Gleichzeitige DNA-RNA-Extraktion aus Küstensedimenten und Quantifizierung von 16S rRNA-Gene und Transkripte von Real-time PCR

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, DNA und RNA mit hoher Ausbeute und Qualität aus marinen Küstensedimenten zu extrahieren und anschließend ribosomale 16S-RNA-Gene und -Transkripte zu quantifizieren. Diese Methode, die die DNA- und RNA-Extraktion aus Meeressedimenten beschreibt, gefolgt von quantitativer PCR, ist ein wichtiger Schritt in der molekularen Analyse der mikrobiellen Häufigkeit und Diversität in der Umwelt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zur gemeinsamen Extraktion von DNA und RNA aus derselben Probe verwendet werden kann, die dann für nachgelagerte Analysen, wie z. B. die quantitative PCR, verwendet werden kann.

Das Verfahren wird von Dr. Enrico Tatti von der NUI Galway und Duncan Sweeney, einem Doktoranden der University of Essex, demonstriert. Um DNA und RNA aus Küstensedimenten nach der Aufbereitung von RNA-freien Materialien und der Entnahme von Küstensedimentproben gemäß dem Textprotokoll gemeinsam zu extrahieren, werden 0,5 Gramm Sediment in ein zwei Milliliter Bead-Lysing-Rohr überführt. Geben Sie 500 Mikroliter CTAB-Phosphatpuffer und 500 Mikroliter Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol in das Röhrchen und invertieren Sie es fünf- bis zehnmal, um die Probe zu homogenisieren.

Vortex bei voller Geschwindigkeit für 2,5 Minuten, bevor er sich 10 Minuten lang bei 16.000 g und vier Grad Celsius dreht. Anschließend wird die oberste wässrige Schicht in einem Abzug extrahiert und in ein neues steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Legen Sie anschließend die Proben auf Eis und fügen Sie 500 Mikroliter eiskalten Chloroform:Isoamylalkohol hinzu.

Dann drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, bis eine Emulsion sichtbar ist und zentrifugieren Sie wie zuvor. Extrahieren Sie die oberste wässrige Schicht in einem Abzug und geben Sie sie in ein neues steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen. Um die Nukleinsäuren auszufällen, fügen Sie dann zwei Volumina 30%ige PEG-Natriumchloridlösung hinzu und mischen Sie gut.

Inkubieren Sie die Proben zwei Stunden lang auf Eis oder lassen Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 mal g bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Mikropipette und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu beschädigen.

Lassen Sie etwa 10 Mikroliter PEG-Lösung in der Tube und fügen Sie einen Milliliter eiskaltes 70%iges Ethanol hinzu. Verwenden Sie nach dem Schleudern der Probe eine Mikropipette, um das Ethanol langsam zu entfernen, und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu berühren. Dann fünf Sekunden lang zentrifugieren und das restliche Ethanol entfernen.

Lassen Sie das Pellet fünf Minuten lang an der Luft trocknen, bevor Sie es mit 50 Mikrolitern DEPC-behandeltem Wasser resuspendieren. Aliquotieren Sie eine 15-Mikroliter-Probe für DNA und 30 Mikroliter für RNA. Der wichtigste Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass sich das DNA/RNA-Pellet beim Entfernen des Überstands nicht löst und kein Ethanolrest zurückbleibt, bevor das Pellet wieder in Wasser suspendiert wird, da dies die nachgelagerte molekulare Reaktion hemmt.

Um die DNA in der RNA-Probe zu verdauen, fügen Sie drei Mikroliter DNase I-Puffer und 1,5 Mikroliter DNase I zum 30-Mikroliter-Nukleinsäurealiquot hinzu. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Mischen Sie das DNase-Inaktivierungsreagenz, indem Sie es 30 Sekunden lang vortexen.

Geben Sie dann 4,8 Mikroliter der Lösung in die Probe und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, wobei Sie gelegentlich auf den Boden der Röhrchen klopfen, um die Lösung zu mischen. Nach dem Schleudern der Probe wird der Überstand, der die RNA enthält, in ein neues Röhrchen überführt, wobei darauf zu achten ist, dass der Fällstoff nicht übertragen wird. Um die RNA-Qualität zu überprüfen, verdünnen Sie zwei Mikroliter RNA, einen von 10, durch Zugabe von 18 Mikrolitern sterilem RNase-freiem deionisiertem Wasser.

Geben Sie in separaten PCR-Reaktionen einen Mikroliter reine oder eine Verdünnung von 10 RNA in ein steriles 0,5-Milliliter-PCR-Röhrchen. Fügen Sie gemäß der Tabelle im Textprotokoll die PCR-Reaktionskomponenten hinzu, um das ribosomale RNA-Gen 16S zu amplifizieren. Dazu gehören eine Positivkontrolle, eine PCR-Inhibitorkontrolle und eine Negativkontrolle.

Führen Sie dann die PCR-Reaktionen mit den folgenden Amplifikationsparametern durch. Um die cDNA des ersten Strangs aus RNA zu erzeugen, geben Sie die Reaktionsreagenzien gemäß dem Textprotokoll in ein 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen. Inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius.

Legen Sie die Proben dann mindestens eine Minute lang auf Eis, bevor Sie sie 10 Minuten lang bei 25 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation fügen Sie die Reagenzien in der hier aufgeführten Tabelle aus dem Textprotokoll hinzu und inkubieren bei 55 Grad Celsius für 50 Minuten. Dann die Reaktion bei 72 Grad Celsius für 10 Minuten inaktivieren.

Nach der Generierung von DNA- und RNA-Standards für die qPCR gemäß dem Textprotokoll werden DNA- und cDNA-Proben, Standards und qPCR-Reagenzien aus der Umgebung auf Eis aufgetaut. Verdünnen Sie die Nukleinsäurestandards und bereiten Sie eine von 10 Verdünnungen der Umwelt-DNA und cDNA von pur über 10 bis minus drei vor. Machen Sie einen Mastermix für die Gesamtzahl der Reaktionen plus 10% und mischen Sie gut.

Geben Sie 19 Mikroliter Mastermix und einen Mikroliter Template in dreifacher Ausfertigung in eine optische qPCR-Platte mit 96 Vertiefungen in jede Vertiefung. Verwenden Sie eine optische qPCR-Abdeckung, um die Platte abzudecken. Zentrifugieren Sie dann die Platte kurz und laden Sie sie in den Heizblock der qPCR-Maschine.

Öffnen Sie als Nächstes die qPCR-Manager-Software, klicken Sie dann auf die Registerkarte Protokoll, klicken Sie auf Neu erstellen und fügen Sie die folgenden Amplifikationsbedingungen hinzu. Stellen Sie das Probenvolumen auf 20 Mikroliter ein, klicken Sie auf OK und speichern Sie das Protokoll. Wählen Sie nun die Registerkarte Platte.

Klicken Sie dann unter "Ausgewählte bearbeiten" auf "Fluorophor auswählen". Fügen Sie den Reporterfarbstoff für die entsprechende Sonde hinzu und klicken Sie auf OK. Markieren Sie Vertiefungen, die die Standards enthalten, und wählen Sie dann im Menü "Probentyp" die Option "Standard" aus. Wählen Sie Serie replizieren aus, um die Replikationsgröße in drei zu ändern, und klicken Sie auf Anwenden.

Wählen Sie Verdünnungsreihe, um die berechnete Anfangskonzentration für die Standardkonzentration hinzuzufügen. Geben Sie den Verdünnungsfaktor von 10 an, wählen Sie Verringernd oder Steigend aus, je nachdem, in welcher Reihenfolge die Standardkurve zur Platte hinzugefügt wurde, und klicken Sie auf Anwenden. Markieren Sie die Well-Positionen, die die unbekannten Proben enthalten, und wählen Sie Unbekannt aus dem Dropdown-Menü Probentyp aus.

Wählen Sie "Serie replizieren" aus, ändern Sie "Replikationsgröße" in "drei" und klicken Sie dann auf "Anwenden". Bearbeiten Sie unter Beispielname die Beispielnamen, und wiederholen Sie das Verfahren für keine Vorlagen-Kontroll-Wells. Klicken Sie dann im Feld Platteneditor auf OK, und speichern Sie die Datei.

Klicken Sie dann auf Ausführung starten. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, wählen Sie die Registerkarte Quantifizierung aus, um die Standardkurve, die Standardkurvendeskriptoren und die Amplifikationsdiagramme anzuzeigen. Wählen Sie abschließend die Registerkarte Quantifizierungsdaten für Cp-Werte und die entsprechende Startmenge für Gene unbekannter Proben.

Bestimmen Sie die Anzahl der Genkopien pro Gramm Nassgewichtssediment gemäß dem Textprotokoll. Wie in diesem Gelbild gezeigt, liefert eine erfolgreiche Nukleinsäureextraktion klare DNA- und RNA-Banden, bei denen neben einer genomischen DNA-Bande mit hohem Molekulargewicht auch scharfe ribosomale 23S- und 16S-RNA-Banden sichtbar sind. Diese Abbildung zeigt, dass, wenn ein zehnfacher Verdünnungsbereich korrekt vorbereitet und amplifiziert wird, um eine Standardkurve für die qPCR-Reaktion zu erzeugen, ein Unterschied von 3,3 Zyklen zwischen den einzelnen Standardverdünnungen zu sehen ist.

Es ist wichtig, Kreuzungspunkt- oder Cp-Werte aus dem Steuerelement ohne Vorlage (No Template) (NTC) zu melden, falls vorhanden. In diesem Fall wird ein Cp-Cutoff für Standard- und unbekannte Proben von 3,3 Zyklen oder eine Logarithmusfaltung oberhalb des Cp-Wertes des NTC wie zuvor beschrieben auferlegt. Hier wurden Umweltprobenamplifikationen von reinen Verdünnungen von 10 auf minus eins, 10 auf minus zwei und 10 auf minus drei durchgeführt.

Die reine Probe amplifizierte nicht und die Cp-Werte von 10 bis minus eins bis 10 bis minus drei Verdünnungen betrugen 24,12, 26,02 bzw. 28,40. Wie in dieser Grafik zu sehen ist, sind Standardkurvendeskriptoren, einschließlich der R-Quadrat-Werte von 0,99 und PCR-Effizienzen im Bereich von 90 bis 110 %, wünschenswert. In diesem Experiment betrug der NTC-Cp 30,5 und es wurde ein negativer Cp-Grenzwert von 27,2 auferlegt.

Die Umrechnung der Genhäufigkeiten in pro Gramm Nassgewichtssediment führte zu 2,5 mal 10 zur siebten und 7,1 mal 10 zur siebenten, für die 10 zu minus eins bzw. 10 zu minus zwei Verdünnungen. Der Verdünnungs-Cp von 10 bis minus drei war größer als der NTC-Cutoff. In diesem Fall wurde die 10 bis minus zwei als optimale Template-Verdünnung gewählt.

Bei diesem Verfahren ist zu bedenken, dass RNA schnell abgebaut werden kann, daher ist es wichtig, die Probe auf Eis zu halten und Handschuhe zu tragen, um eine ständige Kontamination mit RNase zu vermeiden. Vergessen Sie nicht, dass wir mit Phenol-Chloroform und Isamylalkohol arbeiten, und das kann äußerst gefährlich sein. Und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Laborkitteln, Handschuhen und Schutzbrillen sowie das Arbeiten unter einer chemischen Haube sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man DNA und RNA extrahiert und Gen- und Transkripthäufigkeiten in marinen Küstensedimenten quantifiziert. Denken Sie daran, dass dieses Verfahren leicht zur Extraktion von DNA und RNA und zur Quantifizierung einer Reihe von Genzielen aus den meisten Umweltproben, einschließlich des Bodens, verwendet werden kann.