Beurteilung der myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit Basiswert Cardiac elektromechanischen Kopplung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, das die Veränderungen der Myofilament-Ca2⁺-Empfindlichkeit während der Kontraktion in isolierten Herzmyozyten aus dem Rattenherz bewertet. Zusammen mit der kardialen Elektrophysiologie, den systolischen/diastolischen Zytosol-Ca2⁺-Spiegeln und der Kontraktion/Entspannung ist diese Messung unerlässlich, um die Mechanismen zu untermauern, die die kardiale Erregungs-Kontraktions-Kopplung bei gesunden und kranken Herzen vermitteln.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Zugang zur Myofilament-Kalziumsensitivität zu erhalten, um unser Verständnis der Mechanismen zu verbessern, die der Kontraktion in gesunden und kranken Herzen zugrunde liegen. Diese Methode kann helfen, Fragen im Zusammenhang mit Herzstauung und Herzinsuffizienz zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zusammen mit Ionenkanälen, Ionentransportern und interzellulärer Kalziumhandhabung ein umfassendes Verständnis des Mechanismus ermöglicht, der der Kontraktilität des Mausherzens bei gesunden und kranken Herzen zugrunde liegt.

Um diesen Vorgang zu starten, erhitzen Sie zwei Wasserbäder auf 37 Grad Celsius. Geben Sie fünf Milliliter calciumfreie BSA-Lösung zu 25 Millilitern Kollagenaselösung eins und 3,3 Milliliter calciumfreie BSA-Lösung zu 16,7 Milliliter Kollagenaselösung zwei. Geben Sie dann 100 Milliliter Isolationslösung in Spalte eins und 30 Milliliter Kollagenaselösung eins in Spalte zwei im Langendorff-Perfusionssystem.

Die Isolationslösung und die Kollagenaselösung eins in Säule eins und Spalte zwei über den Sauerstoffanschlussschlauch im Langendorff-Perfusionssystem mit Sauerstoff versorgen. In ähnlicher Weise wird die Kollagenase-Lösung zwei und die BSA-Lösung im Schüttelwasserbad mit 100%igem Sauerstoff über den Sauerstoffverbindungsschlauch mit Sauerstoff angereichert. In diesem Schritt bestätigen Sie nach der Anästhesie einer SD-Ratte durch interperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium den Anästhesiestatus durch Einklemmen der Zehen und das Fehlen eines Entzugsreflexes.

Übertragen Sie die Ratte anschließend auf ein Seziertablett. Befestigen Sie in Rückenlage vier Beine mit Klebeband an den Seiten des Körpers. Anschließend klemmen Sie die Aorta mit einer feinen Pinzette ein und montieren sofort die Kanüle des Langendorff-Perfusionssystems.

Binden Sie danach den Nahtfaden fest über die Aorta. Schalten Sie das Ventil an der ersten Säule ein und perfundieren Sie das isolierte Herz 10 Minuten lang mit vorgewärmter, sauerstoffhaltiger Isolationslösung. Schalten Sie anschließend die Klappe an der zweiten Säule ein und perfundieren Sie das Herz acht bis 10 Minuten lang mit Kollagenaselösung eins.

Entfernen Sie anschließend das verdaute Herz, indem Sie die Aorta durchtrennen, und geben Sie es in den Kolben mit der frischen Isolationslösung. Schneiden Sie mit einer feinen Schere und Pinzette den größten Teil der LV-freien Wand, einschließlich des Septums, in kleinere Stücke. Übertragen Sie dann das Gewebe in einen Kolben mit vorgewärmter und sauerstoffreicher, frischer Kollagenaselösung zwei.

Schütteln Sie sie dann 10 Minuten lang und halten Sie die Myozyten, die Kollagenaselösung enthalten, zwei sauerstoffreich. Übertragen Sie anschließend die Myozytensuspension in ein 10-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie kalziumhaltige BSA-Lösung hinzu. Zentrifugieren Sie es zwei Minuten lang.

Nach zwei Minuten wird der Überstand verworfen und das Myozytenpellet in fünf Millilitern BSA-Lösung wieder suspendiert. Dann zentrifugieren und den Überstand wieder verwerfen. Als nächstes dispergieren Sie das Myozytenpellet und bewahren Sie die Myozyten bis zum Ende des Experiments in 10 Millilitern präsauerstoffreicher Lagerlösung bei Raumtemperatur auf.

Laden Sie nun die LV-Myozyten mit zwei mikromolaren Acetoxymethylester Fura-2AM. Zentrifugieren Sie einen Milliliter Myozytensuspension 10 Sekunden lang. Verwerfen Sie dann den Überstand und suspendieren Sie das Myozytenpellet in einem Milliliter Tyrodenlösung mit einer niedrigen Kalziumkonzentration erneut.

Anschließend fügen Sie den Myozyten Fura-2AM und zwei Mikroliter Poloxamer 407 hinzu. Dispergieren Sie die Myozytensuspension vorsichtig und halten Sie die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach 15 Minuten zentrifugieren Sie die Mischung fünf Sekunden lang.

Der Überstand wird verworfen und das Myozytenpellet in einem Milliliter Perfusionslösung dispergiert, die 500 mikromolares Kalzium enthält. Nach 10 Minuten zentrifugieren Sie die Mischung fünf Sekunden lang und verwerfen Sie den Überstand. Fügen Sie als Nächstes frische Perfusionslösung hinzu und bewahren Sie das mit Fura-2AM beladene Myozytenpellet in dieser Lösung für Aufnahmen auf.

Füllen Sie vor der Aufnahme den Perfusionsschlauch, der durch einen Wassermantel verläuft, mit der 36 Grad Celsius heißen Tyrodenlösung. Geben Sie anschließend einige Tropfen der mit Fura-2AM beladenen LV-Myozytensuspension auf die Kammer eines inversen Fluoreszenzmikroskops und warten Sie fünf bis acht Minuten. Perfundieren Sie es langsam mit der Tyrode-Lösung bei 2,2 Millilitern pro Minute.

Drücken Sie dann die Starttaste auf der Vorderseite des digitalen Stimulators, um die Feldstimulation bei zwei Hertz zu starten. Wählen Sie die Myozyten aus, die sich für die Aufzeichnung stabil zusammenziehen. Hier sind die Rohspuren der Sarkomerverkürzung und der Messung des Fura-2-Verhältnisses in LV-Myozyten von Schein- und Bluthochdruckratten dargestellt.

Hier sind die durchschnittlichen Spuren der Sarkomerlänge und der Fura-2-Signale. Und hier sind die Phasenebenendiagramme des Fura-2-Verhältnisses gegen die Sarkomerlänge in den beiden Gruppen. Die Trajektorienschleife ist nach rechts verschoben und EC50 ist tendenziell höher bei Bluthochdruck, was auf eine Desensibilisierung des Myofilament-Kalziums hindeutet.

Bevor Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Cortium, die isolierten Myozyten, zu testen, indem Sie die Myozytenkontraktion ohne Fura-2AM-Belastung nachweisen. Überprüfen Sie außerdem immer die Myozytenkontraktion nach der Fura-2AM-Belastung, um eine Überlastung zu vermeiden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Patch-Clamp-Techniken durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.

Zum Beispiel, A Typ ca Kanalaktivität, das heißt, im Verb, die Myozyten-Erregungs-Kontraktions-Kopplung. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher in der Zukunft der Herzphysiologie geebnet, um mehr Einblicke in Herzerkrankungen beim Menschen zu gewinnen. Nach routinemäßiger Erfahrung sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Aktivität des Myofilament-Kalziumkanals analysiert.

Um die Mechanismen der kardialen Erregungs-Kontraktions-Kopplung bei gesunden und kranken Herzen besser zu verstehen.