Name: Schnelle Überprüfung von Terminatoren Mit PGR-Blau Plasmide und Golden Gate Assembly (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit Golden Gate Assembly die Stärke bioinformatisch identifizierter Terminatoren schnell quantifizieren. Dieses Protokoll ermöglicht die biologische Validierung in weniger als einer Woche.

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Autoren möchten Malcom Campbell und Todd Eckdahl mit dem Genome Consortium for Active Teaching (GCAT) und dem HHMI-Science Education Alliance bestätigen - Phage Hunters Advancing Genomics und Evolutions Science (SEA-Phagen) Programm. Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse aus dem National Center for Research Resources (P20RR016460) und dem National Institute of General Medical Sciences (P20GM103429) von den National Institutes of Health. Diese Forschung wurde teilweise von der National Science Foundation unter Gewährung # IIA-1457888 unterstützt. Zusätzlich institutionelle (Ouachita Baptist University) Mittel wurden durch die JD Patterson Summer Research Fellowship zur Verfügung gestellt.

1. Planung und Bestellung von Oligonucleotiden mit den entsprechenden Sticky Ends <ol><li> Identifizieren Sie potenzielle rho-unabhängige Terminatoren durch genomische Analyse Programme , die online frei verfügbar sind. 7 </li><li> Wenn sie mit doppelsträngiger DNA arbeiten, bestimmen die Orientierung des Terminators zu testen. 7 PGR-Blue - Plasmid nur Abbrechern in der 5 &#39;zu 3&#39; - Richtung auf der Oberseite (Vorwärtsstrang) ligiert prüft. <ol><li> Konvertieren Sie einen Boden (rückwärts) Strang Terminator seine umgekehrt Komplement der Sequenz zum Testen in pGR-Blau mit dem kostenlosen Online - Software neu zu orientieren, zum Beispiel ApE. </li></ol></li><li> Nachdem die Ausrichtung bestimmt wird, korrekt zu sein, fügen Sie das sticky end &quot;5&#39;-CGAC-3 &#39;&quot; an das 5&#39;-Ende des oberen Stranges. Fügen Sie das sticky end &quot;5&#39;-CCGC-3 &#39;&quot; an das 5&#39; - Ende des unteren Strang. 8 Dadurch wird sichergestellt , dass ligierte Insert wird in den entsprechenden eingefügt werdenmit GGA Orientierung. </li><li> Sobald Sequenzen bestimmt werden, zu bestellen im Handel als Einzelstrang-Oligonukleotiden. </li></ol> 2. Ausglühen Oligonucleotides (Gilt nur für gefriergetrocknete DNA) <ol><li> Re-suspendieren einzelnen Oligonukleotide in Nuklease freiem Wasser zu einer Konzentration von 100 uM. </li><li> Machen 10x Annealing-Puffer: 1 M NaCl und 100 mM Tris-HCl pH 7,4. Annealing-Puffer kann bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden. Sobald Anelierungspuffer hergestellt und Oligonukleotide erneut suspendiert sind, beginnen die Glühen 8. </li><li> Für jeden Terminator getestet werden, 16 &amp; mgr; l ultrareinem Wasser in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen. </li><li> Fügen Sie 2 ul 10 fach Anelierungspuffer zu jedem Reaktionsgefäß. </li><li> 1 ul des Obertrums Oligonukleotid (100 uM) von dem gewünschten Terminator. </li><li> 1 ul des Untertrums Oligonukleotid (100 uM) von dem gewünschten Terminator. </li><li> Erstellen eines Siedewasser-bath unter Verwendung von auf einer heißen Platte einen 1000-ml-Becher etwa 400 ml Leitungswasser und Ort enthalten. </li><li> Legen Sie die Reaktionsgefäße aus Schritt 2.6 in einem Schwimmer und kochen für 4 min. Nach 4 min, drehen Sie die Heizplatte aber lassen Sie das Rohr und schweben im Wasserbad langsam abkühlen O / N (18 h) 8 ab. Speichern der geglühten Terminatoren bei -20 ° C. </li></ol> 3. Golden Gate Assembly (Standard Mix - Cost Efficient) <ol><li> Machen Sie eine 40 nM Verdünnung der angelagerten Terminatoren. In 124 ul Nuklease freiem Wasser auf 1 ul geglüht Terminatoren-Mix (100 &amp; mgr; M). <ol><li> Zentrifugieren Sie die Proben für 30 Sekunden bei 10.000 × g und auf Eis lagern. </li></ol></li><li> In ein neues Röhrchen geeignet für den Thermocycler verwendet werden, fügen Sie 6 ul Nuclease freies Wasser. </li><li> 1 &amp; mgr; l handelsüblichen DNA - Ligasepuffer [300 mM Tris-HCl (pH 7,7-7,8), 100 mM MgCl 2, 100 mM DTT und 10 mM ATP]. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte auf dem Eis. </li><li> Hinzufügen1 ul PGR-Blue (35-50 ng / ul) Ziel Plasmid mit dem Reaktionsgefäß. </li><li> 1 &amp; mgr; l der 40 nM geglühten Terminatoren an den Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> In 0,5 ul kommerziellen High-Fidelity-BsaI Restriktionsendonuklease zum Reaktionsgefäß. </li><li> In 0,5 ul kommerzieller DNA-Ligase an das Reaktionsgefäß. </li><li> Zentrifugieren der Reaktionsmischung bei 10.000 × g für 120 Sekunden. Dann legen Sie den Schlauch direkt in den Thermocycler. </li><li> Führen Sie die Thermocycler-Programm: 20 Zyklen von 1 min bei 37 ° C, gefolgt von 1 min bei 16 ° C, gefolgt von 1 Zyklus von 15 min bei 37 ° C. Verwenden Proben sofort oder einfrieren und bei -20 ° C. 8 </li></ol> 4. Golden Gate Assembly (Commercial Master Mix - Zeit Efficient) <ol><li> In 124 ul nukleasefreiem Wasser zu 1 &amp; mgr; l der 100 &amp; mgr; M Terminatoren in Schritt erstellt geglüht 2. Dies schwächt die Terminator-DNA-Konzentration auf 40 nM.Führen Sie diesen Schritt in einem neuen, markierten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> In ein neues Röhrchen geeignet für den Thermocycler, fügen Sie 14 ul Nuklease freiem Wasser. Stellen Sie sicher, dass das neue Rohr entsprechend markiert ist. </li><li> In 2 ul Gewerbe Master Mix Puffer zum Reaktionsgefäß. </li><li> 1 ul PGR-Blau-Plasmid (35-50 ng / ul) zum Reaktionsgefäß. </li><li> In 2 ul der 40 nM geglühten Terminatoren an den Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> 1 &amp; mgr; l Gewerbe Master Mix zum Reaktionsgefäß. </li><li> Zentrifugieren Sie die 40 nM Röhrchen bei 10.000 × g für 120 Sekunden. Dann legen Sie den Schlauch direkt in den Thermocycler. </li><li> Führen Sie die Thermocycler-Programm: 1 Zyklus von 60 min bei 37 ° C von 1 Zyklus von 15 min bei 55 ° C gefolgt. Verwenden Proben sofort oder einfrieren und bei -20 ° C. </li></ol> 5. Transformation und Kolonieselektion <ol><li> Bereiten Sie Luria Base (LB) Agar-Petrischalen mit 1 mM Konzentration Ampicillin (Amp) und eine 10 mM Konzentration von Arabinose (ARB). Bereiten Sie mindestens 10 ml 1 M L -Arabinose Stammlösung , da diese Stammlösung wird in späteren Schritten verwendet werden. </li><li> Verwenden Sie einen hocheffizienten (10. August - 10. SEPTEMBER Transformanten / ug) chemisch kompetente E. coli (JM109) Zellen für die Transformation. 9 Für die besten Ergebnisse, 3-5 ul der Ligationsreaktion zu 50 ul kompetente Zellen hinzuzufügen. Wenn chemische kompetente Zellen verwenden, befolgen Sie die Transformationsprotokoll spezifisch für die Zellen verwendet wird. </li><li> Die Hälfte (25 ul) der transformierten Zellen auf vorgewärmte LB (Amp / arb) Agarplatten einer sterilen L-förmigen &quot;Hockeyschläger&quot; mit und Inkubation O / N bei 37 ° C. Aufgrund der schnellen Geschwindigkeit der Zersetzung des Ampicillin, nicht inkubieren nicht über 24 h bei 37 ° C. </li><li> Führen Kolonieselektion basierend auf Farbe durch visuelle Inspektion. Eine erfolgreiche Unterbindung sollte weiß / gelb in sichtbares Licht und fluoresziert grün under Blau (450 nm) oder UV-Licht. Ein erfolgloser Ligatur wird eine Kolonie produzieren, die nach 18 in Farbe unter sichtbarem Licht blau ist - 20 Stunden. </li></ol> 6. Überprüfung und Quantifizierung von Terminator <ol><li> Bereiten Sie 5 ml sterile LB-Brühe Röhrchen mit 1 mM Ampicillin und 10 mM Arabinose. Die Anzahl der Rohre erforderlich ist, ist abhängig von der Anzahl der Terminatoren getestet und Kontrollen (Zellen, die mit Ampicillin-Resistenz, die fluoreszieren, und die Zellen nicht den ungeschnittenen pGR Blau Plasmid enthält) wird. </li><li> Unter sichtbarem Licht wählen Sie eine sterile Schleife mit 2-3 weiß / gelb Kolonien (Schritt 5.4). Lassen Sie die Proben bei 37 ° C und 160 rpm für 16-18 h in Brühen auf einem Schüttler inkubiert. Sie brüten nicht diese Proben für mehr als 24 Stunden. <ol><li> Optional können ein Spektrophotometer optische Zelle Dichte bei 600 nm (OD 600) , um zu bestimmen ausreichende Zellwachstum zu gewährleisten. Im Allgemeinen wird ein OD 600 von ~ 0,8-1,0 nach 16-18 h des Wachstums beobachtet. </li></ol></li><li> Benutzeneine sterile 96-Well-Platte für die verbleibenden Schritte aus. Führen Sie diese Schritte in einer aseptischen Umgebung und in dreifacher Ausfertigung. In 199 ul sterilem LB + Amp / Arabinose Brühe (1 mM Ampicillin / 10 mM Arabinose) in jede Vertiefung. Fügen Sie Platz auf der Platte für drei separate Steuerungen. <ol><li> Verwenden Sie die folgenden drei Steuerelemente: Ein gut (1) mit LB + Amp / Arabinose Brühe nur und ein gut (2) für nicht-transformierten kompetenten Zellen (leer) als Rohling zu dienen. Für die Quantifizierung (3) des Terminators Stärke, ungeschnittene ursprüngliche pGR enthaltenden Zellen oder mit einem Gehalt pGR-Blau mit einer nicht abbrechenden Sequenz ligiert sollte (Referenzsteuerung für die Quantifizierung) einbezogen werden. Siehe Abbildung 1 für Plattenleser Layout. </li></ol></li><li> Pipette 1 ul der Zelllösung aus dem O / N Brühen in einzelne Wells der 96-Well-Platte. </li><li> Dichtungsplatten mit einer atmungsfähigen Deckel und schütteln für 18-20 Stunden bei 37 ° C und 160 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Mit Hilfe eines Plattenlesegerät, bestimmen OD 600 durch LesenExtinktion bei 600 nm. Messen Sie GFP - Fluoreszenz wie folgt: Anregung 395 und Emission 509. Measure RFP Fluoreszenz wie folgt: Anregung 575 und Emission 605. Nach 18-20 h, die OD 600 sollte etwa 0,5 betragen. </li><li> Um eine Veränderung der Wachstums normalisieren, verwenden Sie die Gleichung: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54064/54064eq1.jpg" /> sowohl für GFP und RFP. </li><li> Nach der Normalisierung, bestimmen die Gleichung relativ Terminator Stärke unter Verwendung von <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/54064/54064eq2.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Li, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+promoter+sequence+and+its+strength+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Phys+J+E+Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GreenGate---a+novel%2C+versatile%2C+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043(2013).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+582+natural+and+synthetic+terminators+and+quantification+of+their+design+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints.</a> Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).</li>
<li>Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+change+in+biology+undergraduate+education%2C+a+call+for+action--initial+responses%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses.</a> CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).</li>
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<li>Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+mutations+in+the+Escherichia+coli+AraC+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein.</a> J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).</li>
<li>Schleif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+L-arabinose+operon+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli.</a> Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).</li>
<li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composability+of+regulatory+sequences+controlling+transcription+and+translation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).</li>
<li>Sharon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+gene+regulatory+logic+from+high-throughput+measurements+of+thousands+of+systematically+designed+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters.</a> Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die richtige Oligonukleotid-Design bis zur Bestellung vor. Die Oligonukleotide müssen die entsprechenden klebrigen Enden sowohl an die 5&#39;-Enden der oberen und unteren hinzugefügt Stränge, um sicherzustellen, dass GGA Einbau möglich ist. Darüber hinaus ist es wichtig, die Ausrichtung von links mit Blick auf Terminatoren (Terminatoren, die Transkription auf dem Untertrum stoppen), die der rechten Verblendung (endet Transkription auf dem oberen Strang) Terminatoren weil GF...

Große Projekte in der synthetischen Biologie erfordern die Verwendung von hochwirksamen Transkriptionsterminatoren, um die Genexpression zu regulieren. Die Identifizierung neuartiger Terminatoren erfordert eine bioinformatische Analyse neuartiger Genome. Da jedoch immer mehr bioinformatische Software entwickelt wird, die jeweils einen einzigartigen Algorithmus für die Vorhersage verwendet, kommt es zu mehr Diskrepanz zwischen den mutmaßlichen Ergebnissen. Da dieser Prozess etwas subjektiv ist und in silico durchgeführt wird, müssen diese Vorhersagen biologisch bestätigt werden. 1 Darüber hinaus erfordert das Volumen der durch In-silico-Analyse identifizierten mutmaßlichen Terminatoren den Einsatz von Klonierungsstrategien, die in einem relativ kurzen Zeitrahmen abgeschlossen werden können. 
Das PGR-Blue-Plasmid ist eine Modifikation des PGR-Plasmids, das neu gestaltet wurde, um die Golden Gate Assembly (GGA) zu verwenden, um das Klonierungsverfahren zu vereinfachen, indem es ermöglicht, dass alle Reaktionsschritte gleichzeitig in einem Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt werden können. 2,3 Die Farbselektion wurde in das Plasmid integriert, um die Identifizierung positiver Kolonien zu erleichtern. Eine erfolgreiche Ligation sollte im sichtbaren Licht weiß/gelb sein und unter blauem (450 nm) oder ultraviolettem (UV) Licht grün fluoreszieren, wenn sie auf Platten mit Arabinose gezüchtet wird. Da ungeschnittenes pGR-Blau ein blaues Chromo-Protein (amilCP) enthält, sind Kolonien, die ein unmodifiziertes Plasmid enthalten, unter sichtbarem Licht blau. Diese Vereinfachung zusammen mit dem optimierten Protokoll ermöglicht es den Forschern, innerhalb von drei bis vier Tagen von der bioinformatischen Identifizierung zur biologischen Bestätigung zu gelangen. Die Designnatur dieses Systems kann sowohl im Forschungslabor als auch im Bildungsbereich von Vorteil sein.
Das pGR-Blue-Plasmid ermöglicht die Quantifizierung der Terminatorstärke. 4 Ein einzelner induzierbarer Arabinose-Promotor wird zur Herstellung von grün fluoreszierendem Protein (GFP) und rotem fluoreszierendem Protein (RFP) verwendet. Der Terminator wird nach der GFP-Sequenz, aber vor der RFP-Sequenz in das Plasmid kloniert, wodurch die Transkription des RFP-Proteins gestoppt wird. Die Stärke des Abschlusswiderstands wird durch das Verhältnis von erzeugtem GFP zu erzeugtem RFP bestimmt. 
Der Bericht Vision and Change5 schlug vor, dass die Ausbildung in den Bereichen Mathematik, Informatik, Naturwissenschaften und Technik (MINT) forschungsbasierte Erfahrungen in den Unterricht integriert. 6 Dies erfordert jedoch die Entwicklung von Protokollen, die von Studierenden mit begrenzten Fähigkeiten in einem definierten Zeitrahmen durchgeführt werden können. Während das Protokoll in nur drei Tagen durchgeführt werden kann, wurde es auch so konzipiert, dass jeder wichtige Schritt in einer separaten wöchentlichen (2-3 Stunden) Laborperiode durchgeführt werden kann, um eine Course Research Experience (CRE) zu erstellen. Auf diese Weise dauert das Verfahren zwischen drei und sechs Wochen und eignet sich sowohl für Einführungs- als auch für Aufbaukurse in Genetik, Zellbiologie oder Bioinformatik.

<table><tbody><tr><td>pGR-Blue Plasmid</td><td>Addgene</td><td>68374</td><td></td></tr><tr><td>pGR-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>46002</td><td></td></tr><tr><td>AeraSeal-(Sterile Sheets)</td><td>Excel Scientific</td><td>BS-25</td><td>Sterile Sheets nur</td></tr><tr><td>10x T4 DNA Ligase Puffer</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td>Das Nicht-HF-Enzym funktioniert, ist aber weniger hitzestabil.</td></tr><tr><td>NEB Golden Gate Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E1600S</td><td>Commerial Master Mix, auf den im Protokoll Bezug genommen wird.</td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Runde Mikrozentrifuge Floating Rack</td><td>Nova Tech International</td><td>F18875-6401</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin-Natriumsalz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Arabinose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-3256</td><td>D-Arabinose induziert den pBAD-Promotor Luria</td></tr><tr><td>Base (LB) - Brühe, Miller</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1900</td><td></td></tr><tr><td>Luria Base (LB) - Agar, Miller</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2025</td><td></td></tr><tr><td>Tecan-Infinite M200 Plate Reader</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mix & Go Competent Cells - Stamm JM109</td><td>Zymo Research</td><td>T3005</td><td>Verwenden Sie das vom Unternehmen empfohlene Transformationsprotokoll</td></tr><tr><td>ApE: Eine Plasmid-Editor-Software</td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tris-HCl,</td><td>Promega</td><td>H5121</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid in molekularer Qualität, (kristallin/biologisch, zertifiziert)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S671</td><td></td></tr><tr><td>Kommerzielle Oligonukleotidsynthese</td><td>Integrierte DNA-Technologien (IDT)</td><td></td><td>http://www.idtdna.com/site</td></tr><tr><td>Mikrotest-Gewebekulturplatten - 96 Well (steril)</td><td>Falcon</td><td>35-3072</td><td></td></tr><tr><td>Mykobakteriophagen "Bernal13"</td><td>Genbank</td><td>KJ510413</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Integrierte DNA-Technologien (IDT)</td><td>IDT004</td><td></td></tr><tr><td>Steril, L-förmig Hockey-Stick Cell</td><td>Life Science Products</td><td>6444-S1</td><td></td></tr><tr><td>Nano-Drop 2000c UV-Vis Spektrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>ARNold: ein Web-Tool zur Vorhersage von Rho-unabhängigen Transkriptionsterminatoren.</td><td></td><td></td><td></td>http://rna.igmors.u-psud.fr/</tr></tbody></table>

schnelle Überprüfung von terminatoren mit pgr-blau plasmide und golden gate assembly

Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die schnelle Verifizierung von bioinformatisch identifizierten Terminatoren zu ermöglichen. Darüber hinaus wurde das Plasmid (pGR-Blue) speziell für dieses Protokoll entwickelt und ermöglicht die Quantifizierung der Terminatoreffizienz. Als Proof of Concept wurden sechs Terminatoren im Mykobakteriophagen Bernal13 bioinformatisch identifiziert. Nach der Identifizierung wurden die Terminatoren als Oligonukleotide mit den entsprechenden klebrigen Enden hergestellt und zusammen geglüht. Mit Hilfe der Golden Gate Assembly (GGA) wurden dann Terminatoren in pGR-Blue geklont. Unter sichtbarem Licht erscheinen falsch positive Kolonien blau und positiv transformierte Kolonien sind weiß/gelb. Nach Induktion eines induzierbaren Arabinose-Promotors (pBad) mit Arabinose kann die Koloniestärke bestimmt werden, indem das Verhältnis des produzierten grün fluoreszierenden Proteins (GFP) zum produzierten roten fluoreszierenden Protein (RFP) gemessen wird. Mit pGR-Blue kann das Protokoll in nur drei Tagen abgeschlossen werden und ist ideal für ein Bildungsumfeld. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass dieses Protokoll nützlich ist, um in silico Vorhersagen der Terminatoreffizienz im Zusammenhang mit der Regulation der Transkription zu verstehen.

Dieses Protokoll wird produzieren Zellen pGR-Blau mit einem Terminator ligiert zwischen GFP und RFP mit Golden Gate Assembly (Abbildung 2) enthält. Positive Kolonien ligierte Insert enthält, kann auf der Grundlage Farbe ausgewählt werden. Im sichtbaren Licht werden positive Kolonien weiß / gelb und Fehlalarme werden blaue Kolonien nach 18-20 h Inkubation bei 37 ° C (Abbildung 3) zu erzeugen. N...

Dieses Protokoll verwendet die Golden Gate Assembly und das Plasmid pGR-blue, um die Stärke von in silico gefundenen Terminatoren schnell zu quantifizieren.

Schnelle Überprüfung von Terminatoren Mit PGR-Blau Plasmide und Golden Gate Assembly

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed ...

Das übergeordnete Ziel des synthetischen Biologie-Protokolls besteht darin, die Funktionalität von Terminatoren schnell zu bestimmen und deren Stärke in einem In-vitro-System zu quantifizieren, das die Golden-Gate-Assembly nutzt. Dieses Protokoll dient dazu, Terminatoren, die wir mittels Bioinformatik in silico identifiziert haben, in einem biologischen Kontext zu testen. Dies ermöglicht eine schnelle und einfache Bestätigung bioinformatisch identifizierter Terminatoren unter Laborbedingungen.Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt in seiner Schnelligkeit. Wir können innerhalb von weniger als einer Woche von der bioinformatischen Identifizierung zur biologischen Bestätigung übergehen. Auf diesem Weg können wir außerdem überprüfen, ob ein Terminator tatsächlich ein Terminator ist, und seine Terminierungsstärke quantifizieren.Im Allgemeinen werden Personen zunächst Schwierigkeiten mit dieser Technik haben, da es kontraintuitiv erscheint, die Restriktionsenzyme zusammen mit einer Ligase im selben Ansatz hinzuzufügen. Wir verwenden jedoch Restriktionsendonukleasen vom Typ 2S, bei denen die Erkennungsstelle des Enzyms von der eigentlichen Schnittstelle getrennt ist. Sobald der Terminierungssequenz in das pGR-blue-Plasmid eingefügt wurde, handelt es sich um eine dauerhafte Ligierung.Jedoch können wir durch die Verwendung des Restriktionsenzyms und der Ligase im selben Reaktionsgefäß über mehrere Zyklen hinweg eine hohe Klonierungseffizienz erreichen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die einzelnen Oligonukleotide in nukleasefreiem Wasser mit einer Konzentration von 100 µM resuspendieren und anschließend einen 10x-Annealing-Puffer herstellen. Danach beschriften Sie je ein 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen für jeden zu testenden Terminator.Geben Sie in jedes Reagenzglas 16 µL ultra-reines Wasser, 2 µL 10x-Annealingpuffer sowie jeweils 1 µL der oberen und unteren Strang-Oligonukleotide der gewünschten Terminatoren. Es ist sehr wichtig sicherzustellen, dass die bestellten Oligonukleotide die korrekten klebrigen Enden aufweisen. Denn sobald sie miteinander annealiert sind, muss gewährleistet sein, dass der Terminator in der richtigen Orientierung vorliegt.Wenn sich der Terminierungssequenz in der falschen Orientierung befindet, kann pGR blue nicht überprüfen, ob es sich um einen funktionierenden Terminator handelt. Stellen Sie danach die Mikrozentrifugenröhrchen in einen Schwimmer und kochen Sie sie vier Minuten lang in einem Wasserbad. Nach vier Minuten schalten Sie die Heizplatte aus, lassen die Röhrchen jedoch über Nacht im Wasser, damit sie langsam abkühlen.Lagern Sie die annealierten Terminator bei 20 Grad Celsius. Um eine 40 Nanomolar-Verdünnung der annealierten Terminator herzustellen, tauen Sie diese zuerst auf Eis auf und geben dann in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen 124 Mikroliter nukleasefreies Wasser zu 1 Mikroliter der annealierten Terminator. Zentrifugieren Sie die Proben 30 Sekunden bei 10.000× g.Nach dem Zentrifugieren lagern Sie die Proben auf Eis. Geben Sie in ein neues, für den Thermocycler geeignetes Röhrchen 6 µL nukleasefreies Wasser. Fügen Sie anschließend 1 µL kommerziellen DNA-Ligase-Puffer hinzu.Führen Sie alle nachfolgenden Schritte auf Eis durch. Geben Sie anschließend 1 Mikroliter mit 35 bis 50 Nanogramm pro Mikroliter des pGR-blue-Destinationsplasmids, 1 Mikroliter der 40 Nanomolar angeordneten Terminatoren, 0,5 Mikroliter kommerziellen hochfideligen BSA1-Restriktionsendonuklease und 0,5 Mikroliter kommerzielle DNA-Ligase hinzu. Zentrifugieren Sie die Reaktionsmischung bei 10.000 × g für 120 Sekunden.Bringen Sie das Röhrchen anschließend direkt in den Thermocycler ein und führen Sie das folgende Programm durch: 20 Zyklen mit jeweils 1 Minute bei 37 Grad Celsius, gefolgt von 1 Minute bei 16 Grad Celsius, danach ein Zyklus mit 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach Beendigung des Programms entweder die Proben bei 20 Grad Celsius einfrieren und lagern oder unmittelbar mit der Transformation fortfahren.Transformieren Sie die Ligationsreaktionen in chemisch kompetente E. coli-Zellen, indem Sie ein geeignetes Transformationsprotokoll verwenden. Hier werden JM109-Zellen mittels Zippy-Transformation transformiert.Verteilen Sie mit einem L-förmigen Glas-Hockeyschläger 25 Mikroliter der transformierten Zellen auf vorgewärmten LB-Agarplatten, die 1 Millimolar Ampicillin und 10 Millimolar Arabinose enthalten. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Inkubieren Sie sie nicht länger als 24 Stunden.Ampicillin zerfällt rasch. Am nächsten Tag die Farbe der Kolonien überprüfen. Eine erfolgreiche Ligierung sollte im sichtbaren Licht weiß oder gelb sein und unter blauem oder UV-Licht grün fluoreszieren.Eine erfolglose Ligierung führt zu einer Kolonie, die unter sichtbarem Licht blau gefärbt ist. Bereiten Sie für jeden der Terminatoren und Kontrollen ein Reagenzglas mit 5 Milliliter sterilisierter LB-Brühe, die 1 Millimolar Ampicillin und 10 Millimolar Arabinose enthält, vor. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es bei Verwendung von pGR besonders wichtig, sicherzustellen, dass die geeigneten Kontrollen vorhanden sind.Die erste Kontrolle sollte lediglich LB-Brühe sein. Die nächste Kontrolle sollten Zellen sein, die resistent gegen Ampicillin sind, aber unter blauem Licht nicht fluoreszieren. Diese dienen als Blindwert.Die nächste Kontrolle ist ein pGR-Plasmid, das nicht geschnitten wurde und daher keinen Terminator enthält; es dient als Grundlinie für die Terminatorenstärke. Die letzte Ihrer Röhrchen ist für Ihre Probe vorgesehen. Unter sichtbarem Licht eine sterile Schleife verwenden, um 2 bis 3 weiße oder gelbe Kolonien aufzunehmen und in die LB-Brühe zu überführen. Die Proben 16 bis 18 Stunden im Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius und 160 U/min inkubieren lassen.Am nächsten Tag verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die optische Zelldichte jeder Probe bei 600 Nanometern zu bestimmen. Im Allgemeinen wird nach dieser Zeitspanne ein OD 600 von 0,8 bis 1,0 erwartet. Stellen Sie eine sterile 96-Well-Platte in die Haube.Für jede Probe oder Kontrolle bereiten Sie 3 Vertiefungen mit jeweils 199 Mikrolitern steriler LB-Bouillon mit Ampicillin und Arabinose vor. Danach pipettieren Sie 1 Mikroliter der Zelllösung aus den Übernachtkulturen in einzelne Vertiefungen der 96-Loch-Platte. Bedecken Sie die Platten mit einer atmungsaktiven Folie und schütteln Sie sie anschließend 18 bis 20 Stunden bei 37 Grad Celsius und 160 U/min.Am nächsten Tag den OD 600 mit einem Plattenlesegerät bestimmen, der etwa 0,5 betragen sollte. Außerdem die G von P-Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 395 Nanometern und einer Emission von 509 Nanometern messen. Die RFP-Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 575 Nanometern und einer Emission von 605 Nanometern messen.Normalisieren Sie mithilfe von Excel die Variation im Wachstum, indem Sie die Fluoreszenz durch den OD 600 dividieren. Bestimmen Sie nach der Normalisierung die relative Terminatorenstärke, indem Sie die Fluoreszenz des GFP-Terminators durch die Fluoreszenz der GFP-Kontrolle dividieren und dieses Ergebnis durch den Quotienten aus der Fluoreszenz des RFP-Terminators und der Fluoreszenz der RFP-Kontrolle teilen. Feste, bioinformatisch identifizierte putative Terminatoren T1 bis 6 aus dem Mikrobakterien-Phagen bernal 13 wurden wie in diesem Video beschrieben analysiert.Diese Ergebnisse zeigen die relative Fluoreszenz. Alle Ergebnisse wurden unter Verwendung von Zellen, die ungeschnittenes, unverändertes PGR als Kontrolle enthielten, normalisiert. Es wurde festgestellt, dass T3 ein starker Terminator ist.Alle Ergebnisse stellen einzelne Kolonien dar, die im Dreifachansatz gezüchtet und zur visuellen Darstellung gemittelt wurden. Die Fehlerbalken zeigen die Abweichungen zwischen den gemittelten Datenpunkten. Um den besten Referenzkontrollwert zur Quantifizierung der Terminatorenstärke zu bestimmen, wurden Rohdaten unter Verwendung des ursprünglichen pGR-Plasmids ohne Terminator sowie des mit einer als Nicht-Terminator bekannten Sequenz geklonten pGR-blue-Plasmids verglichen.Wie hier zu sehen ist, wiesen beide Kontrollen ähnliche Expressionen von GFP und RFP auf und, was noch wichtiger ist, produzierten ähnliche Verhältnisse von GFP zu RFP. Alle diese Ergebnisse stellen einzelne Kolonien dar, die im Dreifachansatz kultiviert und zur visuellen Darstellung gemittelt wurden. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie inklusive Versand- und Bestellzeit bereits innerhalb von 72 Stunden durchgeführt werden.Es ist wichtig zu beachten, dass pGR blue nur in e.coli funktioniert. Außerdem haben wir, da wir nur einen kleinen Teil des Terminators betrachten, keinerlei Kenntnis über andere regulatorische Elemente, die möglicherweise die Transkription steuern. Um die mit diesem Protokoll unter Verwendung von pGR blue erzielten Ergebnisse zu verifizieren, können zusätzliche Methoden wie die quantitative PCR eingesetzt werden.Zusätzlich kann der pGR-Einschub herausgeschnitten und in ein Plasmid Ihrer Wahl ligiert werden.

rapid-verification-terminators-using-pgr-blue-plasmid-golden-gate

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Designer-Nukleasen wie Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-Effektor wie Nukleasen (Talens) kann verwendet werden, um das Genom der Maus Präimplantationsembryonen durch Auslösen sowohl die nicht-homologe Ende (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR) Wege ändern. Diese Fortschritte ermöglichen die schnelle Generierung von Mäusen, die mit präzisen genetischen Veränderungen.

Maus-Genom-Engineering mit Designer Nukleasen

Die Synthese von benutzerdefinierten Plasmiden ist arbeits- und zeitaufwendig. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Gibson-Assemblierungsklonierung, um den Aufwand und die Dauer des individuellen DNA-Klonierungsverfahrens zu reduzieren. Das beschriebene Protokoll produziert auch zuverlässige getaggte Proteinkonstrukte für die Expression von Säugetieren zu ähnlichen Kosten wie die traditionelle Cut-and-Paste-DNA-Klonierung.

Erzeugung von Plasmid-Vektoren, die FLAG-markierten Proteine ​​Nach der Verordnung der Menschen Elongation Factor-1α Promoter Mit Gibson Assembly

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Ableitung von DNA-Strang-Verschiebungstoren aus Plasmiden und deren Test mit Hilfe von Fluoreszenz-Kinetik-Messungen. Gatter können modular zu Mehrkomponentensystemen zusammengesetzt werden, um das Verhalten formaler chemischer Reaktionsnetzwerke (CRN) zu approximieren, was eine neue Verwendung von CRNs als molekulare Programmiersprache demonstriert.

Plasmid stammende DNA-Strand Displacement Gatter zum Implementieren Chemical Reaction Networks

Wir stellen ein Protokoll für die funktionelle Bewertung umfassender single-site Sättigungsmutagenese Bibliotheken von Proteinen Hochdurchsatz-Sequenzierung verwendet. Wichtig ist, nutzt dieser Ansatz orthogonalen Primerpaare Bibliothek Konstruktion und Sequenzierung zu multiplexen. Repräsentative Ergebnisse unter Verwendung von TEM-1 β-Lactamase in klinisch relevanter Dosierung von Ampicillin ausgewählt werden bereitgestellt.

Ein Protokoll für Functional Assessment of Whole-Protein Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mit Hilfe von High-Throughput Sequencing

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein Gen von Interesse auszuschalten, das an der Plasmidkonjugation beteiligt ist, und anschließend die Auswirkungen seiner Abwesenheit mit Hilfe von Paarungsassays zu analysieren. Die Funktion des Gens wird mit Hilfe von Deletions- oder Punktmutationen auf eine bestimmte Region seiner Sequenz weiter untersucht.

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

Methoden zur Generierung von groß angelegten gRNA Bibliotheken sollte einfach, effizient und kostengünstig sein. Wir beschreiben ein Protokoll für die Herstellung von gRNA Bibliotheken basierend auf enzymatische Verdauung von Ziel DNA. Diese Methode CORALINA (umfassende gRNA Bibliothek Generation durch kontrollierte Nuklease Aktivität) stellt eine Alternative zu teuren benutzerdefinierte Oligonukleotid-Synthese.

Ein universelles Protokoll für groß angelegte gRNA Bibliothek Produktion aus jeder DNA-Quelle

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das beschreibt, wie i) einen sich selbst replizierenden Vektor mithilfe des modularen Klon-Toolkits CyanoGate zusammenstellen kann, ii) den Vektor durch Konjugation in einen cyanobakteriellen Wirt einführt und iii) transgene Cyanobakterienstämme mit einem Plattenleser oder Durchflusszytometrie.

Genetische Modifikation von Cyanobakterien durch Konjugation mit dem CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung von sättigungsverstärkenden Mutationsbibliotheken in gramnegativen Bakterien und der anschließenden Herstellung von DNA-Amplikonbibliotheken für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Als Beispiel konzentrieren wir uns auf den ESKAPE-Erreger Acinetobacter baumannii, aber dieses Protokoll ist für eine Vielzahl von Gram-negativen Organismen zugänglich.

Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine detaillierte, schrittweise Anleitung für die Montage von Multi-Gen-Konstrukten mit dem modularen Klonsystem auf Basis des Golden Gate Klonens bereitzustellen. Es gibt auch Empfehlungen zu kritischen Schritten, um eine optimale Montage auf der Grundlage unserer Erfahrungen zu gewährleisten.

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CRISPR-Cas-Systeme und Anti-CRISPR-Proteine wurden in das Schema der Booleschen Gates in Saccharomyces cerevisiae integriert. Die neuen kleinen Logikschaltkreise zeigten eine gute Leistung und vertieften das Verständnis sowohl von dCas9/dCas12a-basierten Transkriptionsfaktoren als auch von den Eigenschaften von Anti-CRISPR-Proteinen.

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