Name: Beurteilung der myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit Basiswert Cardiac elektromechanischen Kopplung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung der Myofilament-Ca²⁺-Empfindlichkeit in isolierten Herzmuskelzellen mittels Fura-2-AM und Sarkomerlängenmessung. Diese Methode ermöglicht die Analyse der elektromechanischen Kopplung bei Herzinsuffizienz und Hypertonie.

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Diese Forschung wurde von der Grundlagenforschung Forschungsprogramm durch die National Research Foundation of Korea (NRF) vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (2013068067) finanziert unterstützt; von Brain Korea 21 Graduiertenprogramm des koreanischen Ministeriums für Bildung, Wissenschaft und Technologie, Seoul National University Hospital, der koreanischen Society of Hypertension (2013), SK Telecom Research Fund (Nr. 3420130290) und der National Natural Science Foundation of China (NSFC 31.460.265; NSFC 81.260.035).

Das Protokoll ist in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die UN-National Institutes of Health veröffentlicht (NIH Publication No. 85-23, überarbeitet 1996). Es wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der Seoul National University (IACUC Zulassung Nr .: SNU-101213-1) zugelassen. 1. Puffer Vorbereitung (Tabelle Materialien und Geräte) <ol><li> Bereiten 300 ml frisches Isolationslösung am Tag des Experiments (in mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl 2 3,5; Glucose, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0,4; Taurin, 20; pH 7,4 mit NaOH). </li><li> Herstellung von 100 ml frischem Aufbewahrungslösung am Tag des Experiments (in mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO 4 5; CaCl 2 0,2; Natrium-Pyruvat 5; 5,5 Glucose; Taurin 20; HEPES 10; Mannit 29; pH 7,4 mit NaOH). </li><li> Bereiten 1L Perfusionslösung (in mM: NaCl, 141,4; KCl, 4; NaH 2 PO 4, 0,33; MgCl 2, 1; HEPES, 10; Glucose, 5,5; CaCl 2, 1,8; Mannit, 14.5; pH 7,4 mit NaOH). </li><li> Herstellung von 30 ml Kollagenase - Lösung 1 durch Kollagenase - Zugabe (1 mg / ml), Protease (0,1 mg / ml), Rinderserumalbumin (BSA, 1.67mg / ml) und Ca 2+ (0,05 mM) 25 ml Isolations Lösung. </li><li> Es werden 20 ml Kollagenase - Lösung 2 durch Kollagenase Zugabe (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml) und Ca 2+ (0,05 mM) zu 16,7 ml Isolierungslösung. </li><li> Vorbereitung 40 ml BSA-Lösung durch Zugabe von 0,4 g BSA zu 40 ml Isolationslösung. Separate 10 ml und 30 ml in zwei Bechern. Hinzufügen Ca 2+ zu 30 ml BSA - Lösung so , dass die endgültige Ca 2+ -Konzentration in der BSA - Lösung beträgt 1 mM. </li></ol> 2. Vorbereitung für die Isolierung der linksventrikulären (LV) Myozyten <ol><li> Übertragen 8-12 Wochen alte, männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten in sauberen Transportkäfigen aus dem Tier Anlage zur Herstellung und Isolierung Raum. </li><li> Hessen zwei Wasserbäder bis 37 o C. Hinweis: Verwenden Sie ein Wasserbad für das Wasser - ummantelten Reservoir und den Perfusionsschläuche des Langendorff-Perfusionssystem. Verwenden Sie die anderen Wasserbad Myokardgewebe Stämme, um zu agitieren einzelnen Myozyten zu trennen. </li><li> 5 ml und 3,3 ml BSA - Lösung (ohne Ca 2+) zu 25 ml Kollagenase - Lösung 1 und 16,7 ml Kollagenase - Lösung 2 , um das Volumen auf 30 ml zu begrenzen und 20 ml. </li><li> Hinzufügen Isolationslösung (100 ml) und Kollagenase - Lösung 1 (30 ml) zu Spalte 1 (Col. 1) und der Spalte 2 (Col. 2) in der Langendorff - Perfusionssystem, bzw. (1A). </li><li> Oxydieren das Isolationslösung und Kollagenase - Lösung 1 in Spalte 1 und Spalte 2 über das Sauerstoffverbindungsrohr in der Langendorff - Perfusionssystem (1A). In ähnlicher Weise oxygenate Kollagenase - Lösung 2 und die BSA - Lösung im Schüttelwasserbad mit 100% O 2 über dieSauerstoff Verbindungsrohr. </li></ol> 3. Isolierung von LV Myozyten <ol><li> Anesthetize eine SD - Ratte über intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital (30 mg / kg) und das Anästhetikum Status durch Zeh bestätigen Kneifen und der Mangel an Rückzug Reflexion. </li><li> Bewegen Sie die Ratte auf eine Dissektion Fach. In der Rückenlage, sichern Sie die vier Beine an den Seiten des Körpers mit Klebeband. </li><li> Bewerben Brust-Mitte axiale Einschnitte mit chirurgischen Schere, um die Truhe zu öffnen, um sicherzustellen, das Herz nicht zu beschädigen. Verwenden Sie ein anderes Paar saubere Schere , um das Herz von den Verbindungsgefäße zu sezieren (zB obere und untere Hohlvene, Lungengefäße und Aorta) und Perikardmembran 13. </li><li> Lassen Sie einen Teil der Aorta eine ausreichende Länge (5-8 mm), klemmen die Aorta mit einer feinen Pinzette, und montieren Sie schnell die Kanüle des Langendorff - Perfusionssystem innerhalb von 1 min (1A). Binden Sie Nähfaden 4/0 dicht über der Aorta. </li><li&gt; Schalten Sie das Ventil auf Spalte 1 und das isolierte Herz mit vorgewärmten und mit Sauerstoff angereicherten Isolationslösung für 10 min (Perfusions-Rate: 12-14 ml / min) perfuse. Schalten Sie das Ventil auf Spalte 1, schalten Sie das Ventil auf Spalte 2 und perfuse das Herz mit Kollagenase-Lösung 1 für 8 - 10 min. </li><li> Abmontieren verdaut Herz durch die Aorta schneiden und übertragen es durch Halten der Aorta mit einer Pinzette in den Kolben mit frischen Isolationslösung (Abbildung 1Bi). Verwenden einer feinen Schere und Pinzette die meisten der LV freien Wand zu schneiden (einschließlich des Septum) in kleinere Stücke (~ 22 mm, Abbildung 1Bii). </li><li> Übertragen Sie die Stücke in einen Kolben vorgewärmte und mit Sauerstoff angereicherte frische Kollagenase - Lösung 2 (Abbildung 1Biii) enthält. Schütteln für 10 min. Halten Sie sich an die myocyte haltigen Kollagenase-Lösung 2 liefert Sauerstoff. </li><li> Bewegen Sie den myocyte - Suspension auf eine 10 ml Zentrifugenröhrchen Tropfer mit einem Saugball mit und fügen Ca 2+ - enthält BSA - Lösung (1: 1 in Volumen). Zentrifuge bei 30 g für 2 min und den Überstand verwerfen. Resuspendieren des Pellets Myozyten in 5 ml BSA-Lösung. Zentrifuge und den Überstand verwerfen. </li><li> Disperse die myocyte Pellets und halten Myozyten in 10 ml vorge mit Sauerstoff angereicherte Speicherlösung bei RT (Abbildung 1Biv-vi). </li><li> Wiederholen Sie die Verfahren (Schritte 3,7-3,9) mit dem restlichen LV Gewebe in den Kolben. Hinweis: Bewahren Sie die Verfahren zu wiederholen (Schritte 3,7 bis 3,9) erneut, bis die meisten der LV Gewebe verschwindet eine gute Ausbeute an Myozyten zu erhalten. </li><li> Halten Sie die Myozyten in Speicherlösung für 6-8 Stunden bei RT bis zum Ende der Experimente. </li></ol> 4. Gleichzeitige Messungen intrazellulärer Ca 2+ Transienten und Muskelzellen Kontraktions <ol><li> Last LV Myozyten mit dem Acetoxymethylester Fura-2 AM (2 uM). Hinweis: Führen Sie alle Ladevorgänge und Experimente mit geladenen Myozyten in einem dunklen Rohr (Abbildung 1Bvii). <ol><li> Centrifuge die Myozyten-Suspension (1 ml) bei 2.000 xg für 10 sec. Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren die myocyte Pellet in 1 ml Tyrode - Lösung mit einer niedrigen Ca 2+ Konzentration (250 &amp; mgr; M, Tisch Materialien und Geräte). </li><li> In Fura-02.00 und Poloxamer 407 (2 ul), sanft die myocyte Suspension zu dispergieren, und halten Sie die Mischung bei RT (20 bis 24 ° C) für 15 Minuten (Abbildung 1Bvii). </li><li> Zentrifuge die Mischung für 5 Sekunden, um den Überstand verwerfen und die Myozyten - Pellet in 1 ml Perfusionslösung 2+ , enthaltend 500 uM Ca dispergieren. Nach 10 min Zentrifugation der Mischung für 5 Sekunden und den Überstand verwerfen. </li><li> In frischen Perfusions - Lösung (500 &amp; mgr; M Ca 2+, 1 ml) und halten Sie die Fura-02.00 - geladen myocyte Pellet in dieser Lösung für Aufnahmen. </li></ol></li><li> Messung des LV Myozyten Kontraktion und intrazellulären Ca 2+ <ol><li> Vor der Aufnahme, füllen Sie das Perfusions-Schlauch, der durch eine läuftWassermantel mit der Tyrode - Lösung, die auf 36 o C vorgewärmt ist </li><li> Legen Sie ein paar Tropfen des Fura 02.00 - geladen LV myocyte Suspension auf die Kammer eines invertierten Fluoreszenzmikroskop 5 - 8 min. perfuse langsam die Tyrode-Lösung (2,2 ml / min). </li><li> Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Start&quot; auf der Frontplatte des digitalen Stimulator Feldstimulation (2 Hz) starten. Hinweis: Die Ausgangsspannung (10 V, 5 msec Dauer) wird in der Kammer durch Platindrähte mit den Myozyten aufgebracht auf jeder Seite der Kammer positioniert ist. <ol><li> Wählen Sie Myozyten stabil, dass Vertrag (nicht diejenigen, die Anzeige Hyper- oder Hypo-Kontraktion) für die Aufnahme. </li></ol></li><li> Stellen Sie die myocyte der Wahl in der horizontalen Position des videobasierten Sarkomers Detektionssystem und stellen Sie den Fokus des Mikroskops optimale Bilder von Sarkomere zu erhalten. Positionieren Sie den lila rechteckigen Kasten auf dem Gebiet, in dem klar Sarkomere klar, bis die durchschnittliche beobachtet werdenvon Sarkomers Längen (rot Peak) zeigt eine singuläre scharfe Spitze (2A, unteres Bild). </li><li> Aufzeichnen der Änderungen der Sarkomerlänge in Reaktion auf Feldstimulation (2A und B). Hinweis: Verwenden Sie die geladenen Myozyten in 1 - 2 Stunden. </li><li> Stellen Sie die Blende der Kamera so , dass das Feld in der videobasierten Sarkomers Detektionssystem ist die Größe der Myozyten (2A). Stimulieren die Myozyten mit einer Anregung bei 360 nm / 380 nm und Emission bei 510 nm (Erfassungsfrequenz 1000 Hz). Nehmen Sie Sarkomerverkürzung und die Fura2 AM Verhältnis mit Feldstimulation (2B). </li></ol></li></ol> 5. Bewertung der myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit <ol><li> Der Mittelwert der Sarkomers Längen und Ca 2+ Transienten im Steady-State (10 - 20 Spuren) , und zeichnen Sie die Phase-Ebene Schleife des Fura-2 - Verhältnis vs. Sarkomerlänge des gleichen myocyte (beide mit Messwerts und Deltaänderungen; 2C). </li><li> In jedem Plot definieren Fura -2 - Verhältnis bei 50% Relaxation (EC 50, 2C). Vergleichen Sie sowohl die Schleife und EC 50 von jeder Intervention. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Hier beschreiben wir die Protokolle Änderungen von myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in einzelnen isolierten Kardiomyozyten zu bewerten und betonen die Bedeutung der Messung dieser Parameter neben elektrophysiologischen Eigenschaften, die intrazelluläre Ca2 + Transienten und myofilament Dynamik. Dies liegt daran, die Aufnahmen von einem oder zwei der Parameter können die Mechanismen zugrunde liegenden Herzkontraktion und Entspannung nicht expliziert. Im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren , die My...

Kardiale Erregungs Kontraktion (EC) Kopplung ist das Grundschema für die mechanischen Eigenschaften des Myokards Analyse, dh die kontraktile Funktion des Herzens 1,2. EC Kopplung durch Membrandepolarisation sekundär zu den Aktivitäten von sarkolemmalen Ionenkanäle (beispielsweise die spannungsabhängigen Na + Kanal, der durch Patch-Clamp - Techniken gemessen werden kann) eingeleitet wird. Nachfolgende Aktivierung von spannungsabhängigen L-Typ - Ca 2+ -Kanälen (LTCC) und Ca 2+ -Einstrom durch LTCCs den Großteil der Ca 2+ -Freisetzung durch Ryanodin - Rezeptoren (RyRs) auslösen, die cytosolische Ca 2+ -Konzentration von nanomolaren Erhöhung (nM ) (uM) Ebene mikromolar. Eine solche Erhöhung der cytosolischen Ca 2+ Ca 2+ fördert die Bindung an Troponin C (TnC) in dünnen Fäden und entlockt Konformationsänderungen des Filaments Komplex die Actin-Myosin - Wechselwirkung zu erleichtern , und erreicht myocardial Kontraktion 3. Umgekehrt wird die cytosolische Ca 2+ erneut uptaken zurück in das sarkoplasmatische Retikulum (SR) durch die Ca 2+ -ATPase in SR (SERCA2a) oder aus dem Myozyten über das Na + / Ca 2+ -Austauscher und dem Plasmalemma extrudiert Ca 2+ ATPase 1,2. Folglich stiftet der Rückgang der cytosolischen Ca 2+ Konformationsänderungen von dünnen Fäden wieder in den ursprünglichen Zustand, was zur Dissoziation von Aktin-Myosin und myocyte Entspannung 1-3. In diesem Schema wird die Aktivität von SERCA2a allgemein als die Geschwindigkeit der myokardialen Entspannung zu bestimmen , weil es für die 70 - Konten - 90% der cytosolischen Ca 2+ Entfernung in den meisten Säugetierherzzellen 1. Als solche anormalen Handhabung Ca 2+ von LTCC, RyR und SERCA2a usw. hat die primären Mechanismen für beeinträchtigte Kontraktilität und Entspannung in das kranke Herz 1-4 betrachtet. 2+ , die Funktionen als der Bote in der EG - Kopplung entfallen rund 1% der gesamten intrazellulären Ca 2+ und die Mehrheit der Ca 2+ gebunden ist , an intrazelluläre Ca2 + Puffer 5,6. Dies ist aufgrund der Tatsache , dass verschiedene Ca 2+ Puffer in Herzmyocyten reichlich vorhanden sind, beispielsweise Membran - Phospholipiden, ATP, Phosphokreatin, Calmodulin, Parvalbumin, Myofibrille TnC, Myosin, SERCA2a und Calsequestrin in der SR. 5,6,7. Unter ihnen sind SERCA2a und TnC die vorherrschenden Ca2 + Puffer 5,6,7. Weiterhin 2+ Ca seiner Bindungspuffern während twitch ein dynamischer Prozess ist (beispielsweise 30-50% der Ca 2+ bindet an TnC und distanzieren von ihm während Ca 2+ Transienten 7) und die Änderung in Ca 2+ Bindungs ​​Ursache zusätzlicher &quot;Freigabe&quot; von freiem Ca 2+ in das Cytosol führt zu den Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ concentration. Folglich Störung der intrazellulären Ca 2+ Ebene induziert abnorme myofilament Bewegungen, die die Vorläufer der Kontraktions Dysfunktion und Arrhythmien 8,9. Viele Faktoren (sowohl physiologische und pathologische) können die Quellen der post-transkriptionalen Modifikationen myofilament Proteine ​​sein, die myofilament Ca 2+ Pufferung und myofilament 2+ 8-10 Empfindlichkeit Ca beeinflussen. Vor kurzem wurde berichtet , dass Mutationen in myofilament Proteine ​​, die die Ca 2+ erhöhen Bindungsaffinität und die intrazelluläre Ca2 + Handhabung, die Auslösung Pause abhängige Potenzierung von Ca 2+ Transienten, abnormal Ca 2+ Freisetzung und Arrhythmien 8. Im Einklang mit diesem Konzept haben wir auch , dass myofilament Ca 2+ Desensibilisierung bei hypertensiven Rattenherzen sekundär auf die Hochregulation der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase mit erhöhten systolischen und diastolischen Ca 2+ Ebenen zugeordnet gezeigt11, die wiederum 12 die Anfälligkeit der LTCC auf Ca 2+ -abhängigen Inaktivierung erhöht. Daher ist myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit ein &quot;aktives&quot; Regulator der intrazellulären Ca 2+ Homöostase und Myozyten kontraktilen Funktion. Es ist notwendig geworden , Wechselwirkungen zwischen myofilament und Ca 2+ zu analysieren Proteine ​​für die gründliche Untersuchung von myocyte EG - Kopplung und die Herzfunktion Handhabung. Hier beschreiben wir ein Protokoll , das die Veränderungen der myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in isolierten Kardiomyozyten bewertet. Umfassende Analyse der intrazellulären Ca 2+ Profil, myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit und Kontraktion werden neuartige Mechanismen der myokardialen Mechanik raben.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley Ratte</td><td>Koatech</td><td></td><td>8-12 Wochen</td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium</td><td>Hanlim Pharmaceutical (Korea)</td><td>AHN901</td><td>Versicherungscode:645301220</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Pyruvat</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Merck</td><td>8.08616.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; </td><td>Sigma</td><td>71649</td><td></td></tr><tr><td>Rinderfötales Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 (AM)</td><td>Molekulare Sonden</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronsäure F127 20% ige Lösung in DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Schüttelwasserbad</td><td>Chang Shin Wissenschaftliches</td><td>Modell: C-108</td><td></td></tr><tr><td>IonWizard Softwae Suite</td><td>IonOptix Ltd</td><td>Experimental</td><td>Builder Erfassung und Analyse von EC-Kupplungsdaten in Myozyten</td></tr><tr><td>Myozyten Myozyten Calcium & Kontraktilitätsaufzeichnungssystem</td><td>IonOptix Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zirkulierendes Wasserbad</td><td>BS-Tech</td><td>BW2-8</td><td></td></tr><tr><td>Myozyten-Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td>DIATPHOTO 200</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S Power</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz & Videodetektion</td><td>IonOptix</td><td>MyoCam-S</td><td></td></tr><tr><td>CFA300</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT400</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz & Systemschnittstelle</td><td>IonOptix</td><td>FSI700</td><td></td></tr><tr><td>Anregungslichtquelle</td><td>IonOptix</td><td>mSTEP</td><td></td></tr><tr><td>Hochintensität ARC Lampe Stromversorgung</td><td>Cairn Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter Radcontroller</td><td>IonOptix</td><td>GB/MUS200</td><td></td></tr><tr><td>Digitaler Stimulator</td><td>Medizinische Systeme Corportion</td><td>S-98 Mutimode</td><td></td></tr><tr><td>Zusammensetzungen experimenteller Lösungen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><>Name</td><td><>Company</td><td>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Isolationslösung (pH: 7,4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Konzentration (mmol) 135</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Konzentration (mmol) 5,4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Konzentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Glukose</td><td></td><td>Sigma G8270</td><td>Konzentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Konzentration (mmol) 3,5</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Konzentration (mmol) 20</td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; </td><td>Sigma</td><td>71649</td><td>Konzentration (mmol) 0,4</td></tr><tr><td>Lagerlösung (pH: 7,4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Konzentration (mmol) 120</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Konzentration (mmol) 5,4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Konzentration (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Konzentration (mmol) 5,5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Konzentration (mmol) 0,2</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Konzentration (mmol) 29</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td>Konzentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td>Konzentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Konzentration (mmol) 20</td></tr><tr><td>Perfusionslösung (Tyrodlösung, pH: 7,4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Konzentration (mmol) 141,4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Konzentration (mmol) 4</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>Konzentration (mmol) 0,33</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Konzentration (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Konzentration (mmol) 5,5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Konzentration (mmol) 1,8&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Für die Beladung mit Fura 2AM betragen die CaCl2-Konzentrationen 0,25 mM und 0,5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Konzentration (mmol) 1</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Konzentration (mmol) 14,5</td></tr><tr><td>Collangenase Lösung 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolationslösung (30 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderfötales Albumin (BSA-Lösung 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Konzentration (mmol) 1,67 mg/ml</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Konzentration (mmol) 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td>Konzentration (mmol) 0,1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Konzentration (mmol) 0,05 mM</td></tr><tr><td>Collangenase Lösung 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolationslösung ( 20 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinder-Fetales Albumin (BSA-Lösung 3,3 mL)</td><td></td><td></td><td>Konzentration (mmol) 1,67 mg/mL</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Konzentration (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Konzentration (mmol) 0,05 mM</td></tr><tr><td>BSA-Lösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolationslösung ( 40 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinder-Fetales Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Konzentration (mmol) 400 mg</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Konzentration (mmol) 1 mM</td></tr></tbody></table>

beurteilung der myofilament ca<sup&gt; 2+</sup&gt; empfindlichkeit basiswert cardiac elektromechanischen kopplung

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

Herzinsuffizienz und Herzrhythmusstörungen sind die häufigsten Ursachen für Mortalität und Morbidität weltweit. Jedoch bleibt der Mechanismus der Pathogenese und myokardialen Funktionsstörung in dem erkrankten Herzen vollständig geklärt werden. Recent zwingenden Beweis zeigt , daß Änderungen in der myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit beeinflussen intrazellulärem Ca 2+ Homöostase und Ionenkanalaktivitäten in Kardiomyozyten, die wesentlichen Mechanismen , die für die kardialen Aktionspotentials und Kontraktion in gesunden und kranken Herzen. Tatsächlich Aktivitäten von Ionenkanälen und Transportern Herzaktionspotentiale zugrunde liegen (zB Na +, Ca 2+ und K + -Kanäle und der Na + -Ca 2+ Exchanger) und die intrazelluläre Ca 2+ Umgang mit Proteinen (z. B. Ryanodinrezeptoren und Ca 2+ -ATPase in Retikulum (SERCA2a) oder Phospholamban und seine Phosphorylierung) werden üblicherweise auf Evalu gemessenaßen die grundlegenden Mechanismen von Herz Erregung und Kontraktion (EG) Kupplung. Beide elektrischen Aktivitäten in der Membran und die intrazelluläre Ca 2+ Veränderungen sind die Triggersignale von EC - Kopplung, wohingegen myofilament die Funktionseinheit der Kontraktion und Entspannung, und myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit ist zwingend notwendig , bei der Umsetzung von Myofibrillen Leistung. Dennoch wenige Studien inkorporieren myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in die funktionelle Analyse des Myokards , wenn es im Mittelpunkt der Studie. Hier beschreiben wir ein Protokoll , das Sarkomerverkürzung / re-Verlängerung und der intrazellulären Ca 2+ Ebene mit Fura-2 AM (ratiometrisch Erkennung) und bewerten die Veränderungen von myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in Herzmuskelzellen aus Rattenherzen misst. Das Hauptziel ist , dass myofilament betonen Ca 2+ Empfindlichkeit sollte für mechanistische Analyse in Betracht EG Kupplung genommen werden. Umfassende Untersuchung von iauf den Kanälen, Ionentransporter, intrazellulärer Ca 2+ Handhabung und myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit , die myocyte Kontraktilität in gesunden und kranken Herzen zu Grunde liegen wird für die Gestaltung wirksamer Strategien der translationalen und therapeutischen Wert wertvolle Informationen liefern.

LV Myozyten werden aus normalen und hypertensiven Rattenherzen isoliert. Stabförmige Myozyten mit klaren Riefen (die Sarkomere) und stabile Kontraktionen in Reaktion auf Feldstimulation werden als die optimale Myozyten zu sein und sind für die Aufnahmen (2A) ausgewählt. In dem Beispiel in F ild 2A gezeigt ist , -beladene a Fura 02.00 LV Myozyten ist horizontal und die Blende der Kamera positioniert ist , so eingestellt, dass die Myozyten der größte Teil ...

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, das die Veränderungen der Myofilament-Ca2+-Empfindlichkeit während der Kontraktion in isolierten Herzmyozyten aus dem Rattenherz bewertet. Zusammen mit der kardialen Elektrophysiologie, den systolischen/diastolischen Zytosol-Ca2+-Spiegeln und der Kontraktion/Entspannung ist diese Messung unerlässlich, um die Mechanismen zu untermauern, die die kardiale Erregungs-Kontraktions-Kopplung bei gesunden und kranken Herzen vermitteln.

Beurteilung der myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Empfindlichkeit Basiswert Cardiac elektromechanischen Kopplung

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Kalziumempfindlichkeit der Myofilamente zu untersuchen, um ein besseres Verständnis der Mechanismen zu erlangen, die der Kontraktion gesunder und erkrankter Herzen zugrunde liegen. Diese Methode kann helfen, Fragen im Zusammenhang mit Herzstauung und Herzinsuffizienz zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zusammen mit Ionenkanälen, Ionentransportern und der interzellulären Kalziumregulation ein umfassendes Verständnis der Mechanismen vermittelt, die der Kontraktilität des Mausherzens bei Gesundheit und Herzerkrankung zugrunde liegen.Um dieses Verfahren zu beginnen, heizen Sie zwei Wasserbäder auf 37 Grad Celsius auf. Geben Sie fünf Milliliter kalziumfreie BSA-Lösung zu 25 Milliliter Kollagenase-Lösung eins und 3,3 Milliliter kalziumfreie BSA-Lösung zu 16,7 Milliliter Kollagenase-Lösung zwei hinzu. Anschließend geben Sie 100 Milliliter Isolationslösung in Säule eins und 30 Milliliter Kollagenase-Lösung eins in Säule zwei des Langendorff-Perfusionssystems.Sauerstoffen Sie die Isolationslösung und die Kollagenaselösung in Spalte eins und Spalte zwei über das Sauerstoffanschlussrohr im Langendorff-Perfusionssystem. Sauerstoffen Sie auf ähnliche Weise die Kollagenaselösung zwei und die BSA-Lösung im schüttelnden Wasserbad mit 100 % Sauerstoff über das Sauerstoffanschlussrohr. In diesem Schritt bestätigen Sie nach der Anästhesie einer SD-Ratte mittels intraperitonealer Injektion von Natriumpentobarbital den Anästhesiezustand durch Zehenquetschen und das Fehlen des Withdrawal-Reflexes.Anschließend den Ratten auf ein Präparationsbrett überführen. In Rückenlage die vier Beine mit Klebeband an den Seiten des Körpers fixieren. Danach die Aorta mit feinen Pinzetten klemmen und unverzüglich die Kanüle des Langendorff-Perfusionssystems montieren.Danach die Nahtnaht fest über der Aorta verknoten. Das Ventil an Säule eins einschalten und das isolierte Herz 10 Minuten lang mit vorgewärmter, mit Sauerstoff angereicherter Isolationslösung perfundieren. Anschließend das Ventil an Säule zwei einschalten und das Herz 8 bis 10 Minuten lang mit Kollagenase-Lösung eins perfundieren.Anschließend entfernen Sie das digestierte Herz, indem Sie die Aorta durchtrennen, und überführen es in den Kolben mit frischer Isolationslösung. Schneiden Sie mit feinen Scheren und einer Pinzette den größten Teil der freien LV-Wand einschließlich des Septums in kleinere Stücke. Überführen Sie das Gewebe danach in einen Kolben mit vorgewärmter und mit Sauerstoff angereicherter, frischer Kollagenase-Lösung zwei. Danach 10 Minuten schütteln und die Myozyten enthaltende Kollagenase-Lösung zwei Mal mit Sauerstoff versorgen. Anschließend die Myozytensuspension in ein 10-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen und BSA-Lösung mit Calcium zugeben. Zwei Minuten lang zentrifugieren.Nach zwei Minuten den Überstand verwerfen und das Myozyten-Pellet in fünf Milliliter BSA-Lösung resuspendieren. Anschließend erneut zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Danach das Myozyten-Pellet dispergieren und die Myozyten bis zum Ende des Experiments in 10 Milliliter präoxygenierter Lagerungslösung bei Raumtemperatur aufbewahren.Beladen Sie die LV-Kardiomyozyten nun mit zwei Mikromolar Acetoxymethylester Fura-2AM. Zentrifugieren Sie ein Milliliter der Kardiomyozytensuspension für 10 Sekunden. Danach entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren das Kardiomyozyten-Pellet in ein Milliliter Tyrode-Lösung mit geringer Kalziumkonzentration.Fügen Sie anschließend Fura-2AM und zwei µL Poloxamer 407 zu den Myozyten hinzu. Verteilen Sie die Myozytensuspension vorsichtig und lassen Sie die Mischung 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Zentrifugieren Sie die Mischung danach fünf Sekunden lang.Entfernen Sie den Überstand und dispergieren Sie das Myozyten-Pellet in einem Milliliter Perfusionslösung, die 500 Mikromolar Calcium enthält. Nach 10 Minuten zentrifugieren Sie die Mischung fünf Sekunden lang und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie anschließend frische Perfusionslösung hinzu und bewahren Sie das mit Fura-2AM beladene Myozyten-Pellet zur Aufnahme von Messdaten in dieser Lösung auf.Füllen Sie vor der Aufnahme die Perfusionsleitung, die durch eine Wasserjacke verläuft, mit der Tyrode-Lösung bei 36 Grad Celsius. Anschließend geben Sie einige Tropfen der mit Fura-2AM beladenen LV-Myozytensuspension in die Kammer eines umgekehrten Fluoreszenzmikroskops und warten fünf bis acht Minuten. Perfundieren Sie langsam mit der Tyrode-Lösung bei 2,2 Milliliter pro Minute.Drücken Sie dann die Starttaste am Bedienfeld des digitalen Stimulators, um die Feldstimulation mit zwei Hertz zu beginnen. Wählen Sie die Myozyten aus, die stabil kontrahieren, um sie aufzuzeichnen. Gezeigt sind hier die Rohdaten der Sarkomer-Kurzungs- und Fura-2-Verhältnismessung in LV-Myozyten von Sham- und hypertensiven Ratten.Hier sind die durchschnittlichen Kurvenverläufe der Sarkomerlänge und der Fura-2-Signale. Und hier sind die Phasenebenen-Diagramme des Fura-2-Verhältnisses in Abhängigkeit von der Sarkomerlänge in den beiden Gruppen. Die Trajektorienkurve ist nach rechts verschoben, und der EC50-Wert ist bei Hypertonie tendenziell höher, was auf eine Kalzium-Desensibilisierung der Myofilamente hindeutet.Bevor Sie dieses Verfahren durchführen, ist es wichtig, daran zu denken, das Cortium, die isolierten Myozyten, zu testen, indem Sie die Myozytenkontraktion ohne Beladung mit Fura-2AM detektieren. Außerdem sollten Sie stets die Myozytenkontraktion nach der Beladung mit Fura-2AM überprüfen, um eine Überlastung zu vermeiden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Patch-Clamp-Techniken durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten.Beispielsweise spielt die Aktivität von Calciumkanälen des Typs A, also im übertragenen Sinne die Erregungs-Kontraktions-Kopplung des Myozyten, eine wichtige Rolle. Durch die Entwicklung dieser Technik wurde zukünftigen Forschern auf dem Gebiet der Herzphysiologie der Weg geebnet, tiefere Einblicke in Herzerkrankungen beim Menschen zu gewinnen. Nach routinemäßiger Erfahrung sollten Sie ein gutes Verständnis dafür entwickelt haben, wie die Calciumkanalaktivität der Myofilamente analysiert wird.Um die Mechanismen, die die Herzanregungs-Kontraktions-Kopplung in gesunden und erkrankten Herzen vermitteln, besser zu verstehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Murine linksventrikulären Papillarmuskeln können verwendet werden, um Herzkontraktilität in vitro untersucht werden. Dieser Artikel beschreibt im Detail die Isolierung und experimentelle Protokolle, um die Herzkontraktionseigenschaften zu studieren.

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Dieser Artikel beschreibt das detaillierte Protokoll und Anlagen für die duale optische Abbildung von Transmembranpotential (V m) und freie inner Retikulum (SR) notwendig Ca 2+ in der Langendorff-perfundierten Kaninchenherzen. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung von V m und SR Ca 2+ Dynamik im intakten Herzens.

Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Und Transmembranpotential in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Schritt für Schritt die Technik der Extraktion und Bewertung der Herzfunktion mit enthäuten Kardiomyozyten zu beschreiben. Diese Methode ermöglicht die Messung und akute Modulation der Myofilament-Funktion mit kleinen gefrorenen Biopsien, die von verschiedenen Herzstellen, von Mäusen bis zu Männern, gesammelt werden können.

In Vitro-Bewertung der Herzfunktion mit gehäuteten Kardiomyozyten

Wir präsentieren ein Protokoll zur Bewertung der elektromechanischen Wirkungen der GtACR1-Aktivierung in Kaninchen-Kardiomyozyten. Wir bieten detaillierte Informationen über Zellisolation, Kultivierung und adenovirale Transduktion sowie über funktionelle Experimente mit den Patch-Clamp- und Carbonfaser-Techniken.

Elektromechanische Bewertung der optogenetisch modulierten Kardiomyozytenaktivität

Hier wird ein Protokoll zur Bewertung der kontraktilen Eigenschaften von gestreiften Muskelmyofibrils mit Nano-Newton-Auflösung vorgestellt. Das Protokoll verwendet ein Setup mit einer Interferometrie-basierten optischen Kraftsonde. Dieses Setup erzeugt Daten mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglicht die Beurteilung der kontraktilen Kinetik von Myofibrils.

Isolieren von Myofibrils von Skelettmuskelbiopsien und Bestimmung der Kontraktilenfunktion mit einem Nano-Newton Resolution Force Transducer

Dieses Protokoll präsentiert eine Sammlung von Sarkomer-, Kalzium- und makroskopischen geometrischen Daten aus einer aktiv kontrahierenden Herztrabekula ex vivo. Diese simultanen Messungen werden durch die Integration von drei Bildgebungsmodalitäten ermöglicht.

Simultane Hellfeld-, Fluoreszenz- und optische Kohärenztomographische Bildgebung kontrahierender Herztrabekel Ex Vivo

Es wird eine Reihe von Protokollen vorgestellt, die die Messung der kontraktilen Funktion mittels Sarkomerlängendetektion zusammen mit der transienten Messung von Kalzium (Ca2+) in isolierten Rattenmyozyten beschreiben. Die Anwendung dieses Ansatzes für Studien in Tiermodellen der Herzinsuffizienz ist ebenfalls enthalten.

Analyse der kardialen kontraktilen Dysfunktion und Ca2+ Transienten in Nagetiermyozyten

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Kontraktilität in adulten humanen primären Kardiomyozyten aus Spenderherzen mit dem MyoBLAZER-System gemessen werden kann, einer zuverlässigen Plattform zur Beurteilung arzneimittelinduzierter Veränderungen der Kontraktilität während der präklinischen Entwicklung.

Messung der Herzkontraktilität in isolierten adulten humanen primären Kardiomyozyten

Die funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie ist eine Methode zur Untersuchung von Proteindomänenbewegungen in Echtzeit. Die Modifikation dieser Technik für ihre Anwendung in nativen Zellen ermöglicht nun die Detektion und Verfolgung einzelner Spannungssensorbewegungen von spannungsabhängigen Ca2+ -Kanälen in murinen isolierten Skelettmuskelfasern.

Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur

Erfahren Sie die Bewertung der Myofilament-Ca²⁺-Empfindlichkeit in isolierten Herzmuskelzellen mittels Fura-2-AM und Sarkomerlängenmessung. Diese Methode ermöglicht die Analyse der elektromechanischen Kopplung bei Herzinsuffizienz und Hypertonie.

Beurteilung der myofilament Ca

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