Schnelle Überprüfung von Terminatoren Mit PGR-Blau Plasmide und Golden Gate Assembly

Das übergeordnete Ziel des Protokolls der synthetischen Biologie besteht darin, die Funktionalität des Terminators schnell zu bestimmen und die Stärke des Terminators in einem In-vitro-System zu quantifizieren, das die Golden-Gate-Assemblierung verwendet. Dieses Protokoll wird verwendet, um Terminatoren, die wir in silico mit Hilfe von Bioinformatik gefunden haben, zu testen und in einer biologischen Umgebung zu testen. Dies ermöglicht eine schnelle und einfache Bestätigung von bioinformatisch identifizierten Terminatoren in einer Labortischumgebung.

Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist seine Geschwindigkeit. Wir können in weniger als einer Woche von der bioinformatischen Identifizierung zur biologischen Bestätigung übergehen. Und auf diese Weise können wir auch überprüfen, ob ein Terminator tatsächlich ein Terminator ist, und wir können seine Abschlussstärke quantifizieren.

Im Allgemeinen werden Einzelpersonen anfangs Schwierigkeiten mit dieser Technik haben, da es kontraintuitiv klingt, das Restriktionsenzym mit einer Ligase im selben Röhrchen hinzuzufügen. Wir verwenden jedoch Typ-2S-Restriktionsendonukleasen, und die Erkennungsstelle für das Enzym ist von der eigentlichen Schnittstelle getrennt. Sobald der Terminator in das pGR-Blauplasmid ligiert ist, handelt es sich um eine permanente Ligation.

Indem wir jedoch das Restriktionsenzym und die Ligase im selben Röhrchen haben und mehrere Zyklen durchlaufen, können wir eine hohe Verschließeffizienz erreichen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die einzelnen Oligonukleotide in nukleasefreiem Wasser in einer Konzentration von 100 Mikromolaren resuspendieren und dann einen 10-fachen Annealing-Puffer vorbereiten. Beschriften Sie als Nächstes ein 1,5-Millimeter-Mikrozentrifugenröhrchen für jeden zu testenden Terminator.

Zu jedem Röhrchen werden 16 Mikroliter Reinstwasser, 2 Mikroliter 10x Glühpuffer und je 1 Mikroliter der Ober- und Unterstrang-Oligonukotide aus den gewünschten Terminatoren gegeben. Es ist sehr wichtig sicherzustellen, dass die von Ihnen bestellten Oligonuklotide die richtigen klebrigen Enden haben. Denn sobald sie zusammen geglüht sind, ist es wichtig sicherzustellen, dass sich der Abschlusswiderstand in der richtigen Ausrichtung befindet.

Wenn sich das Abschlusszeichen in der falschen Ausrichtung befindet, kann pGR blau nicht überprüfen, ob es sich um ein funktionierendes Abschlusszeichen handelt. Legen Sie dann die Mikrozentrifugenröhrchen in einen Schwimmer und kochen Sie sie vier Minuten lang in einem Wasserbad. Schalten Sie nach vier Minuten die Heizplatte aus, lassen Sie die Tube aber über Nacht im Wasser, um sie langsam abzukühlen.

Lagern Sie die geglühten Terminatoren bei 20 Grad Celsius. Um eine 40-Nanomol-Verdünnung der geglühten Terminatoren herzustellen, tauen Sie sie zuerst auf Eis auf und fügen Sie dann in einem neuen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen 124 Mikroliter nukleasefreies Wasser zu 1 Mikroliter der geglühten Terminatoren hinzu. Zentrifugieren Sie die Proben 30 Sekunden lang bei 10.000x g.

Lagern Sie die Proben nach dem Schleudern auf Eis. Geben Sie in ein neues, für den Thermocycler geeignetes Röhrchen 6 Mikroliter nukleasefreies Wasser. Fügen Sie dann einen Mikroliter kommerziellen DNA-Ligase-Puffer hinzu.

Führen Sie alle folgenden Schritte auf Eis aus. Als nächstes fügen Sie 1 Mikroliter hinzu, der 35 bis 50 Nanogramm pro Mikroliter des pGR-blauen Zielplasmids, 1 Mikroliter der 40 nanomolar geglühten Terminatoren, 0,5 Mikroliter kommerzieller High-Fidelity-BSA1-Restriktionsendonuklease und 0,5 Mikroliter kommerzieller DNA-Ligase enthält. Das Reaktionsgemisch bei 10.000x g für 120 Sekunden zentrifugieren.

Legen Sie dann das Röhrchen direkt in den Thermocycler und führen Sie das folgende Programm aus: 20 Zyklen à 1 Minute bei 37 Grad Celsius, gefolgt von 1 Minute bei 16 Grad Celsius und dann ein Zyklus von 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach dem Lauf frieren Sie die Proben entweder ein und lagern sie bei 20 Grad Celsius oder fahren Sie sofort mit der Transformation fort.

Die Ligationsreaktionen werden unter Verwendung eines geeigneten Transformationsprotokolls in chemisch kompetente E. coli-Zellen umgewandelt. Hier werden JM109-Zellen mittels Zippy-Transformation transformiert.

Verteilen Sie mit einem L-förmigen Glashockeyschläger 25 Mikroliter der transformierten Zellen auf vorgewärmte LB-Agarplatten, die 1 Millimolar Ampicillin und 10 Millimolar Arabinose enthalten. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Inkubieren Sie sie nicht länger als 24 Stunden.

Ampicillin wird schnell abgebaut. Am nächsten Tag inspizieren Sie die Farbe der Völker. Eine erfolgreiche Ligatur sollte im sichtbaren Licht weiß oder gelb sein und unter blauem oder UV-Licht grün fluoreszieren.

Eine erfolglose Ligation erzeugt eine Kolonie, die unter sichtbarem Licht blau gefärbt ist. Für jeden der Terminatoren und Kontrollen wird ein Reagenzglas vorbereitet, das 5 Milliliter sterile LB-Bouillon mit 1 Millimolar Ampicillin und 10 Millimolar Arabinose enthält. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es bei pGR sehr wichtig, sicherzustellen, dass die richtigen Kontrollen vorhanden sind.

Die erste Kontrolle sollte nur LB-Brühe sein. Die nächste Kontrolle sollten Zellen sein, die eine Resistenz gegen Ampicillin aufweisen, aber nicht unter blauem Licht fluoreszieren. Diese dienen als Leerzeichen.

Die nächste Kontrolle ist ein pGR-Plasmid, das nicht geschnitten ist, so dass es keinen Terminator hat, und dies dient als Grundlage für die Stärke des Terminators, und das letzte Ihrer Röhrchen ist für Ihre Probe. Verwenden Sie unter sichtbarem Licht eine sterile Schlaufe, um 2 bis 3 weiße oder gelbe Kolonien zu entnehmen und in die LB-Brühe zu geben. Lassen Sie die Proben auf einem Shaker bei 37 Grad Celsius bei 160 U/min 16 bis 18 Stunden inkubieren.

Am nächsten Tag bestimmen Sie mit einem Spektralphotometer die optische Zelldichte jeder Probe bei 600 Nanometern. Im Allgemeinen wird nach dieser Zeitspanne ein OD 600 von 0,8 bis 1,0 erwartet. Setzen Sie eine sterile 96-Well-Platte in die Haube ein.

Für jede Probe oder Kontrolle sind 3 Vertiefungen mit 199 Mikrolitern steriler LB-Bouillon mit Ampicillin und Arabinose vorzubereiten. Pipettieren Sie anschließend 1 Mikroliter der Zelllösung aus den Nachtbrühen in einzelne Vertiefungen der 96-Well-Platte. Füllen Sie die Platten mit einem atmungsaktiven Deckel und schütteln Sie sie dann 18 bis 20 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 160 U/min.

Am nächsten Tag verwenden Sie ein Plattenlesegerät, um den OD 600 zu bestimmen, der ungefähr 0,5 betragen sollte. Messen Sie auch die G-of-P-Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 395 Nanometern und bei einer Emission von 509 Nanometern. Messen Sie die RFP-Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 575 Nanometern und einer Emission von 605 Nanometern.

Normalisieren Sie mit Excel die Variation des Wachstums, indem Sie die Blütenpracht durch den OD 600 dividieren. Bestimmen Sie nach der Normalisierung die relative Terminatorstärke, indem Sie die GFP-Terminatorfluoreszenz über die GFP-Kontrollfluoreszenz dividieren und durch die RFP-Terminatorfluoreszenz über die RFP-Kontrollfluoreszenz dividieren. Die in den Mikrobakterien Phage bernal 13 identifizierten fixen putativen Terminatoren T1 bis 6 wurden wie in diesem Video beschrieben analysiert.

Diese Ergebnisse zeigen eine relative Fluoreszenz. Alle Ergebnisse wurden unter Verwendung von Zellen mit ungeschnittenem, unmodifiziertem PGR als Kontrolle normalisiert. Es wurde festgestellt, dass T3 ein starker Terminator ist.

Alle Ergebnisse repräsentieren einzelne Kolonien, die in dreifacher Ausfertigung gezüchtet und für die visuelle Darstellung gemittelt wurden. Fehlerbalken stellen Abweichungen zwischen gemittelten Datenpunkten dar. Um die beste Referenzkontrolle für die Quantifizierung der Terminatorstärke zu bestimmen, wurden Rohdaten mit dem ursprünglichen pGR-Plasmid, das keinen Terminator enthält, und pGR-Blau, das mit einer Sequenz kloniert wurde, von der bekannt ist, dass sie kein Terminator ist, verglichen.

Wie hier zu sehen ist, zeigten beide Kontrollen ähnliche Niveaus der GFP- und RFP-Expression und, was noch wichtiger ist, sie erzeugten ähnliche GFP-zu-RFP-Verhältnisse. Alle diese Ergebnisse repräsentieren einzelne Kolonien, die in dreifacher Ausfertigung gezüchtet und für die visuelle Darstellung gemittelt wurden. Einmal gemeistert, kann diese Technik nur 72 Stunden dauern, einschließlich Versand- und Bestellzeit.

Es ist wichtig zu beachten, dass pGR Blau nur bei E.coli wirkt. Da wir uns nur einen kleinen Teil des Terminators ansehen, haben wir außerdem keine Ahnung von anderen regulatorischen Elementen, die die Transkription steuern könnten. Um die Ergebnisse, die Sie mit diesem Protokoll erzielen, mit pGR blue zu verifizieren, können zusätzliche Methoden wie die quantitative PCR verwendet werden.

Zusätzlich kann der pGR-Insert ausgeschnitten und in ein Plasmid Ihrer Wahl ligiert werden.