzieren, die die GFP-Expression im embryonalen Herzen vier Tage nach der Befruchtung antreibt.

Für einen aktiven Enhancer zeigen 40 bis 50 Prozent der Embryonen eine gewebespezifische Transgenexpression, zum Beispiel in der Median- und Brustflosse. Bis zu 100 Prozent der GFP-positiven F0-Fische, die Toll-Two-Plasmid-Transgene exprimieren, produzieren transgene Nachkommen. Der Prozentsatz der Nachkommen, die das Transgen tragen, schwankt jedoch stark von weniger als einem Prozent bis zu 72 Prozent.

Die Rettung nur GFP-positiver injizierter Embryonen erhöht im Allgemeinen die Übertragungseffizienz. Nur bis zu 10 Prozent der F0-Rückeninjektionen zeigen Fluoreszenz im erwarteten Gewebe. Außerdem ist die Transmissionsrate von Rückseiten geringer als die von Plasmidkonstrukten.

Nur bis zu 14 Prozent der geschirmten Stichlinge übertragen den Rücken. Im Gegensatz zur geringen Effizienz der Rücktransgenese weisen 70 bis 100 Prozent der Fische, denen Krallen injiziert wurden, Mosaikläsionen auf. Hier deutet ein ungeschnittenes PCR-Amplikon in jedem der injizierten Embryonen darauf hin, dass einige Zellen in jedem Embryo Läsionen am Zielort tragen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwas mehr als einer Stunde für ein Gelege von 100 Embryonen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Übung und Geduld erforderlich sind, um die Technik und das Überleben des Embryos zu verbessern. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die konfokale Mikroskopie, verwendet werden, um weitere Fragen zu detaillierten Mustern der Enhancer-Expression zu beantworten.

Außerdem können genomeditierte Fische gekreuzt werden, um Phänotypen zu untersuchen, die aus induzierten Mutationen resultieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Evolutions- und Entwicklungsgenetik, um die Genregulation und -funktion bei Stichlingen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Stichlingsembryonen für die Transgenese und Genom-Editierung injiziert.