Name: Adenoviralen Gentherapie für diabetische Keratopathie: Auswirkungen auf die Wundheilung und Zellmarker Expression in Human Organ kultivierten Hornhäute und Limbale Epithelial Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Erfahren Sie, wie adenovirale Gentherapie die verzögerte Wundheilung bei diabetischen Hornhäuten normalisiert und die Expression epithelialer Stammzellmarker in menschlichen Organkulturen wiederherstellt.

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Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), den CTSI-Zuschuss UL 1RR033176 (AVL) und Zuschüsse des Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.

Nationale Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) geliefert Zustimmung post-mortem gesunden und diabetischen menschlichen Augen und Augenhornhaut. NDRI des menschlichen Gewebes Sammlung Protokoll wird durch den Führungsausschuss und nach National Institutes of Health Aufsicht genehmigt. Diese Forschung wurde im Rahmen der genehmigten Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review Board (IRB) befreit Protokoll EX-1055 durchgeführt. Collaborating Hornhautchirurgen, Drs. E. Maguen und Y. Rabinowitz, geliefert Verwerfungs korneoskleralen Felgen für die Isolierung von Stammzell-angereichertem Hornhautepithels Kulturen. Diese Forschung wurde im Rahmen der genehmigten IRB-Protokoll Pro00019393 durchgeführt. 1. Die menschliche Hornhautorgankultur Hinweis: Normal und diabetischer Cornea oder ganze Augen werden in gekühlten Cornea - Speichermedium erhalten (zB Optisol GS) innerhalb von 48 Stunden nach dem Tod von der nationalen Anbieter NDRI. <ol><li> Entfernen Sie die Cornea aus Containerlager mit einer Pinzette und waschen Sie sie zweimal in das Antibiotikum-Antimykotikum (ABAM) Mischung. Bei ganzen Augen, schneiden Sie die Cornea aus den Kugeln mit einer gebogenen Schere. Lassen Sie mindestens 5 mm konjunktivaler Felge und auch die Cornea in ABAM waschen. </li><li> Bereiten Sie die Mischung in der Hornhaut Konkavität angeordnet werden. Es besteht aus serumfreiem essentiellem Minimalmedium (MEM), enthaltend ABAM, 1 mg / ml Kalbshaut-Kollagen (aus einer Stammlösung von 10 mg / ml in 0,1 N Essigsäure hergestellt), 1% Agar, und Insulin-Transferrin-Selenit Ergänzung 7. </li><li> Mikrowellen diese Mischung für die Sterilisation und Agar Auflösung zum Sieden. Es kann bis zu 1 Minute dauern, alles zu lösen. Lassen Sie die Rohrkappe teilweise offen, weil die Mischung leicht überläuft, wenn es kocht. Aus diesem Grund können mehrere siedendem Zyklen benötigt werden, die jeweils für 10-15 sec. Abkühlen der Mischung auf 37-39 ° C. </li><li> Legen Sie die Cornea epithelialen Seite nach unten in sterile 60-mm-Schalen. Füllen Sie die Hornhaut Höhlung mit etwa 0,5 ml der Mischung in 1.2 beschrieben. DasMischung verfestigt sich auf die Hornhaut innerhalb von 2 min. </li><li> Legen Sie die Cornea - Agar - Seite nach unten in sterile 60-mm - Schalen und fügen Sie den vollständigen Medium , das MEM mit ABAM und Insulin-Transferrin-Selenit Ergänzung 7 (37 ° C) zu halten sein Niveau in etwa auf dem Limbus für Luft-Flüssigkeit - Grenzfläche Kultur. Das Medium Volumen 7-8 ml pro Schale. </li><li> Die Schalen werden mit den Hornhäuten in einem 5% CO 2 Inkubator mit einer Wasserwanne befeuchtete (diese Weise Feuchtigkeit auf oder über 95% gehalten) bei 35 ° C (normale Hornhauttemperatur). 100 l Medium (zwei Tropfen) täglich auf dem Epithel der Hornhaut zu befeuchten. </li><li> Überwachen Sie die Hornhautmorphologie und die epitheliale die Lebensfähigkeit der Zellen mikroskopisch unter Durchlicht ein Standardmikroskop mit einem 4X-Objektiven verwendet. Tun Sie dies einmal pro Tag. </li><li> Ändern Sie das Medium alle drei Tage. Die Cornea kann für mindestens 3 Wochen kultiviert werden. Für die Gentherapie Experimente, Kultur die Hornhäute für 3-5 Tage, dann TRANSDUCe mit Genen von Interesse (4,1-4,4), lassen für weitere 3-5 Tage auf dem Transgen und unterliegt dem Protokoll Wundheilung abhängig (2,1-2,4). </li></ol> 2. Epithelial Wundheilung Anmerkung: In den diabetischen Cornea, die epitheliale Debridement durch mechanisches Abkratzen nicht möglich ist, da die zerbrechliche Epithelbasalmembran in dem Prozess abgetrennt wird, das nicht in den normalen Cornea geschieht. Somit sind die normalen und diabetischen Cornea unter ähnlichen Bedingungen der Wundheilung zu halten, chemische Entfernung des Epithels mit n-Heptanol 19 verwendet. Dieses Verfahren entfernt das Epithel, aber hinterlässt eine intakte Basalmembran in den normalen und diabetischen Augenhornhaut. <ol><li> Zentrale epithelialen debridement 20, legen Sie einen 5 mm Filterpapierscheibe in n-Heptanol auf der zentralen Hornhautvorderfläche 75 Sekunden lang getränkt auszuführen. </li><li> Entfernen Sie den Filter und waschen Sie die Cornea in voller Medium. Füllen Sie die Vertiefung mit 0,5 ml Agar-KollagenMischung und Kultur wie in 1.4. Nach Debridement sterben die Epithelzellen in der Regel und abzustreifen Zurücklassung mikroskopisch intakten Basalmembran 7. </li><li> Verwenden Sie 8,5 mm Scheiben größeren epitheliale Wunden in den Experimenten zu schaffen, mit nur Limbus Gentherapie. Dadurch wird die Einbindung der Limbus-Stammzellen in den Heilungsprozess zu gewährleisten. </li><li> Überwachen Sie die Hornhautheilung mikroskopisch. Machen Sie Fotos mit 4x und 10x täglich, bis der Epitheldefekt vollständig geheilt ist. Der Heilungsprozess kann von 2 bis 15 Tage dauern, je nach Zustand (normal oder Diabetiker) und Wundgröße. Hinweis: Während des Heilungsprozesses, schwarze Spinne-ähnliche Zellen werden am oberen Brennebene beobachtet. Diese Zellen sind apoptotische Stromatumoren Keratozyten , die nach der epithelialen Entfernung 4 starben. Die Heilung wird bestimmt , vollständig zu sein , wenn diese toten Zellen überwuchert von der Heilung Epithel sind und nicht mehr sichtbar sind (Abbildung 2, Einschub). </li><li> Nach der HeilungAbschluss, schneiden Sie die Cornea in der Hälfte, betten sie in OCT - Verbindung und Verfahren zur indirekten Immun auf Cryostatschnitten oder für Western - Blots 16,21. </li></ol> 3. Isolierung von Limbale Zellen und Pflege von Stammzell-angereichertem Kulturen Hinweis: Bereiten Sie den primären Limbus epithelialen Stammzellen (LESC) angereicherter Kulturen von den korneoskleralen Felgen. Die Felgen kommen von gesunden Spendern und verworfen nach Hornhauttransplantationen aus der Zusammenarbeit Chirurgen in der Standard - Cornea - Speichermedium (zB Optisol) empfangen werden. Ansonsten können die LESC angereicherten Kulturen von den Felgen von normalen und diabetischen ganze Hornhaut exzidiert erhalten werden oder Globen von NDRI in der Hornhautspeichermedium empfangen wird. <ol><li> Wenn die ganze Hornhaut oder Kugeln verwendet werden, zuerst die Limbus-Bereiche zu isolieren. Um dies zu tun, legen Sie die Hornhaut auf einer sterilen Plastikschale mit epithelialen Seite nach oben und entfernen Sie den zentralen Bereich mit einem 9-mm Trephine (Kreishornhautmesser).Entsorgen Sie diesen zentralen Teil. Dann auszuschneiden die Limbuszone einen 13 mm trephine verwenden und den äußeren konjunktivaler Teil verwerfen. Zur Isolierung Zellen verwenden, um die Bagel-like Limbus Felge. Vor der Zellisolierung, entfernen Sie die Endothelzellen und anhaftende Reste der Iris von der Innenseite der Hornhaut gegenüber der Oberfläche Epithel mit einem sterilen Wattestäbchen. </li><li> Isolieren Limbus Zellschichten mit Dispase Behandlung. Inkubieren jeder korneoskleralen Felge mit 2,4 U / ml Dispase II in 1,5 ml Keratinozyten serumfreiem Medium (KSFM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C für 2 Stunden 22 ergänzt. </li><li> Sanft Leichtigkeit der Felge unter einem Sezieren Stereomikroskop mit einer Pinzette die Limbus-epithelialen Zellschicht ab und die Zellen in 1 ml 0,25% Trypsin distanziere - 0,02% EDTA-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Zellen in 10 ml Medium (zB Epilife) und pelletieren sie bei 300 xg in einer Tischzentrifuge für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> resuspendieren the Zellen in Kulturmedium: Medium mit N2, B27 und menschliches Wachstums Keratinozyten Ergänzungen und 10 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF). </li><li> Samen der Zellen bei 3.000-5.000 Zellen / ml in Fläschchen oder 60 mm - Schalen überzogen mit einem Gemisch aus humanen Basalmembranproteine ​​einschließlich Fibronectin, Typ IV Collagen und Laminin (FCL) bei 0,5-1 &amp; mgr; g / cm 2, in der KSFM Mittel. </li><li> Kultur der Zellen in einem befeuchteten (95% oder höherer Luftfeuchtigkeit) CO 2 Inkubator bei 37 ° C , bis sie bilden vollständig konfluenten Monolayern. Dies kann 1-2 Wochen dauern. Hinweis: Sie regelmäßig die Zellidentität durch positive immunzytochemische Färbung bestätigen für mutmaßliche LESC Marker einschließlich PAX6, Keratin (K) 14, K15, K17 und ΔNp63α. Die Färbung Details einschließlich der primären Antikörper wurden 8,16-18,22 veröffentlicht. </li><li> In den Durchgang der konfluenten Zellen, behandeln sie mit 1 ml 0,05% Trypsin-Lösung (1: 5 Verdünnung der 0,25% ige Lösung) für 10 min bei 37 ° C. 5 ml Soja trypsin Inhibitorlösung (10 mg / ml), verdünnt 1: 4 in einem Medium und Zentrifugation der Zellen, wie in 3.5. </li><li> Wasche das Zellpellet in 3 ml verdünnter Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor-Lösung. Platte der Zellen auf FCL-beschichteten (siehe 3.7) Gerichte oder Glaskammer gleitet auf 2 x 10 4 Zellen / ml. </li></ol> 4. adenovirale Transduktion von Orgel-kultivierten Hornhäute Hinweis: Die rekombinanten Adenoviren (AV) umfassen AV-Vektor (kein Gen eingefügt), AV-CMET (mit c-Met - Gen offene Leserahmen), AV-shM10 (mit shRNA zu MMP-10) und AV-SHCF ( mit shRNA zu Cathepsin F). Sie sind E1 / E3-deletierten Typ 5 AV-Gene unter der Kontrolle des Major Immediate Early-Cytomegalovirus-Promotor exprimiert. Die AV-CMET Viren werden mit AV - Vektor - Auflage- / CMV / V5-DEST 16 erzeugt. Die AV-shRNA-Viren sind speziell durch Subklonierung von shRNA-Sequenzen zusammen mit hH1 Promotor und GFP-Tag-Sequenz von iLenti-EGFP Vektor in eine vermehrungsunfähige (-E1 / -E3) huma erzeugtn AV - Typ - 5 - Genom mit Adeno-4 - Expressionssystem 17. <ol><li> Transduzieren ein organ kultiviert Hornhaut eines jeden Paares mit AV Vektor und ein anderes Hornhaut, mit einem Gen-Expression-modulierenden AV. Verwenden , um die AV-CMET bei 0,8 bis 1,25 x 10 8 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) pro Cornea in Kulturmedium für 48 Stunden bei 37 ° C die Kornea unter der Oberfläche des Mediums zu halten jeweils in eine Vertiefung einer Schale mit 24 Vertiefungen. Verwenden Sie die AV-shRNA - Viren bei 1-2 x 10 8 pfu pro Hornhaut. </li><li> Verwenden Sie die Viren für die Transduktion in voller Medium, das mit 75 ug / ml Sildenafil Citrat. Dieses Reagenz aktiviert die Caveolin Transport 21 viral Aufnahme durch die Epithelzellen zu ermöglichen. Aufgrund später kurze Halbwertszeit von Sildenafil in wässrigen Lösungen, erneut hinzufügen die gleiche Menge auf das Medium 4-5 Std. Die Standardbehandlung ist für 48 Stunden. </li><li> Übertragen Cornea zu neuen Gerichten mit einem runden Ende sterilen Spatel und Kultur im Medium ohne AV den mittleren Pegel am Limbus zu halten. Nach dem Additional 4-8 Tage an der Flüssigkeit-Luft-Grenzfläche, verarbeiten die AV-behandelten Hornhäute für verschiedene Analysen oder Tests für epitheliale Wundheilung (siehe oben). Befeuchten Sie regelmäßig die Hornhaut während der Kultur von 100 ul Medium Zugabe (zwei Tropfen) auf der Hornhaut. </li><li> Für die Transduktion der Limbus-Zellen nur inkubieren die Viren mit den Cornea an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche mit mittlerem Pegel am Limbus, Transduktion des zentralen Epithel zu vermeiden. </li></ol> 5. adenovirale Transduktion von Cultured Limbale Zellen <ol><li> Pflegen Sie die LESC angereicherten Kulturen im Medium mit 10 ng / ml EGF (siehe 3.5) auf Plastikschalen mit dem FCL Mischung beschichtet mit 0,5 g / cm 2. </li><li> Transduzieren kultivierten Zellen, die 70-80% Konfluenz mit dem AV erreicht haben, das grün fluoreszierende Protein-Gen (AV-GFP) oder den AV-verschlüsselten shRNA-GFP in einem Bereich von Multiplizität der Infektion (MOI: 1-300 pfu / Zelle) beherbergen im Medium mit 2 ng / ml EGF. Führen Sie die transduction für 4 h bei 37 ° C in einem minimalen Volumen (0,2 ml), gefolgt von 20 Stunden in 0,5 ml Medium. Der Caveolin Transport Aktivator Sildenafil ist nicht für die Zellkultur Transduktion benötigt. </li><li> Verwenden eines der folgenden Reagentien, die die AV-Bindung an der Zelloberfläche ermöglichen die AV Transduktionseffizienz zu erhöhen: entweder Polykationen (1 ug / ml poly-L-Lysin oder 5 &amp; mgr; g / ml Polybren) oder 6 &amp; mgr; l / ml Transduktion Reagenz ( Beispiel ViraDuctin) oder 20 &amp; mgr; l / ml Transduktion Enhancer (zB ibiBoost). </li><li> Nach dem Austausch des Mediums für das eine ohne das AV inkubieren gezüchteten Zellen für 4 Tage in der befeuchteten CO 2 -Inkubator und GFP - Expressionsniveau mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. </li><li> Verwenden Sie die Kratzer Wundheilung Assay Zellmigration in den AV-transduzierten Kulturen zu bewerten. Wachsen die Zellen in den Multi-Well-Kammer gleitet. Nehmen Sie die Wunden in einer Monoschicht von Zellen in einer geraden linearen Bewegung mit einer 200 &amp; mgr; l pi KratzenPette Spitze. Nach der Verwundung, ändern Sie das Medium für ein frisches der abgelösten Zellen zu entfernen. </li><li> Fotografieren Sie jeden Tag die Wunden mit einer Digitalkamera auf einem inversen Mikroskop befestigt mit 4-facher Vergrößerung. die Zeit aufzeichnen, wenn die Heilung abgeschlossen ist (die Wundränder in Berührung kommen, entlang der gesamten Wunde). </li></ol>

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<li>Saika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+p38+MAP+kinase+in+regulation+of+cell+migration+and+proliferation+in+healing+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären keine finanziellen Interessen.

Die Hornhaut wird aufgrund seiner Oberflächenstelle ein ideales Gewebe für die Gentherapie, wo die Genübertragung, sowie die Bewertung der Wirksamkeit und Nebenwirkungen, einfach sind. Allerdings ist eine klinische Umsetzung dieser leistungsstarken Ansatz immer noch langsam aufgrund knappen Informationen über die genetischen Ursachen der Erkrankungen der Hornhaut und der Gentherapie Targets 24. Diabetische Komplikationen Hornhautveränderungen einschließlich können in der Natur weitgehend epigenetische sein, d...

Die diabetische Hornhauterkrankung führt vor allem zu degenerativen epithelialen (Keratitis) und Nerven (Neuropathie) ändert. Es wird oft von den Anomalien der epithelialen Wundheilung und Hornhautnerven Reduktion 1-4 manifestiert. Schätzungsweise 60-70% Diabetiker haben verschiedene Hornhautprobleme 1,3. Unsere Studien haben mehrere Markerproteine ​​mit veränderten Expression in humanen diabetischen Augenhornhaut einschließlich der Herunterregulation von c-met-Protoonkogen (Hepatozyten - Wachstumsfaktor - Rezeptor) und die Aufregulation der Matrix - Metalloproteinase-10 (MMP-10) und Cathepsin F 5, identifiziert 6. wir haben auch deutlich verringerte Expression von mehreren putative epitheliale Stammzellmarkern in den humanen diabetischen Cornea dokumentiert. In den früheren Studien haben wir ein adenovirales basierten Gentherapie zur Normalisierung der Pegel von Diabetes-altered Markern unter Verwendung von humanen diabetische korneale Organkultursystem entwickelt, das langsame Wundheilung zeigt, diabetischeMarker Änderungen und die Expression Zellmarker Reduktion Stammzellen ähnlich wie die ex vivo Cornea 7,8. Diese Persistenz der Änderungen angezeigt 9 aufgrund der Existenz von epigenetischen metabolischen Speicher sein. Dieses Kultursystem wurde weiter verwendet für die Gentherapie. Die Ziele für diese Therapie wurden entweder mit reduzierter Expression bei diabetischen Cornea (c-met proto-Onkogen) oder erhöhte Expression (MMP-10 und Cathepsin F) aus Markern ausgewählt. Das Adenovirus (AV) Therapie wurde in den gesamten Orgel kultivierten Cornea oder der korneoskleralen peripheren Limbus Raum nur verwendet. Dieses Fach beherbergt Stammzellen epithelialen, die das Hornhautepithel erneuern und sich aktiv an der Wunde 4,10-15 Heilung teilnehmen. Hier Protokolle werden für normalen und diabetischen menschlichen Cornea-Organkultur, epitheliale Wundheilung, Isolierung und Charakterisierung von Stammzellen angereicherte Limbus Zellkulturen und adenoviralen Zelle und korneale Transduktion vorgesehen. UnserErgebnisse zeigen die Machbarkeit dieser Therapie für Markerexpression zu normalisieren und bei diabetischen Cornea für mögliche künftige Transplantation Wundheilung. Sie legen auch nahe , dass die Kombinationstherapie die wirksamste Weg ist , 16-18 normalen Markierungsmuster und Epithelheilung in der diabetischen Cornea wiederherzustellen.

<table><tbody><tr><td>Minimum essentielles Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>Optisol-GS&nbsp;</td><td>Bausch & Lomb</td><td>50006-OPT</td><td></td></tr><tr><td>ABAM Antibiotikum-Antimykotikum-Gemisch</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen aus Kalbshaut&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>Agar, Gewebekulturqualität</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>n-Heptanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>72954-5ML-F</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Mischung&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Vertrieb II&nbsp;</td><td>Roche Applied Science</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>keratinozyten-serumfreies Medium (KSFM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>EpiLife Medium mit Calcium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MEPI500CA</td><td></td></tr><tr><td>N2 Medium Supplement, 100x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Medium Supplement, 50x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Human Keratinozyten Wachstumssupplement, 100x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-001-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0,25 % - EDTA 0,02 % mit Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0,25 % mit Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15050065</td><td></td></tr><tr><td>Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T6414</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenit-Ergänzung (ITS)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>I3146-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper gegen Keratin 14</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53253</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper gegen Keratin 15</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47697</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper gegen Keratin 17</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-58726</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper gegen &Delta; Np63&alpha;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8609</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper gegen PAX6</td><td>BioLegend</td><td>PRB-278P-100</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper gegen Nidogen-1</td><td>R& D Systems</td><td>MAB2570</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper gegen Integrin & Alpha; 3&Beta; 1</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1992</td><td></td></tr><tr><td>humanes Fibronektin</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>humanes Laminin</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L4445</td><td></td></tr><tr><td>humanes Kollagen Typ IV</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>C6745-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus, das MMP-10 shRNA exprimiert</td>, <td>Capital BioSciences</td>, <td>kundenspezifisches</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus, das Cathepsin exprimiert, F shRNA</td>, <td>Capital BioSciences</td><td>, kundenspezifisches</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus, das verschlüsselte shRNA exprimiert, und GFP</td><td>Capital BioSciences</td>, <td>maßgeschneidertes</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus, das c-met</td><td>OriGene (Plasmid)</td> exprimiert <td>SC323278</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus, das GFP</td><td>KeraFAST</td><td>FVQ002</td><td></td></tr><tr><td>Sildenafilcitrat exprimiert, 25 mg</td><td>Pfizer</td><td>aus der Apotheke</td><td></td></tr><tr><td>epidermaler Wachstumsfaktor&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Polybren</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>ViraDuctin</td><td>Cell Biolabs</td><td>AD-200</td><td></td></tr><tr><td>ibiBoost</td><td>ibidi, Deutschland</td><td>50301</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Corning Spachtel mit rundem Ende&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petrischalen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>174888</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Multiwell-Kammer-Objektträger&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6807</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Pipettenspitzen</td><td>Bioexpress</td><td>P-1233-200</td><td>andere Hersteller verfügbar</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Diaphot</td><td>andere Hersteller/Modelle</td></tr><tr><td>verfügbar befeuchteter CO2 Inkubator&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>370 (Steri-Cycle)</td><td>weitere Lieferanten/Modelle verfügbar</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus, Japan</td><td>BX-40</td><td>andere Hersteller/Modelle verfügbar</td></tr><tr><td>Präparier-Stereomikroskop</td><td>Leica, Deutschland</td><td>S4 E</td><td>andere Lieferanten/Modelle verfügbar</td></tr></tbody></table>

adenoviralen gentherapie für diabetische keratopathie: auswirkungen auf die wundheilung und zellmarker expression in human organ kultivierten hornhäute und limbale epithelial stammzellen

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

Das Ziel dieses Protokolls ist molekularen Veränderungen in humanen diabetischen Cornea zu beschreiben und zu zeigen, wie sie durch adenovirale Gentherapie in organ kultivierten Hornhaut gelindert werden. Die diabetische Hornhauterkrankung ist eine Komplikation des Diabetes mit häufigen Störungen der Hornhautnerven und epitheliale Wundheilung. Wir haben auch signifikant verändert Expression mehrerer putative epitheliale Stammzellmarkern in humanen diabetischen Cornea dokumentiert. Um diese Änderungen, adenovirale Gentherapie lindern wurde erfolgreich die Hochregulation von c-met proto-Onkogen-Expression durchgeführt und / oder das Herunterregulieren von Proteinasen Matrix-Metalloproteinase-10 (MMP-10) und Cathepsin F. beschleunigte Heilung dieser Therapie bei diabetischen Cornea gewickelt selbst dann, wenn nur der Limbus-Stammzellen-Kompartiment wurde transduziert. Die besten Ergebnisse wurden mit einer kombinierten Behandlung erhalten. Für mögliche Patienten Transplantation von normalisierten Stammzellen ist ein Beispiel auch der optimizati vorgestelltauf der Gen-Transduktion in Stammzell-angereichertem Kulturen unter Verwendung von polykationischen Verstärker. Dieser Ansatz kann nützlich sein, nicht nur für die ausgewählten Gene sondern auch für die anderen Mediatoren von cornealen epithelialen Wundheilung und Zellfunktion stammen.

Wir haben , daß die Unterschiede in der Expression von diabetischer Marker (zB Basalmembranproteine ​​und Integrin α3β1) und Wundheilung zwischen den normalen und diabetischen Hornhäute werden erhalten in den Hornhautorgankulturen zuvor gezeigt. Dieses Kultursystem wurde gerichtet auf die Gentherapie unterzogen, um die Niveaus von diabetes-altered Marker Normalisierung, c-Met, MMP-10 und Cathepsin F. Wenn das gesamte ...

Ein Beispiel für eine adenovirale Gentherapie bei menschlichen diabetischen Organkulturen wird vorgestellt, um die verzögerte Wundheilung und die deutlich reduzierte Expression von epithelialen Stammzellmarkern in diesen Hornhäuten zu normalisieren. Es wird auch die Optimierung dieses Prozesses in stammzellangereicherten limbalen Epithelkulturen beschrieben.

Adenoviralen Gentherapie für diabetische Keratopathie: Auswirkungen auf die Wundheilung und Zellmarker Expression in Human Organ kultivierten Hornhäute und Limbale Epithelial Stammzellen

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls besteht darin, molekulare Veränderungen in menschlichen diabetischen Hornhäuten zu beschreiben und zu demonstrieren, wie diese durch eine adenovirale Gentherapie in organkultivierten Hornhäuten gemindert werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der diabetischen Hornhaut zu beantworten, beispielsweise welche molekularen Veränderungen einer verzögerten epithelialen Wundheilung beim Diabetes zugrunde liegen und einer abnormalen Expression epithelialer SEM-SEM-Moleküle. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Untersuchung von Gentherapieansätzen ermöglicht, die auf verschiedene Mediatoren der epithelialen Hornhaut-Wundheilung und der Stammzellfunktion in organkultivierten Hornhäuten abzielen.Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie anderer Hornhauterkrankungen, die mit einer Stammzellfunktionsstörung zusammenhängen, da wir die Gültigkeit der Methode zur Normalisierung ultradiabetischer Hornhautstammzellen gezeigt haben. Legen Sie die Hornhäute epiteliale Seite nach unten in sterile 60-Millimeter-Dishs und füllen Sie die Vertiefung mit 0,5 Millilitern Agar-Kollagen-Mis

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Diese Operationstechnik veranschaulicht die Injektion von Gentherapie-Vektoren und Stammzellen in den subretinalen Raum des Auges Maus.

Subretinalen Injektion von Vektoren für die Gentherapie und Stammzellen in die Maus Eye

Wir beschreiben hepatische neo-Inselzellen Formation in STZ (Streptozotocin)-induzierte diabetische Mäuse durch Gentransfer von Neurogenin3 (Ngn3) und Betacellulin (BTC) Verwendung von Helfer-abhängigen Adenovirus-Vektor (HDAd) und der Umkehrung von Hyperglykämie. Unsere Methode nutzt die Vorteile von Helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren mit ihren hocheffizienten in vivo Transduktion und der lang anhaltende Genexpression.

Neo-Islet Formation in Leber der diabetischen Mäuse von Helper-abhängigen Adenovirus-Vektor-vermittelten Gentransfer

Die subretinale Injektion ist eine chirurgische Technik zur effektiven Genabgabe an das retinale Pigmentepithel im Mausauge.  Hier beschreiben wir eine einfache und replizierbare Methode zur subretinalen Injektion von viralen Vektoren in retinales Pigmentepithel bei Versuchsmäusen.

Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel

Der folgende Artikel stellt eine einfache und reproduzierbare Technik effektiv zu einer nachhaltigen Mausmodell der Limbusstammzellinsuffizienzen (LSCD) erstellen. Dieses Tiermodell ist nützlich bei der Prüfung und die Wirksamkeit von Behandlungen für Limbus-Stammzellen Krankheiten verglichen.

Eine einfache mechanische Verfahren Limbusstammzellinsuffizienzen in der Maus zum Erstellen

Ein Protokoll für eine Ex Vivo Hornhaut Orgel Kulturmodells nützlich für Wundheilung Studien beschrieben wird. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Agenten, regenerative Heilung zu fördern oder Medikamententoxizität in einer organisierten mehrzelligen 3D-Umgebung.

Ex Vivo Wundheilung Hornhaut Orgel Kulturmodells für Studien

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Pathophysiologie der proliferativen diabetischen Retinopathie mit Patienten abgeleitet, chirurgisch herausgeschnitten, fibrovaskulärem Gewebe für dreidimensionale nativen Gewebe Charakterisierung und Ex-Vivo-Kultur zu studieren. Diese ex-Vivo-Kultur-Modell ist auch für Tests oder Entwicklung neuer Behandlungsmethoden.

Ein Ex-Vivo-Gewebekultur-Modell für fibrovaskulärem Komplikationen bei proliferativer diabetischer Retinopathie

Descemet's Stripping Only ist ein experimentelles Verfahren, bei dem Patienten mit zentralen Hornhautguttae, die aus Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy resultieren, Descemets Membran für periphere Zellen abgestreift haben, um die Endothelschicht zu regenerieren. Wir stellen eine neuartige Methodik vor, die DSO in dystrophischen menschlichen Hornhäuten ex vivo mit beschleunigter Heilung simuliert, die durch eFGF1 (NM141) stimuliert wird.

Ein menschliches Hornhautorgan-Kulturmodell des Descemet-Strippings nur mit beschleunigter Heilung, stimuliert durch den künstlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1

In diesem Manuskript wird die subkonjunktivale Injektion als gültige Vektorabgabemethode für Augengewebe bei Mäusen unter Verwendung eines Injektionssystems demonstriert, das aus einer Infusions-/Entnahmespritzenpumpe und einer gasdichten herausnehmbaren Spritze in Verbindung mit Mikroinjektionsnadeln besteht. Dieses Injektionssystem ist auch für andere intraokulare Verabreichungswege anpassbar.

Subkonjunktivale Verabreichung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Kleintiermodellen

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Präparation von post-kryokonservierten hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen und die subretinale Verabreichung dieser Zellen in rd10-Mäusen .

Subretinale Verabreichung von Photorezeptor-Vorläuferzellen aus humanen embryonalen Stammzellen in rd10-Mäusen

Hier schlagen wir drei verschiedene Methoden vor, um die sensorischen Fasern, die die Hornhaut innervieren, zu schädigen. Diese Methoden erleichtern die Untersuchung der Axonregeneration bei Mäusen. Diese drei Methoden, die auf andere Tiermodelle adaptierbar sind, sind ideal für die Untersuchung der Physiologie und Regeneration der Hornhautinnervation.

Drei Strategien zur Induktion von neurotropher Keratitis und Nervenregeneration in der murinen Hornhaut

Die ex vivo-Organkultur der Schweinehornhaut und die epitheliale Wundheilung bieten ein wirtschaftliches, ethisches, reproduzierbares und quantitatives Mittel zur Prüfung der Augentoxizität von Chemikalien. Sie helfen auch bei der Aufklärung von Mechanismen, die der Regulation der Epithelisierung und Gewebereparatur zugrunde liegen, sowie bei der Bewertung von Therapeutika zur Behandlung von diabetischer Keratopathie und verzögerter Wundheilung.

Bewertung der therapeutischen und chemischen Toxizität anhand von organgezüchteten Schweinehornhäuten und der Heilung von Epithelwunden

Erfahren Sie, wie adenovirale Gentherapie die verzögerte Wundheilung bei diabetischen Hornhäuten normalisiert und die Expression epithelialer Stammzellmarker in menschlichen Organkulturen wiederherstellt.

Adenoviralen Gentherapie für diabetische Keratopathie: Auswirkungen auf die Wundheilung und Zellmarker Expression in Human Organ kultivierten Hornhäute und Limbale Epithelial Stammzellen (Video) | JoVE Journal

Adenoviralen Gentherapie für diabetische Keratopathie: Auswirkungen auf die Wundheilung und Zellmarker Expression in Human Organ kultivierten Hornhäute und Limbale Epithelial Stammzellen

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