Name: Dissection und Flach Montage des Dreistachliger Stichling Branchiogene Skeleton (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Lernen Sie die Präparation und Flachmontage des Branchial-Skeletts von Dreistachligen Stichlingen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung trophischer Merkmale für Entwicklungs- und Evolutionsbiologie.

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Diese Arbeit wurde teilweise von NIH R01 #DE021475 to CTM und einem NSF Graduate Research Fellowship an NAE finanziert. Vielen Dank an Miles Johnson für die Unterstützung bei der Bildgebung und Priscilla Erickson für die kritische Lektüre des Manuskripts.

Alle Fische Arbeit wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of California-Berkeley (Protokollnummer R330) zugelassen. Euthanasie wurde mit dem Eintauchen in 0,025% Tricaine-S mit 0,1% Natriumbicarbonat 39 gepuffert durchgeführt. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1. Vorbereitung Hinweis: Führen Sie die Schritte 1,1-1,5 in konische Röhrchen oder Szintillationsgefäße, die dicht verschließen kann und horizontal verlegt werden. durch vorsichtiges Umdrehen oder Schütteln des Rack von Rohren oder Fläschchen zu belichten alle Seiten des Fisches auf der Färbungslösung und ermöglichen Fleck eindringen das Gewebe gleichmäßig wie möglich Fische brauchen nicht ständig geschüttelt werden, sondern versuchen, so oft die Lösung zu mischen. Sie nicht einen großen Stapel von Fisch auf einem Plattformschüttler platzieren, wie das hohe Gewicht der Flüssigkeit den Shaker brechen. <ol><li> Fix entweder frisch getöteten Fisch oder Fisch gelagert in Ethanol mit 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF) über Nacht. Alternativ können Sie auch 4% ParaAldehyd in 1x PBS-Lösung anstelle von 10% NBF. Hinweis: Wenn DNA-Extraktion, befestigen einen kleinen Teil der Schwanz oder Brustflossen vor der Fixierung und lagern in Ethanol. </li><li> Entsorgen Sie Fix ordnungsgemäß in einer chemischen Haube und ersetzen mit Leitungswasser (dh ~ pH 7,0) für 2 Stunden. Vermeiden Sie die Verwendung de-ionisiertes Wasser, wie es oft sauer sein können und Knochen entkalken kann. </li><li> Entfernen Sie das Wasser und Flecken Fisch mit 0,008% Alizarin Red S in 1% KOH in Wasser für 24 Stunden. Für Fische weniger als 20 mm Standardlänge verwenden 0,004% Alizarin Red S. (Einen 100x (0,8%) Stammlösung von Alizarin Red S, die können dann verdünnt). </li><li> Entfernen Fleck (in geeigneten Abfallbehälter in der Haube setzen) und legen Fisch in Leitungswasser für ein paar Stunden. Wechseln Sie das Wasser nach Bedarf, bis Wasserspülung meist klar. </li><li> Entfernen Sie das Wasser und den Ort Fisch in 50% Glycerin, 0,25% KOH für leichte Reinigung und anschließender Trennung. Hinweis: Dieses Färbeprotokoll von zuvor beschriebenen Methoden modifiziert 40,41. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Präparation Hinweis: Siehe Abbildung 1 für eine Überprüfung der relevanten Kopfskelettmorphologie. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig1.jpg" /> Abb . 1: Stickleback Kopf Skelettmorphologie Alizarin - Rot gefärbt Dreistachliger Stichling Kopf mit Fluoreszenz unter einem Satz Rhodamin B - Filter abgebildet wird . Nützliche Morphologie ist beschriftet: Op = Kiemendeckel, Subop = subopercle, BSR = Kiemenstrahlen, Preop = preopercle, Infraorb 1-3 = Infraorbital- 1-3 (auch genannt circumorbitals oder suborbitals), Dent = dentary, Premax = Prämaxillare, Max = Maxilla Nas, = nasal, Lat. ETHM = seitliche ethmoid, PSPH = Parasphenoid, Fron = Stirnbein. Für eine detailliertere Beschreibung der Kopfskelett stickleback siehe Anker (1974) 31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version zu sehen</a>diese Figur. <ol><li> Legen Sie den Fisch flach (2A) und legen Sie scharfe # 5 Uhrmacherzange in die Seite des Auges bei einer ~ 45 ° Winkel der Membran bedeckt , das Auge zu durchstechen. </li><li> Ziehen Sie die Membran vom Auge weg, ähnlich wie ein Joghurt Deckel (2B) Peeling. </li><li> Legen Sie offene Zange hinter dem Auge, halten den Sehnerv hinter dem Auge fassen, und entfernen Sie das Auge (Abbildung 2C). Das Auge nicht durchstechen, wie es Melanin undicht wird. Wenn punktiert, kann Melanin während weg späteren Schritten gewaschen werden. </li><li> Wiederholen Sie auf der anderen Seite. </li><li> Ausgehend von der hinteren, legen Sie eine kleine Sezieren Scherenblatt unter dem Kiemendeckel Klappe, ziehen Scherenblatt vom Rücken her über Kiemendeckel, dann schneiden Weichgewebe bis in die Augenhöhle (2D). Schneiden Sie dorsal der Kiemendeckel Knochen. </li><li> Schneiden Sie das Stirnbein (dorsal der Augenhöhle) (Abbildung 2E). </li><li> Schneiden Sie die Mittellinie Parasphenoid Knochen um ter Mitte der Augenhöhlen (2F). </li><li> Wiederholen Sie Kiemendeckel Schnitt auf der gegenüberliegenden Seite. </li><li> Setzen Sie Zange unter dem Kiemendeckel und ziehen Sie langsam das Gesicht weg vom Körper, jede Weichgewebe Trimmen noch angebracht (Abbildung 2G - H). Achten Sie darauf, nicht die erste Reihe der Kiemenreusen zu stören. <ol><li> Mit einer Pinzette lösen sich die ceratohyals auf beiden Seiten von der Mittellinie basihyal während Ablösen und Entfernen des vorderen kraniofazialen Skeletts (die gesamte Kiefer einschließlich der dentary, Prämaxillare und Oberkiefer, die gesamte hyoid Skelett einschließlich der Außenhautkiemendeckel, preopercle, subopercle und Kiemenstrahlen und die zugrunde liegenden dorsalen und ventralen endochondral Elemente, und der vordere Teil des Schädels einschließlich der nasalen, seitliche ethmoid und Infraorbital- Knochen, siehe Abbildungen 1 und 2 I). </li><li> Becken- Stacheln aus dem Körper herausgeklappt werden kann und als Griff dienen zur Zange halten o greifenf, wenn vorhanden. Spines einrasten. Um die Sperre aufzuheben, ziehen Sie vorsichtig Wirbelsäule mit einer Pinzette aus Fischkörper direkt weg, dann sanft nach hinten biegen Wirbelsäule flach gegen Fisch zu drücken. </li></ol></li><li> Insert geschlossen Zange posterior und ventralen zur Kiemenskelett (knapp unter Darmrohr) und ziehen Zange nach vorn, um die verbleibenden Muskeln und Bänder necken auseinander an den Kiemenskelett (2J - K). </li><li> Mit den Spitzen der geschlossenen Zange, kratzen die Muskeln Befestigung des dorsalen Kiemen Skelett ventralen Hirnschale in einer posterior anterior (Abbildung 2 l) entfernt. </li><li> Wiederholen 2.9 und 2.10 auf der gegenüberliegenden Seite. </li><li> Fassen Sie die Basis des Darmrohr und ziehen nach vorn die Kiemen Skelett und Darmrohr (Abbildung 2 M - N) zu entfernen. </li><li> Trennen Sie die Darmröhre durch einen senkrechten Schnitt hinter dem Ende des fünften ceratobranchial machen (Abbildung 2O </strong&gt;). </li><li> Nach dem Entfernen eines dorsalen Schnitt (Schneiden von vorne nach hinten) zwischen den bilateralen Sätze von Dorsalzahn Platten (- D 3A) alle verbleibenden Knochenfragmente aus der Hirnschale auf der Rückenseite des Kiemen Skelett, legen Schere in den Kiemenkorb zu machen. Stellen Sie sicher, Schnitt zentriert Platten eine Beschädigung der Dorsalzahn zu vermeiden. </li><li> Machen Sie zwei flache seitliche Schnitte in den gummiDarmLumen am hinteren Ende des Kiemen Skelett (vordere Ende der Darmrohr) mit dem Öffnen der Kiemen Skelett (Abbildung 3E) zu unterstützen. </li><li> Legen Sie Fisch und alle Gewebestücke in ein Gefäß und stellen Sie das Kiemen Skelett in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 50% Glycerin, 0,25% KOH auf sanfte Lichtung weiter, oder 100% Glycerin, wenn keine weiteren Clearing erforderlich ist. Label Gläser und Röhren mit einer eindeutigen Kennung, so dass sie verfolgt werden. Die erforderliche Menge des Clearing ist weitgehend abhängig von der Größe der Fische, große ausgewachsene Fische (über 40 mm in Standardlänge) benötigen in der Regel zusätzliche Clearing. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Stickleback Kiemen Skelett Dissektion Alizarin Red gefärbt Dreistachliger Stichling Fisch für die Präparation bereit. Das Auge wird von umfangreichen Clearing depigmented. Blaue Pfeile zeigen die Richtung der Bewegung. (A) Seitenansicht von stickleback Kopf, ist vorne nach rechts. (B) Entfernung von Membran , die das Auge abdeckt. (C) Entfernen des Auges. (D) dorsale Schnitt über dem Kiemendeckel. (E) Frontal Knochen geschnitten. (F) Parasphenoid geschnitten. (G - I) Die Entfernung des Gesichtsschädels. (J) Entfernung von ventralen Kiemen Skelett Weichgewebe - Verbindungen. (K - L) Entfernung von dorsalen Kiemen Skelett - Verbindungen. (&lt;strong&gt; M - N) Die Entfernung des Kiemen Skelett. (O) Trennen Sie das Darmrohr aus dem Kiemen Skelett. Siehe Schritte 2.1 bis 2.16 für weitere Details. Maßstabsbalken = 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 3. Branchiogene Skeleton Re-Färbung (falls erforderlich) <ol><li> Um die Kiemen Skelett dunkler oder klar Gewebe mehr Fleck, entfernen Sie 50% Glycerin, 0,25% KOH-Lösung und Waschen mit 1% KOH zweimal (eine 5 Minuten waschen, gefolgt von einer zweiten 24-Stunden-Wasch während sie horizontal auf einer Plattform Schüttler Schütteln). </li><li> Entfernen 1% KOH und re-Fleck mit 0,008% Alizarin Red S in 1% KOH für 24 Stunden. </li><li> Entfernen Fleck und ersetzen mit 1% KOH für 24 Stunden. </li><li> Entfernen KOH-Lösung und ersetzen mit 50% Glycerin, 0,25% KOH. </li></ol> 4. Montage Branchiogene Skeleton <ol><li> Entfernen Kiemenskelettvon 50% Glycerin, 0,25% KOH oder 100% Glycerin und Ort in der Nähe der Unterseite eines 22 mm x 60 mm Deckglas mit der Rückenseite nach oben (Abbildung 3F). Fügen Sie ein paar Tropfen 50% Glycerin, 0,25% KOH oder 100% Glycerin oben auf Kiemen Skelett. Wenn Übergang von 50% Glycerin, 0,25% KOH auf 100% Glycerin, ändern Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen und schütteln&gt; 5 min vor der Montage Gewebe äquilibrieren. </li><li> Ausrollen zwei kleine Kugeln aus Modelliermasse und auf beiden Enden des Deckglases als Abstandshalter wirken. </li><li> Platz locker ein zweites Deckglas auf der Oberseite mit genügend Druck , um den vorderen Kiemen Skelett (Abbildung 3G) zu glätten. </li><li> Peel Öffnen Sie die linke Dorsallappen einschließlich Dorsalzahn Platten, glätten und Gleiten zwischen den Deckgläsern (3H). </li><li> Wiederholen Technik mit rechten dorsalen Klappe und schieben gesamten Kiemen Skelett weg vom Rand des Deckglases (Abbildung 3I). <ol><li> Ändernnativ, halten Sie beide Klappen dorsalen offen mit einer Pinzette vorsichtig das Deckglas legen auf, die Kiemen Skelett in einer geschmeidigen Bewegung Abflachung. </li><li> Alternativ montieren Sie die Kiemen Skelett Kopf nach unten auf ein Deckglas, jede Rückenseite Spreizen aus seitlich so die Schwerkraft ist nicht der Kiemen Skelett wieder nach oben zu schließen. Dann decken Sie mit dem zweiten 22 mm x 60 mm Deckglas und prep invertieren. Hinweis: Unterschiedliche Montagetechniken besser zu arbeiten neigen oder schlechter für jeden Einzelnen. Versuchen Sie, jeden und sehen, was am angenehmsten ist. </li></ol></li><li> Drücken Sie leicht auf Deck Lehmkugeln genug zu halten, die Kiemen Skelett montiert flach, aber darauf achten, nicht zu glätten um die Probe zu zerkleinern. <ol><li> Während des Montageprozesses kann ceratobranchials drehen und eine Reihe von rakers verschleiern. Abhilfe dies durch die Zange zwischen den Deck Gleiten und zum erneuten Ausrichten der ceratobranchials oder ganze Kiemen Skelett. </li></ol></li><li> Shop PREPS flach in Diamagazinen bei room Temperatur. Montiert in 100% Glycerin, kann preps zwischen überbrückten Deck für mindestens zehn Jahre gelagert werden. Saubere Pinzette und Schere mit Isopropanol oder Ethanol und Abdeckung Spitzen. </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Flache Montage des Kiemen Skelett Manipulation und Montage des Kiemen Skelett dargestellt. Blaue Pfeile zeigen die Richtung der Bewegung. (A) Branchiogene Skelett Rückenseite nach oben. (B - D) Rotation und Einschnitt zwischen den Dorsalzahn Platten. (E) Lateral Schnitt in weichem Gewebe weiter zu öffnen Sie die Basis des Darmrohr. (F) Branchiogene Skelett am unteren Rand des Deckglases gelegt bereit für die Montage. (G) der zweiten Deckglas auf der vorderen Hälfte des Kiemen Skelett gelegt (über Dorsalzahn Platten). (H - I)Flache Montage des Kiemengerüst durch Öffnen Dorsalzahn Plattenklappen und Gleiten zwischen zwei Deckgläsern. Siehe Schritte 4.1 bis 4.6 für weitere Details. Maßstabsbalken = 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das Kiemenskelett ist ein komplexer Satz von Knochen im Rachen eines Fisches, der auf seinem Weg zur Speiseröhre Lebensmittel manipuliert, filtert und kaut. Viele interessante trophische Merkmale, einschließlich der Musterung von Kiemenrechen, Rachenzähnen und Kiemenknochen, variieren zwischen und innerhalb der Arten. Die meisten dieser Merkmale sind mit dem Kiemenskelett in situ schwer bis nahezu unmöglich genau zu messen (z. B. Kiemenrechenlänge, Kiemenknochenlänge). Dieses Flat-Mounting-Protokoll pla...

Eine unglaubliche Menge an Vielfalt existiert im Kopf Skelett unter den Wirbeltieren, vor allem unter den Fischen. In vielen Fällen erleichtert diese Vielfalt verschiedene Fütterungsstrategien 1. - 4. und größere Änderungen an externen und internen craniofacial Strukturierung beinhalten können. Die Kiemen Skelett wird intern in der Kehle eines Fisches angeordnet und umgibt den größten Teil der Mundhöhle. Die Kiemen Skelett besteht aus 5 seriell homologe Segmente, die vordere, von denen vier die Kiemen unterstützen. Zusammen wirken diese fünf Segmente als Schnittstelle zwischen Fisch und ihre Nahrung 5. Variation in einer Vielzahl von Merkmalen, einschließlich Kiemenreusen, Schlundzähne und Kiemen Knochen tragen zur effizienten Nahrungssuche auf verschiedenen Arten von Lebensmitteln. Stichlinge haben eine adaptive Radiation nach Vorfahren ozeanischen Formen kolonisiert Süßwasserseen und Bäche in der gesamten nördlichen Hemisphäre erlebt. Die Verschiebung in der Ernährungvon kleinen Zooplankton im Ozean in Süßwasser auf größere Beute hat 6 in dramatischen trophic Variation in mehreren craniofacial Züge geführt. Während viele Studien über externe craniofacial Unterschiede in Stichlinge konzentriert haben 7-13, entwickeln wichtige craniofacial Änderungen wiederholt im internen Kiemen Skelett. Die Fähigkeit, zu schaffen fruchtbaren Hybriden zwischen morphologisch unterschiedlichen stickleback Populationen bietet eine hervorragende Gelegenheit, die genetische Grundlage entwickelte sich Änderungen an der Kiemen Skelett abzubilden. Ein trophic Merkmal ökologischer Bedeutung ist die Strukturierung von Kiemenreusen, regelmäßige Hautknochen, die die vorderen und hinteren Flächen der Kiemen Knochen Linie und werden verwendet, um Beutetiere zu filtern. Fische , die normalerweise ernähren sich von kleinen Beutetieren sind in der Regel mehr zu haben und dichter Abstand Kiemenreusen im Vergleich zu Fischen , die 14,15 auf größere Beutetiere ernähren. Variation in Kiemenreusen wurde berichtet, beide within und zwischen den Arten 14-19 und Aspekte der Kiemenreuse Muster tragen zu trophischen Nischen und Fitness - 16. Jahrzehnte der Forschung haben ausführlich Kiemenreuse Nummer und Längenänderung in threespine Stichlinge 17 dokumentiert - 21; Allerdings konzentrieren sich diese Studien typischerweise in der ersten Reihe von Kiemenreusen. Neuere Arbeiten über die Kiemen Skelett 22,23 und über eine einzelne Zeile in Kiemenreuse 23 Abstand Modularität in der genetischen Kontrolle Kiemenreuse Nummer angezeigt und Länge 24 Hervorhebung der Bedeutung mehr zu studieren , als Zeile ein oder eine einzelne Kiemenreuse zu verstehen , die Entwicklungs genetische Basis der Kiemenreuse Reduktion. Eine zweite trophische Merkmal sowohl ökologische und biomedizinische Bedeutung ist die Strukturierung von Schlundzähne. Zähne in Fischen kann sowohl in der Mundkiefer und im Kiemen Skelett, bekannt als Schlundzähne befinden. Oral Zähne sind in erster Linie für p verwendetrey erfassen , während Schlundzähne für Kauens und Beute Manipulation 25 verwendet werden - 27. Beide Sätze bilden über gemeinsame Entwicklungsmechanismen und sind entwicklungs homolog 28 betrachtet. Interessante Modularität tritt wobei einige Arten, wie Zebrabärbling, mangelnde Mund und Rückenschlundzähne 29 , während andere Spezies , die mehrere Zahn ceratobranchials haben, pharyngobranchials und manchmal basihyal verzahnten und hypobranchials 30. In Stichlinge sind Schlundzähne ventral am fünften ceratobranchial und dorsal auf den vorderen und hinteren pharyngobranchials 31 gefunden. Kinematics auf stickleback Fütterung zeigen die orale Kiefer ist in erster Linie für den Beutefang eingesetzt und erleichtert Saug Zuführung 9 Kauens zur Pharyngealia verlassen. In Cichliden, niedrigere Pharyngealia Morphologie variiert 32,33 dramatisch und wurde mit trophischen Nischen 34 adaptive und korreliert zu sein gezeigt. Multiweise Süßwasser stickleback Populationen dramatischen Anstieg der ventralen Schlundzähnezahl 23,35,36 entwickelt. Neuere Arbeiten haben gezeigt , dass die Entwicklung der genetischen Grundlage dieser entwickelte Zahn Verstärkung in zwei unabhängig voneinander abgeleitet Populationen von Süßwasser Stichlinge 36 weitgehend verschieden ist. Im Gegensatz zu Säugerzähne, regenerieren Fisch ihre Zähne kontinuierlich während des Erwachsenenlebens 37. Beide zuvor beschriebenen hohen Zahnsüßwasserpopulationen haben eine beschleunigte Zahnersatzrate entwickelt, ein seltenes wirbel System bietet die genetische Basis der Regeneration zu untersuchen 36. Eine dritte trophische Eigenschaft , die immer wieder in Süßwasser Stichlinge entwickelt hat , ist länger epibranchial und ceratobranchial Knochen, die Kiemenbogen segmentale Homologe des Ober- und Unterkiefer bzw. 38. Längere Kiemen Knochen verleihen einen größeren Mundhöhle und sind wahrscheinlich adaptive für so dass größere Beute c zu seinonsumed. Darüber hinaus in andere Fische sind epibranchial Knochen wichtig für die Vertiefung der Rückenschlundzahnplatten 25. Wie Kiemenreusen und Schlundzähne sind die Kiemen Knochen interne und somit schwer zu leicht zu visualisieren oder zu quantifizieren. Hier präsentieren wir ein ausführliches Protokoll zu sezieren und Flach montieren Kiemen Skelett, was eine einfache Visualisierung und Quantifizierung einer Vielzahl von wichtigen craniofacial Züge. Während dieses Protokoll eine stickleback dissection beschrieben, arbeitet dieses gleiche Verfahren auf einer Vielzahl von anderen Fischen.

<table><tbody><tr><td>Kaliumhydroxid (KOH)</td><td>EMD</td><td>PX1480-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893-4L</td><td></td></tr><tr><td>10% neutral gepuffertes Formalin (NBF)</td><td>Azer Scientific</td><td>NBF-4-G</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Rot S</td><td>EMD</td><td>AX0485-3</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Deckglas 22 mm x 60 mm</td><td>VWR</td><td>16004-350</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 10 mm Glas Petri Dish</td><td>Kimble Chase</td><td>23064-10010</td><td>Zum Sezieren von Proben auf</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer Kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 KG</td><td>Kann in Glas- oder Kunststoff-Petrischalen gegossen werden, um Präparierplatten herzustellen</td></tr><tr><td>Modelliermasse</td><td>Sargent Art</td><td>22-4000</td><td>1 Pfund Creme</td></tr><tr><td>Szintillationsfläschchen (Karton mit 500 Stück)</td><td>Wheaton</td><td>986586</td><td>Borosilikatglas mit Schraubverschluss</td></tr><tr><td>Pinzette-Dumont #5 Inox (Biologie Tipp)</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>Dumostars sind eine Alternative</td></tr><tr><td>Präparierschere&nbsp;</td><td>FST</td><td>15003-08</td><td>Alternative Größen sind je nach Größe der Probe erhältlich</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Leica</td><td>S6E mit KL300 LED</td><td>Viele andere Modelle funktionieren gut, ein flacher Boden hilft</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen 1,7 ml</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgertablett</td><td>aus Karton Fisher</td><td>12-587-10</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection und flach montage des dreistachliger stichling branchiogene skeleton

Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton

Die hinteren Rachensegmente des Wirbeltierkopfes bilden das Kiemenskelett, den primären Ort der Nahrungsverarbeitung bei Fischen. Die Morphologie des Kiemenskeletts der Fische ist auf die Ernährung einer Art abgestimmt. Der Dreistachlige Stichling (Gasterosteus aculeatus) hat sich als Modellsystem herausgestellt, um die genetischen und entwicklungsbedingten Grundlagen evolutionärer Unterschiede in einer Vielzahl von Merkmalen zu untersuchen. Meerespopulationen von Stichlingen haben immer wieder unzählige neue Süßwasserseen und -bäche besiedelt. Die Anpassung an die neue Ernährung in diesen Süßwasserumgebungen liegt wahrscheinlich einer Reihe von kraniofazialen Veränderungen zugrunde, die sich in unabhängig voneinander abgeleiteten Süßwasserpopulationen wiederholt entwickelt haben. Dazu gehören drei wichtige Veränderungen der Musterung des Kiemenskeletts: Verringerung der Anzahl und Länge der Kiemenrechenknochen, Zunahme der Anzahl der Rachenzähne und erhöhte Längen der Kiemenknochen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zum Präparieren und Abflachen des inneren Kiemenskeletts bei dreistachligen Stichlingen. Die Dissektion des gesamten dreidimensionalen Kiemenskeletts und dessen flache Montage in eine weitgehend zweidimensionale Präparation ermöglicht die einfache Visualisierung und Quantifizierung der Morphologie des Kiemenskeletts. Diese Präpariermethode ist kostengünstig, schnell, relativ einfach und auf eine Vielzahl von Fischarten anwendbar. Bei Stichlingen ermöglicht diese effiziente Methode die Quantifizierung der Skelettmorphologie in genetischen Kreuzungen, um genomische Regionen zu kartieren, die die kraniofaziale Musterbildung steuern.

<html> Dieses Protokoll führt zu einer seziert und flach montiert Kiemenskelett (Abbildung 4) , wo eine Vielzahl von wichtigen trophischen Merkmale quantifiziert werden können. Aus einer Rückenansicht werden alle Zeilen von Kiemenreusen, alle Zahnschlundplatten und fast alle Kiemen Knochen leicht sichtbar gemacht und quantifiziert 22 werden kann - 24,35,36,38,42. Alizarin Red S fluoresziert auch auf einem Rhodamin oder einem ähnlichen Rotf...

Das Kiemenskelett, einschließlich Kiemenrechen, Rachenzähne und Kiemenknochen, dient bei den meisten Fischen als primärer Ort der Nahrungsverarbeitung. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um dieses innere Skelett bei dreistachligen Stichlingen zu präparieren und flach zu montieren. Diese Methode ist auch auf eine Vielzahl anderer Fischarten anwendbar.

Dissection und Flach Montage des Dreistachliger Stichling Branchiogene Skeleton

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Kiemen-Skelett des Stichlings zu präparieren und flach einzubetten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Entwicklung, Genetik und Evolution zu beantworten, beispielsweise wie sich Tiere an neue Umgebungen anpassen und wie Variationen in der adulten Morphologie während der Entwicklung entstehen.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass durch die Präparation und flache Einbettung des branchialen Skeletts eine Vielzahl trophischer Merkmale sichtbar gemacht werden kann, die im Ganzpräparat nicht untersucht werden können. Bevor Sie beginnen, überprüfen Sie die relevante Kopfskelettmorphologie des Dreistachligen Stichlings. Nachdem Sie den Fisch für die Dissektion vorbereitet haben, setzen Sie eine scharfe Nr.-5-Pinzette seitlich am Auge in einem Winkel von 45 Grad an, um die Augenmembran zu durchstechen.Danach die Augenmembran wie einen Joghurtdeckel abl&ouml;sen. Anschlie&szlig;end die ge&ouml;ffnete Pinzette hinter das Auge einf&uuml;hren, den Sehnerv packen und das Auge entfernen. Dabei darauf achten, das Auge nicht zu durchstechen, da es sonst Melanin verliert.Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem Auge auf der gegenüberliegenden Seite. Legen Sie dann die Klinge einer kleinen Schere unter die hintere Seite der Kiemendeckklappe und schneiden Sie dorsal über dem Operculum durch das weiche Gewebe in Richtung Augenhöhle. Schneiden Sie anschließend durch das Frontalbein, das dorsal zur Augenhöhle liegt.Danach durch den mittigen Parasphenoidknochen schneiden, etwa in der Mitte der Augenhöhle. Den Schnitt am Operculum auf der gegenüberliegenden Seite wiederholen. Für die nächsten Schritte können die Beckenspinnen als Griffe verwendet werden.Sie klappen sich aus, indem man sie vorsichtig direkt vom Körper wegzieht. Führen Sie nun die Pinzette unter die Deckelplatte ein und lösen Sie langsam das Gesicht vom Körper ab, wobei Sie jegliches weiche Gewebe, das noch verbunden ist, abschneiden.Seien Sie vorsichtig bei den Kiemenreusenzinken und achten Sie darauf, sie nicht zu beschädigen. Beim Entfernen des Gesichtsskeletts ist es leicht, versehentlich den ersten Ceratobranchiale zusammen mit dem Percoll zu erfassen. Schauen Sie unter den Percoll, während Sie ihn nach vorne ablösen, um sicherzustellen, dass Sie nichts Zusätzliches erfasst haben.Jetzt mit einer Pinzette die Ceratohyale von beiden Seiten des mittigen Basihyals lösen, während das vordere kraniale Gesichtsskelett abgezogen und entfernt wird. Wiederholen Sie dies auf der gegenüberliegenden Seite. Das vordere kraniale Gesichtsskelett umfasst den gesamten Kiefer, das gesamte Hyoidskelett, die darunterliegenden dorsalen und enchondralen Elemente sowie den vorderen Teil des Schädels.Als Nächstes geschlossene Pinzette direkt unterhalb des Darmrohrs einführen und nach anterior ziehen, wobei die verbleibenden Muskeln und Bänder, die am branchialen Skelett befestigt sind, auseinandergezogen werden. Anschließend mit der Spitze der geschlossenen Pinzette die Muskeln abkratzen, die das dorsale branchiale Skelett mit dem ventralen Schädelgrund verbinden.Abkratzen Sie mit einer Bewegung von posterior nach anterior. Wiederholen Sie den Muskelentfernungsprozess auf der gegenüberliegenden Seite des Stichlings. Entfernen Sie anschließend das branchiale Skelett, indem Sie die Basis des Darmrohrs greifen und anterior ziehen.Trennen Sie den Darmkanal durch einen senkrechten Schnitt hinter dem fünften Ceratobranchiale. Ein häufiger Fehler ist es, den Darmkanal zu weit vorne zu fassen, wodurch der ventrale vordere Kanal weit zurückbleibt. Achten Sie darauf, tief im hinteren Bereich der Brusthöhle zuzugreifen; überschüssige Teile des Darmkanals können Sie anschließend jederzeit entfernen.Nachdem alle verbleibenden Knochenfragmente aus dem Schädelkasten auf der dorsalen Seite des Kiemen-Skeletts entfernt wurden, die Schere in den Kiemenkorb einführen und einen dorsalen Schnitt zwischen den beidseitigen dorsalen Zahnplatten ausführen. Diesen Schnitt mittig halten, um Schäden an den dorsalen Zahnplatten zu vermeiden.Danach zwei flache seitliche Schnitte im gummiartigen Darmlumen am hinteren Ende des branchialen Skeletts anlegen. Am vorderen Ende des Darmrohrs, um das Öffnen des branchialen Skeletts zu erleichtern.Überführen Sie nun das Skelett in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 50 Prozent Glycerin und 0,25 Prozent Kaliumhydroxid zur schonenden Klärung gefüllt ist. Alternativ überführen Sie es in reines Glycerin, falls keine weitere Klärung erforderlich ist. Falls eine erneute Färbung notwendig ist, finden sich die Einzelheiten im Textprotokoll.Um die Präparation vorzubereiten, wechseln Sie die Lösung zu reinem Glycerin und schütteln das Gefäß mindestens fünf Minuten lang. Entfernen Sie dann das branchiale Skelett und platzieren Sie es mit der dorsalen Seite nach oben nahe dem unteren Rand eines 22 mal 60 Millimeter großen Glasobjektträgers. Geben Sie nun einige Tropfen Glycerin auf das Skelett.Als Nächstes rollen Sie zwei kleine Kugeln aus Modelliermasse aus und platzieren Sie jeweils eine an beiden Enden des Deckgläschens; sie dienen als Abstandshalter. Legen Sie dann ein zweites Deckglas locker über die Präparation, mit ausreichend Druck, um das vordere branchiale Skelett zu glätten. Heben Sie nun die linke dorsale Klappe einschließlich der dorsalen Zahnplatten an und schieben Sie die Klappe zwischen die Deckgläser.Dann dasselbe mit der rechten dorsalen Klappe durchführen. Und das gesamte branchiale Skelett von der Kante der Deckglasplatte wegschieben. Um den Vorgang abzuschließen, leicht auf das obere Deckglas drücken, um die Tonkügelchen zu glätten.Nur so viel, dass das branchiale Skelett flach montiert bleibt. Aber nicht so viel, dass es zerquetscht wird. Falls während des Vorgangs eine Reihe von Kiemendornen verdeckt wird, schieben Sie die Pinzette zwischen die Deckgläser und richten Sie das Ceratobranchiale oder die gesamte Präparation neu aus.Wenn in reinem Glycerin flach eingebettet, kann die Präparation mindestens ein Jahrzehnt lang bei Raumtemperatur flach gelagert werden. Dieses Protokoll führt zu einem präparierten und flach eingebetteten branchialen Skelett, bei dem eine Vielzahl wichtiger trophischer Merkmale dokumentiert werden kann.Bei Betrachtung von dorsal lassen sich alle Reihen der Kiemenreusenzähnchen, alle pharyngealen Zahnplatten und nahezu alle branchialen Knochen leicht visualisieren und dokumentieren. Alizarinrot S fluoresziert ebenfalls mit einem Rhodamin- oder ähnlichen Rotfilter, wodurch eine Doppelfärbung mit anderen Markern sowie alternative Visualisierungsmethoden ermöglicht wird. In diesem Bild sind die Kiemenreusenzähnchen mit Dreieckspunkten markiert.Zähne sind mit Pfeilspitzen markiert und Knochen mit Sternchen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann die Dissektion in wenigen Minuten durchgeführt und an Hunderten von Tieren relativ schnell durchgeführt werden. Und obwohl wir eine Dissektion des Kiemenapparats des Stichlings demonstriert haben, hoffen wir, dass dieses Verfahren als Leitfaden für eine Vielzahl von Fischarten dienen kann.Indem wir das branchiale Skelett präparieren, können wir eine Vielzahl wichtiger trophischer Merkmale schnell und einfach sichtbar machen, die in Ganzpräparaten nicht sichtbar sind. Dies ermöglicht ein besseres Verständnis der Entwicklung und Evolution des kraniofazialen Skeletts.

dissection-flat-mounting-threespine-stickleback-branchial

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Biologie

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