Ein Maus-Modell der Netzhautischämie-Reperfusionsschaden Durch Erhöhung des intraokularen Druck

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, ein experimentelles Modell der retinalen Ischämie-Reperfusionsverletzung und ihrer pathologischen Folgen zu erstellen. Diese Methode wird häufig verwendet, um die Mechanismen zu untersuchen, die der retinalen Ischämie-Reperfusion zugrunde liegen, sowie um potenzielle therapeutische Ansätze zur Behandlung assoziierter Pathologien zu evaluieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Verletzung verursacht, die stark auf die Augenstrukturen abzielt, während das umgebende Gewebe nur minimal geschädigt wird.

Der Nutzen dieser Technik erstreckt sich auf das Verständnis und die dreimonatige Behandlung multipler Manifestationen von retinaler Ischämie-Reperfusionsverletzung, einschließlich: Entzündungen, oxidativer Stress und Starrfunktionsstörungen in der retinalen neurovaskulären Einheit. Eine Videodemonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die chirurgischen Techniken für die Platzierung von Kanülen ohne visuelle Führung möglicherweise schwer zu reproduzieren sind. Erwärmen Sie vor Beginn des Eingriffs einen leeren Käfig auf dem Tisch.

Führen Sie dann das scharfe Ende des vordurchstochenen Y-Site-Schlauchs des Primärsets in eine Flasche mit 0,1 % Heparin-Natrium ein und hängen Sie den Boden des Heparin-Natriums an eine IV-Pol-Verlängerung. Öffnen Sie die Luftfilterkappe am Schlauch. Heben Sie dann die Heparin-Natriumflasche auf 163 Zentimeter von der Tischplatte bis zur Spitze des Natrium-Heparin-Tropfs an, um einen Heparin-Natrium-Fließdruck von 120 Millilitern Quecksilber zu erzeugen.

Öffnen Sie den primären, vordurchstochenen Y-Site-Schlauch, damit das Heparin-Natrium den Schlauch füllen kann, und verbinden Sie den vordurchstochenen Y-Site-Schlauch des primären Sets mit dem Fünf-Ventil-Verteiler. Verbinden Sie dann mit Luer-Stecker-zu-Luer-Stecker-Schlauchverschraubungen 30-Gauge-Nadeln mit einem halben Zoll an den Verteiler mit fünf Anschlüssen. Führen Sie jede der Nadeln in ein eigenes Zehn-Zoll-Segment eines 30-Gauge-Schlauchs ein.

Brechen Sie dann mit Hämostaten neue 30-Gauge-Half-Inch-Nadelspitzen und führen Sie ihre stumpfen Enden in die offenen Enden des 30-Gauge-Schlauchs ein. Verwenden Sie anschließend Klebeband, um die Nadelschläuche so anzuordnen, dass die mit den inneren Anschlüssen verbundenen Schläuche auf den mit den äußeren Anschlüssen verbundenen Schläuchen positioniert sind, um ein Verheddern des Schlauchs während der Vorderkammerkanülierung zu verhindern. Schalten Sie nun den 0,1%igen Heparin-Natriumfluss zum Fünfventil-Verteiler und zu jedem einzelnen Anschluss für zwei bis drei Minuten ein, um alle Luftblasen zu entfernen.

Schalten Sie dann alle Anschlüsse am Fünfventil-Verteiler aus. Um die Kanülierung durchzuführen, legen Sie nach der Verabreichung der Anästhesie alle Mäuse in den warmen Käfig auf dem Operationstisch, um das Erreichen einer tiefen Anästhesie durch fehlendes Ansprechen auf das Einklemmen der Zehen nach fünf bis zehn Minuten zu bestätigen. Verabreichen Sie dann einen Tropfen Tropicamid zur Pupillenerweiterung und einen Tropfen Proparacain zur Lokalanästhesie in jedes Auge der Tiere und ordnen Sie die Mäuse in der Reihenfolge der Betäubung an, so dass die erste betäubte Maus die erste Maus ist, die kanüliert wird.

Während Sie darauf warten, dass die Augentropfen wirken, bereiten Sie vier Zoll große gerade Stücke Klebeband vor, ziehen Sie vor dem Reißen fest am Klebeband und legen Sie ein Stück Klebeband pro Tier beiseite. Beachten Sie, dass sich das Band nicht kräuselt, wenn Sie nicht fest am Band ziehen. Wenn die erste Maus fertig ist, legen Sie das Tier unter ein Operationsmikroskop.

Schalten Sie dann den ersten 0,1%-Heparin-Natriumanschluss am Fünfventil-Verteiler ein und verwenden Sie eine Pinzette, um ein Auge vorsichtig zu stützen. Führen Sie anschließend die 30-Gauge-Kanülennadel etwa auf halbem Weg zwischen den zonulären Fasern und der Spitze der Hornhaut in die vordere Kammer ein. Achten Sie darauf, dass Sie nicht ein zweites Mal in die Conrea eindringen.

Beachten Sie, dass die Kanüle mit einer sanften Drehbewegung tief in die Vorderkammer eingeführt wird. Drücken Sie nun den 30-Gauge-Schlauch gegen die Tischplatte, um die Bewegung der eingeführten Kanüle zu minimieren, während Sie nach einem Stück Klebeband greifen, und befestigen Sie den Schlauch mit dem Klebeband am Tisch. Sobald der Schlauch gesichert ist, notieren Sie die Startzeit der Operation.

Verwenden Sie das Mikroskop, um zu überprüfen, ob keine Leckage vorliegt und dass das Ischämie-Reperfusionsauge größer ist als das kontralaterale Auge, um das Vorhandensein einer Augendehnung festzustellen. Tragen Sie Hypromellose alle 30 Minuten bis zum Ende des Experiments auf beide Augen auf, um die Hornhaut zu schmieren und eventuelle Mikrolecks abzudichten. Sollte sich ein Tier während des Eingriffs rühren, heben Sie den Schwanz an und verabreichen Sie intraperitoneal eine Ketamin-Auffrischung.

90 Minuten nach der Kanülierung des ersten Tieres ziehen Sie die Kanüle vorsichtig aus der Vorderkammer und befeuchten Sie beide Augen mit Gleitgelee. Wenn die nachfolgenden Kanülen entfernt werden, setzen Sie jede Maus wieder in den Käfig auf dem Operationstisch ein, bis sich die Tiere vollständig erholt haben. Nachdem alle Kanülen entfernt wurden, desinfizieren Sie sie mit Alkoholtüchern.

Verwenden Sie dann eine mit Luft gefüllte 60-Milliliter-Spritze, um das Heparin-Natrium aus dem Fünfventil-Verteiler, den 30-Gauge-Nadeln, den 30-Gauge-Schläuchen und den Kanülen auszustoßen. Spülen Sie anschließend alle Instrumente mit einer 60-Milliliter-Spritze ab, die mit destilliertem Wasser gefüllt ist. Zum Schluss wird das destillierte Wasser mit 60 Millilitern Luft aus allen Materialien ausgestoßen und das desinfizierte und gespülte Gerät für den späteren Gebrauch aufbewahrt.

Die NeuN-Immunmarkierung von neuronalen Kernen zeigt einen signifikanten Verlust von nuronalen Zellen nach Ischämie-Reperfusions-Insult durch konfokale mikroskopische Bildgebung sieben Tage nach Ischämie-Reperfusionsverletzung. Tatsächlich zeigt die manuelle Quantifizierung der NeuN-positiven Zellen in der Kontrolle und der Ischämie-reperfundierten Augen eine Abnahme der Neuronenzahl der Gangelienzellschicht nach einer Verletzung, was auf das Vorhandensein eines Ischämie-Reperfusions-induzierten Zelltods hinweist. Niedrigere a-Wellen- und b-Wellen-Amplituden, die durch Elektroretinographie dokumentiert wurden, deuten ebenfalls auf das Auftreten von Ischämie-Reperfusions-induzierten Beeinträchtigungen der neuronalen Funktion der Netzhaut im Vergleich zu kontrollierten, nicht verletzten Augen hin.

Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie an zehn Tieren in etwa fünf Stunden durchgeführt werden, einschließlich der letzten zwei Stunden, in denen darauf gewartet wird, dass sich die Mäuse von der Narkose erholen. Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, eine tiefe Anästhesie aufrechtzuerhalten. Da eine wirksame Sedierung eine Verschiebung der Kanüle durch Tierbewegungen verhindert.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Elektroretinographie, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Netzhautfunktion zu beantworten. Diese Technik hat es Forschern in den Bereichen Ophthalmologie, Neurowissenschaften und Gefäßbiologie ermöglicht, die retinale Neurovasuclar-Pathogenese und therapeutische Eingriffe bei Nagetieren zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine gezielte Netzhautverletzung durch die Kanülierung der vorderen Augenkammer erzeugen können.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit chirurgischen Instrumenten äußerst gefährlich sein kann und dass bei diesem Eingriff immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. die Verwendung einer wirksamen Entsorgung von scharfen Gegenständen.