Entwurf und Entwicklung von Aptamer-Gold-Nanopartikeln basierte kolorimetrische Assays für In-the-Feld-Anwendungen

Das übergeordnete Ziel ist es, einen allgemeinen Ansatz für die Entwicklung eines auf Aptamer-Gold-Nanopartikeln basierenden kolorimetrischen Assays zur Detektion von Zielmolekülen bereitzustellen und Ansätze zur Verbesserung der Langzeitspeicherung sowie zur Reduzierung von Fehlalarmen bereitzustellen. Diese Methode beantwortet zentrale Fragen im Bereich der Goldnanopartikel-Aptamer-Kolorimetrie-Assays, wie etwa die Reproduzierbarkeit der Assays im Feld für die Langzeitspeicherung und die Reduzierung der Falsch-Positiv-Reaktionsrate. Diese Tests können anfällig für Probleme mit der Haltbarkeit und falsch-positiven Reaktionen sein.

In dieser Arbeit verbessern wir uns bei beiden Themen. Reinigen Sie eine 500-Milliliter-Erlenmeyer-Flasche und eine große Rührstange mit fünf Millilitern konzentrierter Salpetersäure und 15 Millilitern konzentrierter Salzsäure in einer chemischen Sicherheitshaube. Befeuchte die gesamte Oberfläche des Kolbens mit dem Säurewaschen.

Anschließend spülen Sie die Flasche mit nukleasefreiem Wasser ab und lassen Sie sie trocknen. Fügen Sie 100 Milliliter ein millimolares Gold, drei Chlorid hinzu. Verwenden Sie eine Alufolie, um den oberen Teil des säuregereinigten Erlenmeyer-Kolbens zu bedecken, und erhitzen Sie mit kontinuierlichem Rühren auf einer heißen Platte, bis es kocht.

Als Nächstes werden 10 Milliliter 38,8 millimolare Natriumcitrat hinzugefügt. Die Farbe wechselt über mehrere Minuten von klar oder grau zu dunkelblau oder schwarz und schließlich von dunkel zu rot. Rühren Sie 10 Minuten lang mit ausgeschaltetem Herd weiter.

Lassen Sie die Goldnanopartikelsuspension auf Raumtemperatur abkühlen und geben Sie 110 Mikroliter DEPC mit kontinuierlichem Rühren dazu. Decken Sie die gesamte Flasche mit Alufolie ab und lassen Sie die DEPC-Behandlung über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag autoklaviert man die Gold-Nanopartikel-Suspension.

Dann auf Raumtemperatur abkühlen und durch eine 0,22-Mikron-Poren-Celluloseacetatmembran filtern. Lagern Sie die gefilterte, autoklavierte Gold-Nanopartikel-Lösung im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Berechnen Sie die Goldnanopartikelkonzentration, wie im Textprotokoll beschrieben.

Hier wurde die Konzentration auf 10 nanomolare mit einer Größe von 15 Nanometern berechnet, bestimmt durch dynamische Lichtstreuung. Kaufen oder synthetisieren Sie die kokainbindenden Aptamer-Sequenzen mit Standard-Phosphoramidit-Chemie. Nach der Reinigung der Aptamere mit Standardentsalzung werden Oligonukleotide in nukleasefreiem Wasser entweder mit 100 mikromolaren oder einem millimolaren Stock rekonstituiert.

Aliquotierte gereinigte Aptamer können mehrere Monate bei 20 Grad Celsius gelagert werden. Kombinieren Sie die DNA mit der 10-nanomolaren Goldnanopartikellösung und variieren Sie das Volumen der Goldnanopartikel nach Belieben, um genügend Probe für den Test zu erhalten. Inkubieren Sie die Mischung drei bis vier Stunden bei Zimmertemperatur und schützen Sie sie vor Licht.

Fügen Sie ein gleiches Volumen von 20 millimolaren HEPES, zwei millimolaren Magnesiumchlorid und einem pH-Puffer von 7,4 hinzu und bringen Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Die anfängliche Salzkonzentration, die benötigt wird, um die Farbantwort des Tests durch Salztitration zu induzieren, wird mit dem Prüfstoffrohling bestimmt. Fügen Sie 20 Mikroliter Methanol zu 180-Mikroliter-Aliquoten des Aptamer-Goldchlorid-Tests in einer 96-Well-Platte hinzu.

Ein entscheidender Schritt bei der Ausführung dieser Tests ist die Bestimmung der Natriumchloridkonzentration, um die Goldnanopartikel nach der Zugabe des Ziels zu destabilisieren. Titrieren Sie die Proben mit zunehmenden Mengen der Standardnatriumchloridlösung und bestimmen Sie den Äquivalenzpunkt. Hier bestimmen Sie das Natriumchloridvolumen, das benötigt wird, um die kleinste Farbveränderung zu verursachen, durch visuelle Beobachtung.

Zur Optimierung der Assay-Antwort fügen Sie 20 Mikroliter Analytmoleküle, die in Methanol verdünnt sind, zu 180-Mikroliter-Aliquoten des Aptamer-Gold-Nanopartikel-Assays in einer 96-Well-Platte bei Raumtemperatur hinzu. Fügen Sie sofort die im vorherigen Schritt bestimmte Natriumchloridkonzentration hinzu, um die Farbantwort des Tests einzuleiten. Erreichen Sie die größtmögliche Farbveränderung, indem Sie die Natriumchloridkonzentration erhöhen oder verringern und die Zielantwort mit der Blankantwort vergleichen.

Verwenden Sie die Natriumchloridkonzentration, die den größten Unterschied in der Reaktion bietet. Beobachten oder messen Sie die Assay-Antwort 150 Sekunden nach der Zugabe von Natriumchlorid. Analysieren Sie die Absorption bei 650 Nanometern und 530 Nanometern mit einem Spektrophotometer.

Zeichnen Sie die Ergebnisse als das Verhältnis der Absorption bei 650 Nanometern und 530 Nanometern als Funktion der Analytkonzentration dar. Normalisiere die Assay-Reaktion auf das leere Signal. Bereiten Sie die Aptamer-Gold-Nanopartikel-Assay-Komponenten vor, wie zuvor im Video beschrieben.

Stellen Sie separate Lösungen her, die ein Gramm Trehalose pro Milliliter und ein Gramm pro Milliliter Saccharose in nukleasefreiem Wasser enthalten, um die Kryogenlösung herzustellen. Ein entscheidender Schritt beim Einfrieren dieser Tests ist daher die Feststellung, wie viele Trehalose- und Saccharoselösungen zu den Proben hinzugefügt werden, um eine vollständige und gleichmäßige Einfrierung zu gewährleisten. Stellen Sie eine Lösung her, die 19,2 Milligramm Trehalose pro Milliliter und 4,8 Milligramm pro Milliliter Saccharose enthält, mit dem 60-MN4-DNA-Pro-Gold-Nanopartikel-Test bei einem Endvolumen von 200 Mikrolitern in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren.

Die endgültigen Konzentrationen der Kryogenlösung variieren je nach DNA-Abdeckung. Schnellgefrieren Sie die Proben mit einem Gefrierfach bei 146 Grad Celsius oder in flüssigem Stickstoff. Bewahren Sie die Proben gefroren auf, bis Sie sie verwenden.

Für diese Arbeit lassen Sie die Proben über Nacht im Gefrierfach bei 146 Grad Celsius stehen und dann in einen Gefrierschrank bei 20 Grad Celsius zur Langzeitlagerung umleiten. Hier sind repräsentative Ergebnisse der Natriumchlorid-Titrationskurven für unbehandelte und DNA-aptämerbehandelte Goldnanopartikel dargestellt. Die anfängliche Natriumchloridkonzentration, die im Test verwendet wurde, wurde durch Titration bestimmt.

Repräsentative Ergebnisse des Aptamer-Gold-Nanopartikel-Kolorimetrietests für Kokain und Kontrollmoleküle sind hier dargestellt. Die Diagramme zeigen die Auswirkung, die eine Erhöhung der DNA-Abdeckungsdichte auf die Falsch-Positiv-Reaktionsrate des Kokaintests hat. Hier sind die Kalibrierungskurvendiagramme dargestellt, die aus der Fotobildanalyse des Kokain-kolorimetrischen Tests gewonnen wurden.

Fotos, die mit Smartphones aufgenommen wurden. Hier werden repräsentative Ergebnisse der Assay-Reaktion des Aptamer-Gold-Nanopartikel-Kolorimetrie-Tests auf Kokain und Kontrollmoleküle präsentiert. Die Daten vergleichen frisch zubereitete Proben mit Proben, die bis zu vier Wochen gefroren waren.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, die richtige Natriumchloridkonzentration zu bestimmen, um die Goldnanopartikel zu destabilisieren und die typische Farbveränderung bei der Zugabe des Ziels zu fördern. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man gold-Nanopartikel-Aptamer-Kolorimetrische Assays zur Erkennung von interessanten Zielen entwickelt. Sie können die hier beschriebenen Ansätze nutzen, um die Raten von falsch-positiven Antworten zu reduzieren und Ihre Assays länger als einen Monat lebensfähig zu halten.