Name: Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie das Neutrophilen-Priming in lebenden Tieren mittels intravitaler Bildgebung und fluoreszenter Reporter in Echtzeit visualisieren. Diese Methode ermöglicht neue Einblicke in Immunantworten bei seltenen Erkrankungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren haben keine Danksagungen.

Alle Tierversuche sind in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien und genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Toledo durchgeführt. 1. Phänotypisierung von Pil1-DsRed Mäuse HINWEIS: Nachkommen werden von der Zucht heterozygot Pil1-DsRed Mäuse mit Wildtyp (WT) C57BL6 Mäuse erzeugt. Drei bis vier Wochen alte Welpen werden als bereit für die Phänotypisierung. Submandibular Blutung der Mäuse folgt einem festgelegten Protokoll mit geringfügigen Änderungen 23. <ol><li> Isolation von weißen Blutkörperchen aus dem Vollblut von Maus Pups <ol><li> In 20 ul Heparin zu je 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Erwerben Sie einen Welpen aus dem Käfig. Notieren Sie sich die Erkennungsmarke des Welpen. Es ist nicht erforderlich, Welpen, bevor sie aus der submandibular Vene Blutentnahme zu betäuben. </li><li> Halten Sie Welpe durch Hals Genick und stechen Sie die submandibular Vene in the Backentasche mit einem 5 mm Lanzette verwenden. Tragen Sie eine ausreichende Kraft, um eine kleine Einstich zu schaffen, so dass Tropfen Blut aus dem Einstich ausstrahlen. Verwenden Sie für jeden Welpen eine neue Nadel. </li><li> Sammeln Sie 3 bis 5 Tropfen Blut pro Welpe in einem Heparin-haltigen Mikrozentrifugenröhrchen. Reinigen Sie die Einstichstelle und Druck auf die Hämostase erleichtern. </li><li> Setzen Sie Welpen in neuen Käfig und beobachten für 30 Minuten vor dem Käfig in die Tieranlage zurück. </li><li> Sammeln von Blut aus erwachsenen Mäusen eines bekannten Phänotyp als positive und negative Kontrollen. </li><li> Hinzufügen 500 ul rote Blutkörperchen lysierende Puffer zu jedem Röhrchen, Wirbelrohre, und Inkubieren während 5 - 10 min auf Eis. </li><li> Langsam 400-500 ul fötales Rinderserum (FBS) unterhalb der Zellsuspensionen in jedes Röhrchen. Eine klare Schnittstelle zwischen der oberen Schicht Zellsuspension und der unteren Schicht von FBS zu beachten. </li><li> Cap Rohre und Zentrifuge Proben bei 1500 × g für 5 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.1.7 - 1.1.9 auf Pelzther entfernen roten Blutkörperchen. Wiederholen Sie nicht, wenn die Lyse das erste Mal, ausreichend ist. Das Pellet sollte schwierig sein, nach dem Zentrifugieren zu erkennen. </li></ol></li><li> Lipopolysaccharide (LPS) Stimulation und Kultur <ol><li> Die Zellen in 200 ul kompletten Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium. </li><li> Übertragen die Zellsuspension auf eine Durchflusszytometrie Röhre. </li><li> Machen LPS Arbeitslösung von 10 ul LPS-Stammlösung Mischen (1 mg / ml) mit 990 ul komplettem RPMI-1640-Medium. </li><li> Geben Sie 20 &amp; mgr; l von 10 &amp; mgr; g / ml LPS-Arbeitslösung zu 200 &amp; mgr; l Zellsuspension. </li><li> Kappenröhrchen lose und inkubieren Proben für 4 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol></li><li> Durchflusscytometrieanalyse <ol><li> Öffnen Sie das Datenerfassungsprogramm für die Durchflusszytometrie. Richten Sie Erwerb Vorlage vor Erwerb zu probieren. </li><li> Klicken Sie auf den Dot-Plot-Werkzeug in der Werkzeugpalette. Zeichnen Sie ein forward Streuung (FSC) vs Seitenstreuung (SSC) Plot. Stellen Sie die FSC und SSC Spannungsparameter in eine lineare Skala. </li><li> Wählen Sie die niedrigsten Schwellen von FSC und SSC durch das Zytometer erlaubt. Bewerben Schwellen 200 und 50 für FSC und SSC sind. </li><li> Innerhalb des FSC vs SSC Plot, ein Gate G1 ziehen, die Monozyten, Granulozyten und dendritischen Zellen und schließt Schmutz, rote Blutkörperchen und Lymphozyten enthält. </li><li> Klicken Sie auf das Histogramm-Werkzeug in der Werkzeugpalette. Zeichnen Sie ein FL2 (rote Fluoreszenz-Kanal) Histogramm. Verwenden Sie einen negativen Kontrollprobe die Basislinie von FL2 Signale und eine positive Kontrollprobe zu setzen ein Tor zu zeichnen, um alle DsRed positive Ereignisse aufzunehmen. </li><li> Auf der Fluidik Bedienfeld des cytometer, stellen Sie die Flüssigkeit Modus auf &quot;RUN&quot; und der Fließgeschwindigkeit auf &quot;HALLO&quot; (ca. 60 &amp; mgr; l / min). Erwerben 10.000 Ereignisse pro Probe. </li><li> Bestimmen Pup Phänotyp durch den Prozentsatz der DsRed-positiven Zellen aus der G1-Gate zu messen. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Die Induktion von Hautentzündung in Pil1-DsRed Mäuse <ol><li> Anästhesieren Maus durch intraperitoneale (ip) Injektion eines Anästhetikums Cocktail, enthaltend 100 mg / kg Ketamin, 10 mg / kg Xylazin und 1 mg / kg Acepromazin. Adäquat narkotisierten Mäusen zeigen keine Hinterpfote Rückzug bis Fuß Prise. </li><li> Tragen Sie Haarentfernungs-Creme auf die dorsale Oberfläche beider Ohren der Maus. Warten Sie 30 Sekunden bis 1 Minute. Wischen Sie Ohr Oberfläche mit Wasser benetzten Baumwolle und an der Luft trocknen. </li><li> Messen Sie die Ohrdicke Mikrometer verwendet und ersetzen Maus in einem separaten Käfig. Beachten Sie, bis aus der Narkose (~ 15 - 30 min). Zu lösen, indem die Haarentfernung Produkt induzierte Hautentzündung, lassen Sie die Maus für 3 Tage ruhen, bevor weitere Experimente durchgeführt. </li><li> Bereiten 1,25% (w / v) OX von in 1 ml Aceton 16,7 mg OX Lösen und Mischen 750 ul OX / Aceton-Lösung mit 250 ul Olivenöl. Bereiten Trägerlösung 750 ul Aceton mit 250 durch Mischen &amp;# 181; l Olivenöl. </li><li> Re-betäuben Maus durch ip-Injektion von Anästhetikum Cocktail (2.1). Messen Sie die Ohrdicke wie zuvor. </li><li> Bewerben 12,5 ul von 1,25% OX auf jeder Seite des rechten Ohres. Bewerben 12,5 ul Aceton / Olivenöl Fahrzeug Lösung auf jeder Seite des linken Ohr. </li><li> Halten Sie die Maus von Käfiggenossen trennen, bis sie vollständig Beleidigung seine Ohren von anderen Mäusen zu verhindern gewonnen, dann ersetzen Sie die Maus in ihren ursprünglichen Käfig und zurück zur Tierhaltung Möglichkeiten. HINWEIS: Haarentfernung in kleinere Hautentzündung nach durch Änderung der Ohrdicke führen kann. Diese kleine Entzündung wird 3 Tage später gelöst durch normale Ohrdicke bestätigt. Nach der topischen Anwendung für 24 Stunden, OX-behandelten Ohren zeigen signifikant (p &lt;0,01) im Vergleich Fahrzeuglösung allein behandelten Ohren Schwellung. </li></ol> 3. Die Markierung von Neutrophilen in Pil1-DsRed Mäuse HINWEIS: In - vivo - Markierung von Neutrophilen durch eine niedrige Dosis fluorescence-konjugiert Neutrophilen-spezifischen mAb folgt eine kürzlich entwickelte Protokoll 19. Retro-Orbital - Injektionen werden nach einem festgelegten Protokoll mit einigen Modifikationen 24 durchgeführt. <ol><li> Bereiten anti-Ly6G mAb Arbeitslösung durch 10 ul 0,5 mg Verdünnung / ml Alexa Fluor 647-konjugiertem anti-Ly6G mAb (Klon 1A8) in 90 &amp; mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). </li><li> Transfer von 100 &amp; mgr; l anti-Ly6G mAb-Arbeitslösung (50 ug / ml) in eine U-100 Insulin-Spritze mit 28 Gauge-Nadel. </li><li> Anesthetize einen erwachsenen Pil1-DsRed Maus durch ip-Injektion des zuvor Anästhetikum Cocktail beschrieben (2.1). Setzen Sie den narkotisierten Maus Bauch auf einer sauberen Arbeitsplatte nach unten. </li><li> Wenden Sie sanft nach unten Druck auf die Haut dorsalen und ventralen einer Maus Auge teilweise den Augapfel aus der Steckdose herausragen. </li><li> Setzen Sie vorsichtig die Nadel, Fase nach unten, in einem Winkel von ca. 30 ° am inneren Augenwinkel in die Retro-OrbitalSinus. fühlen Druck, Durchdringung und erleichtert Widerstand, sobald die Nadel Einsätze in den Sinus Der Bediener kann: Hinweis. </li><li> Langsam und gleichmäßig injizieren 100 ul anti-Ly6G mAb-Arbeitslösung (5 ug mAb / Maus / Injektion) in der Maus. Entfernen Sie schnell die Nadel. Eine kleine Menge der Blutung schlägt eine erfolgreiche Injektion. </li><li> Sofort 1,25% OX und Fahrzeug-Lösung auf der rechten und linken Mausohren gelten. </li><li> Nach 8 Stunden, zu verwalten 100 ul frisch anti-Ly6G mAb Arbeitslösung vorbereitet (5 ug mAb / Maus / Injektion) über retro-orbitale Injektion in die gleiche Maus. </li><li> Der Blutgefäße, unmittelbar vor der Bildgebung zu visualisieren, zu verwalten 100 ul 30 mg / ml Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) -konjugiertem Dextran (150 kDa) durch retroorbitale Injektionszwecke. </li></ol> 4. Intra Imaging von Neutrophilen-Priming in Pil-1-DsRed Mäuse <ol><li> Anästhesieren Maus mit ip-Injektion von Anästhetikum-Cocktail (2.1).0; Bewerben veterinär Salbe Maus Augen Trockenheit während der Narkose für die Bildgebung zu verhindern. <ol><li> Vorbereitung 1 ml Halbdosis Anästhetikum Cocktail von 500 ul ursprünglichen Anästhetikum Cocktail mit einem gleichen Volumen von PBS verdünnt. </li><li> Übertragen halbe Dosis Betäubungsmittel Cocktail zu 1 ml Spritze mit einem Schmetterling 27-Gauge-Nadel. </li><li> Setzen Sie die Nadel von Schmetterling in Maus Bauch intraperitoneal und befestigen Sie die Schmetterlingsflügel auf den Bauch durch Abkleben. </li></ol></li><li> Legen Sie ein Deckglas in der Mitte der Abbildungsstufe. Kleben der Kanten des Deckglases es in Position zu halten. </li><li> Geben Sie einen Tropfen PBS auf der ventralen Oberfläche des Mausohr sowie auf dem Deckglas. </li><li> Position narkotisierten Maus mit seinem Ohr über das Deckglas. Montieren Sie die Spitze des Ohres, Rückenseite nach unten, gebildet, indem das Ohr zwischen dem Deckglas und einem Glasträger, auch an Ort und Stelle über die Tape gehalten. </li><li> Schalten Sie auf einem Multi-Laser-Fluoreszenz-Konfokalmikroskop und alle damit verbundenen equipment. Schalten Sie die Raumbeleuchtung Umgebungslicht zu minimieren. </li><li> Öffnen Sie die Bildaufnahme-Software. Wählen Sie die Laserkanäle für den Nachweis von Fluoreszenzfarbstoffen im Dye-Listenmenü. </li><li> Stellen Sie den Fokus auf das entzündete Ohr Haut durch Beobachtung der grünen Signale aus den Blutgefäßen und rote Signale von den DsRed + Zellen durch Okular. </li><li> Führen Sie einen schnellen Scan mit Scangeschwindigkeit von 2 &amp; mgr; s / Pixel und einer Auflösung von 512 × 512 Pixeln. Wählen Sie eine Pseudo für jeden Kanal in der Live-View-Menü. Stellen Sie den Fokus Knopf, um das Ende zu setzen und den Ort der Scanvorgang zu starten. </li><li> Führen Sie langsam Scans mit Scangeschwindigkeit von 4 - 8 &amp; mgr; s / Pixel und einer Auflösung von 800 × 800 oder 1024 × 1024 Pixel. Stellen Sie die Hochspannung, Verstärkung und Offset für jeden einzelnen Kanal der Intensität der Signale zu maximieren, während die Sättigung (rote Punkte) zu vermeiden. Es sollte nur wenige rote Pixel in jedem Kanal sein. </li><li> Erstellen dreidimensionaler Bildsätze durch Abtasten the Ohr Haut oberflächlich in das Stratum corneum beginnen und nach unten mit x, y, z Volumen von 317 &amp; mgr; m × 317 &amp; mgr; m × 30 &amp; mgr; m (40X-Objektiv) voran, 635 &amp; mgr; m × 635 &amp; mgr; m × 30 &amp; mgr; m (20fach-Objektiv), oder 1270 &amp; mgr; m × 1270 &amp; mgr; m × 50 &amp; mgr; m (10X-objektiv) bei 2 &amp; mgr; m z-Schritten. HINWEIS: Das Stratum corneum die äußerste Schicht der Epidermis ist und leicht lokalisiert auf seine starke Autofluoreszenz-Signal basieren können. </li><li> Im Zeitraffer-Imaging Experimente, Aufzeichnung dreidimensionale Bilder alle 2 oder 4 min für bis zu 8 Stunden. </li><li> Intermittently, wie Maus aus der Narkose zu erholen beginnt, basierend hinwies, die die Zuckungen Whiskers auf der Beobachtung, verwalten von 5 bis 10 &amp; mgr; l halbe Dosis Narkose Cocktail durch Butterfly-Nadel. HINWEIS: der Anästhesie Dosis vorsichtig - Überdosis verursachen Maus Tod. Alternativ könnte in einem Gefäß Inhalationsanästhesie an der Maus für kurzfristige Anästhesie und angewendet werdenNasenkonus könnte für die Langzeitbilderzeugung verwendet werden. </li><li> Entfernen Sie die narkotisierten Maus von der Bühne bei der Abbildung vollständig ist. Nehmen Sie Band und entfernen Butterfly-Nadel aus dem Bauch der Maus. Bringen Sie die Maus in einen separaten Käfig im Tier Gehäuse Möglichkeiten. HINWEIS: Für kurzfristige Bildgebung (&lt;1 Stunde), Mäuse erholen vollständig aus der Narkose schnell in 1-3 Std. Für die Langzeitbildgebung (~ 8 h), erholen Mäuse langsam, mit einer typischen Erholungszeit von 12 bis 16 Stunden. Somit ist die orale Verabreichung Wasser zumindest mehrmals während der Erholungsphase empfohlen schwerer Dehydrierung zu verhindern. </li><li> Prozess Imaging - Datensätze, einzelne Zellen verfolgen, erzeugen Migrationspfade, und berechnen Sie die Direktionalität und die Geschwindigkeit der Zellmigration unter Verwendung von Bildanalysesoftware 25. </li></ol>

<ol><li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils at work.</a> Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).</li>
<li>Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Immunol.+Ther.+Exp.+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the innate immune response.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).</li>
<li>Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+priming%3A+pathophysiological+consequences+and+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Sci.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms.</a> Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).</li>
<li>El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+of+the+neutrophil+NADPH+oxidase+activation%3A+role+of+p47phox+phosphorylation+and+NOX2+mobilization+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane.</a> Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).</li>
<li>Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+imaging+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Cellular imaging in rheumatic diseases.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).</li>
<li>Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+microbial+immunity+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues.</a> Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).</li>
<li>Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+immunoimaging--deeper%2C+bigger%2C+more+precise%2C+and+definitively+more+colorful%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).</li>
<li>Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+biology+in+live+animals%3A+ready+for+prime+time%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cell biology in live animals: ready for prime time.</a> J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+recruited+by+chemoattractants+in+vivo+induce+microvascular+plasma+protein+leakage+through+secretion+of+TNF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF.</a> J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).</li>
<li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+S+inhibits+neutrophil+recruitment+during+the+early+stages+of+Streptococcus+pyogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-modal+imaging+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+transgenic+reporter+mice+reveals+the+dynamic+nature+of+inflammatory+changes+during+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression.</a> J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).</li>
<li>Slaba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+Dynamic+Platelet-Neutrophil+Response+in+Sterile+Liver+Injury+and+Repair+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice.</a> Hepatology. , (2015).</li>
<li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li>
<li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catchup%3A+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li>
<li>Matsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+IL-1beta+production+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of IL-1beta production in skin.</a> J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).</li>
<li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li>
<li>Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+imaging+for+the+in+vivo+tracking+of+high-speed+vesicle+transport+in+mouse+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils.</a> Sci. Rep. 3, (1913).</li>
<li>Sreeramkumar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+scan+for+activated+platelets+to+initiate+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation.</a> Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+priming+occurs+in+a+sequential+manner+and+can+be+visualized+in+living+animals+by+monitoring+IL-1beta+promoter+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation.</a> J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).</li>
<li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+simple%2C+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice).</a> Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+time-lapse+microscopy+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration).</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li>
<li>Mizumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+immunostimulants+by+dendritic-cell-based+functional+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening.</a> Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).</li>
<li>Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+proteins%3A+selling+cytokines+by+the+pound%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound.</a> Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).</li>
<li>Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+ATP-+and+LPS-induced+IL-1beta+release+in+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).</li>
<li>Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+domoic+acid+differ+between+in+vivo+and+in+vitro+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Drugs%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice.</a> Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).</li>
<li>Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+role+of+G-CSF+in+the+production%2C+survival%2C+and+release+of+neutrophils+from+bone+marrow+into+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation.</a> Blood. 100 (3), 854-861 (2002).</li>
<li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).</li>
<li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assessment+of+confocal+microscopy+slide-based+systems%3A+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability.</a> Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).</li>
<li>Hogan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+on+the+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics.+Int%22%5BJournal%5D)">Focusing on the experiment.</a> Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).</li>
<li>Kabashima, K., Egawa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+cutaneous+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).</li>
<li>Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+epidermal+keratinocytes+and+dermal+vasculatures+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dermatol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy.</a> J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).</li>
<li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).</li>
<li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte.

Das Ziel dieser Studie ist es, eine Technologie zur Überwachung des Prozesses der Neutrophilen-Priming in lebenden Tieren zu entwickeln, die noch nicht von den derzeit verfügbaren Techniken erfüllt. Um dieses Ziel zu erreichen, drei etablierten Methoden durchgeführt werden : 1) Induktion von Hautentzündung in IL-1β Promotor getriebene DsRed Reportermäusen als Maß für die Grundierung, 2) in vivo - Markierung von Neutrophilen mit niedrigen Dosen von Fluoreszenz-konjugiertem anti-Ly6G mAb und 3) intravital konfoka...

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden und kurzlebig Leukozyten im Umlauf. Sie sind schnell zu den Standorten der Infektion oder Verletzung rekrutiert, wo sie als professionelle Phagozyten durch Freisetzung von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffzwischenprodukte zusammen mit Granulat enthält , um antimikrobielle Peptide und Proteasen 1 dienen. Während ihrer Rekrutierung, sind Neutrophile &quot;grundiert&quot; durch verschiedene Mittel , einschließlich mikrobielle Produkte, Lockstoffe, und inflammatorischen Zytokinen, was zu einer deutlich verbesserten Phagozyten Funktionalität bei der Ankunft an einem Ort der Entzündung 2. Die Mechanismen von Neutrophilen Priming extensiv wurden in vitro untersucht 3,4; jedoch dynamische Überwachung des Prozesses in vivo ist bisher nicht möglich gewesen. Vor kurzem hat intravital Bildgebung eine wichtige Technik zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Dynamik von biologischen Prozessen in lebenden Organismen werden. Intravital Bildgebung kann über herkömmliche Einphotonenanregung Mikroskopie (zB konfokale) oder Multiphotonen - Mikroskopie Ansätze 5 durchgeführt werden. Im Laufe der Zeit wurden in dieser Technik erzielt deutliche Verbesserungen erhöhte Bildauflösung ermöglicht, eine verbesserte Bildtiefe, verringerte Gewebelichtschäden und eine verbesserte Bildstabilisierung 6,7. Aufgrund seiner einzigartigen Fähigkeit , dynamische Visualisierung von Zellmigration und Interaktion im Laufe der Zeit zu ermöglichen, hat Intravitalmikroskopie wurde 8 verschiedenen Bereichen der Studie in der Immunologie ausgiebig angewendet. Intravital Imaging ermöglicht Immunologen besser zu verstehen und in lebenden Tiermodellen Immunreaktionen sowohl auf zellulärer und molekularer Ebene zu kontextualisieren. Jüngste Fortschritte in der transgenen sowie Knock-in-Reporter Mäusen haben nützliche Tools zur Verfügung gestellt, die dynamischen Verhalten von Neutrophilen in lebenden Tieren, die für die Überwachung. Lysozym M Promotor getriebene Enhanced Green Fluorescent Protein Knock-inMäuse wurden Motilität von Neutrophilen, Monozyten zu charakterisieren und Makrophagen während verschiedener Entzündungsprozessen einschließlich Extravasation, bakterielle Infektion und sterile Entzündung 9-15 breit verwendet. Ferner wurden bei der Untersuchung der Aktivitäten der Neutrophilen extrazellulären regulierten Mitogen - Kinase und Proteinkinase A im entzündeten Darm 16 eingesetzten transgenen Mäusen eine zytoplasmatische Fluoreszenz - Resonanz - Energie - Transfer - Biosensor zum Ausdruck. Ein Mausmodell mit hoher Spezifität für die Fluoreszenz die Expression in Neutrophilen ist die Catchup Knock-in - Maus, die wie auch das fluoreszierende Protein tdTomato Cre - Rekombinase produziert, die sich zur Expression von lymphocyte antigen 6G (Ly6G) 17 gekoppelt ist. Visualisierung von Ly6G-defizienten Neutrophile über diesem Modell hat gezeigt , dass diese Zellen normale Funktionalität in einer Vielzahl von sterilen oder infektiösen in vivo Entzündungs ​​Kontexten ausüben. Transgene Mäuse, die DsRed fluoreszierende p ausdrückenrotein Gen unter der Kontrolle des Maus-interleuikin-1β (IL-1β) -Promotor (Pil1-DsRed) verwendet wurden, um die motile Verhalten von IL-1β produzierenden Zellen sichtbar zu machen - angenommen Neutrophile, inflammatorische Monozyten einschließen und aktivierte Makrophagen - Schwellen in entzündeter Haut 18. In vivo als Alternative dienen zur Verfolgung der zellulären und molekularen Verhalten von Neutrophilen in entzündeten Geweben Markierung kann. Nach intravenöser Injektion von niedrigen Dosen von fluoreszenzmarkierten anti-Gr-1 monoklonalen Antikörpers (mAb), die Rekrutierung Kaskade von Gr-1 + Neutrophilen in Maushautläsionen infiziert mit Staphylococcus aureus 19. In - vivo - Verabreichung von Konjugaten wurde enthaltend visualisiert Streptavidin- konjugiertes 705 nm quantum dots und biotinyliertes anti-Ly6G mAb spezifisch etikettieren zirkulierende Neutrophile 20. Darüber hinaus Endozytose solcher Konjugate in neutrophil Vesikel ermöglicht Verfolgung von Transporthochgeschwindigkeits Vesikel in Neutrophilen in das Interstitium migrieren. In vivo Markierung mit Fluoreszenz-konjugierte Antikörper gegen P-Selektin - Glykoprotein - Ligand-1 (PSGL-1), L-Selectin (CD62L), Integrin &amp; agr; M (CD11b ) und Chemokin (CXC - Motiv) Rezeptor 2 (CXCR2) in einem TNF-induzierten Entzündungsmodell wurde während der frühen Entzündung 21 die Regulationsmechanismen im Spiel erläutert. Polarisiert Neutrophilen herausragen PSGL-1 angereicherte Uropoden mit CD62L sich auf aktivierten Blutplättchen zu interagieren, was bei der Umverteilung von CD11b und CXCR2, Rezeptoren, die die Migration von Neutrophilen treiben und initiieren die Entzündung. IL-1β ist eines der Gene , die Signatur 22 in grundierten Neutrophilen erhöht ist. In Pil1-DsRed Reporter - Mäuse, DsRed Fluoreszenzsignale (dh., Die Aktivierung von IL-1β - Promotor) positiv mit IL-1β - mRNA - Expression und IL-1β Protein - Produktion korrelieren. &lt;sup&gt; 18 Zur Überwachung wurde der Prozess der Neutrophilen - Grundierung, ein Intravitalmikroskopie - Verfahren mit Oxazolon (OX) beteiligt Induktion von Hautentzündung entwickelt im Pil1-DsRed Mausmodell folgende in vivo - Markierung von Neutrophilen mit Fluoreszenz-konjugierten anti-Ly6G mAb. Über dieses Modell ist es möglich, das Verhalten und die Funktion der neutrophilen Granulozyten grundiert in Tiermodellen von verschiedenen Krankheiten und Störungen zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Heparin-Natrium</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-540-31</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysingpuffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminhydrochlorid</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>LLOYD Labor</td><td>NADA #139-236</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazin</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>ANADA 200-361</td><td></td></tr><tr><td>Haarentfernungscreme</td><td>Kirche & Dwight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td></td></tr><tr><td>Oxazolon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0753</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anti-Maus Ly6G Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>U-100 Insulinspritze mit 28 G Nadel</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran, 150 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74817</td><td></td></tr><tr><td>Schmetterlingsinfusionsset (27 G Nadel)</td><td>BD</td><td>387312</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur Zytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro Software</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging von neutrophilen priming mit il-1β promoter-driven dsred reporter mäuse

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im menschlichen Blutkreislauf und sind an Entzündungsstellen schnell rekrutiert. Priming ist ein kritisches Ereignis, das die phagozytischen Funktionalität von Neutrophilen erhöht. Obwohl umfangreiche Studien die Existenz und die Bedeutung der neutrophilen Priming während der Infektion und Verletzungen enthüllt haben, bedeutet , diesen Prozess der Visualisierung in vivo nicht erreichbar gewesen. Das Protokoll bereitgestellt wird, ermöglicht die Überwachung des dynamischen Prozesses der Neutrophilen in lebenden Tieren Priming durch drei Methoden kombinieren: 1) Signal DsRed reporter - verwendet als ein Maß für Priming 2) in vivo - Markierung von Neutrophilen - erreicht durch Injektion von Fluoreszenz-konjugiertem anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoklonaler Antikörper (mAb) und 3) intravital konfokale Bildgebung. Oxazolon-induzierte Mausohr Hautentzündung, geeignete Sedierung von Tieren, wiederholte Injektionen von anti-Ly6G mAb und zurück: Mehrere wichtige Schritte sind in diesem Protokoll beteiligtention der Fokusdrift während der Bildgebung. Obwohl einige Einschränkungen beobachtet, wie die Grenze der kontinuierlichen Bilderzeugungszeit (~ 8 h) in eine Maus und das Austreten von Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran aus den Blutgefäßen in der Entzündungszustand liefert dieses Protokoll ein Grundrahmen für die intravital Abbilden grundierten Neutrophilen Verhalten und Funktion, die zur Prüfung von anderen Immunzellen in der Maus Entzündungsmodellen leicht erweitert werden kann.

Screening von Pil1-DsRed-Mäusen basiert auf der phänotypischen DsRed Fluoreszenzsignal durch ihre peripheren Blutleukozyten mittels Durchflusszytometrie durchgeführt produziert. LPS - Stimulation bekannt ist IL-1β - Produktion in myeloischen Zellen , einschließlich Neutrophile, Monozyten und dendritischen Zellen 26-28 induzieren. Somit werden isolierte Leukozyten 4 h mit LPS inkubiert vor der Zytometrie Analyse fließen. Myeloischen Zellen für die Zirkulation auf Basis von Zell...

Dieses aktuelle Protokoll verwendet Fluoreszenzreporter, In-vivo-Markierung und intravitale Bildgebungstechniken, um die Überwachung des dynamischen Prozesses des Neutrophilen-Primings bei lebenden Tieren zu ermöglichen.

Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Technologie zur Überwachung des Prozesses des Neutrophilen-Primings bei lebenden Tieren vorzustellen. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, wie z.B. die Visualisierung des Verhaltens und der Funktion des Primings der Neutrophilen in Tiermodellen der seltensten Krankheiten und Störungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie drei etablierte Methoden kombiniert, darunter fluoreszierende Reporter bei der Virusmarkierung und Intravitalbildgebung.Züchten Sie heterozygote pIL1-DsRed-Mäuse mit sechs Wildtyp-Mäusen vom Typ C57Black. Mit drei bis vier Wochen phänotypisieren Sie ihre Jungen. Bereiten Sie für jeden Welpen ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 20 Mikrolitern Heparin vor.Um Blut zu sammeln, halten Sie einen Welpen am Hals fest und stechen Sie mit einer 5-Millimeter-Lanzette in die Unterkiefervene in der Wangentasche. Es ist nur eine kleine Punktion erforderlich. Sammeln Sie drei bis fünf Tropfen Blut pro Röhrchen.Achten Sie nach der Entnahme darauf, die Blutung zu stoppen und die Tiere 30 Minuten lang zu beobachten, bevor Sie sie in die Tiereinrichtung zurückbringen. Geben Sie zu jedem Probenröhrchen 500 Mikroliter Lysierungspuffer für rote Blutkörperchen. Drehen Sie dann die Röhrchen und inkubieren Sie sie fünf bis 10 Minuten lang auf Eis.Nach der Inkubation geben Sie langsam 400 bis 500 Mikroliter fötales Rinderserum unter die Zellsuspensionen in jedem Röhrchen. Zwischen den Schichten sollte sich eine klare Schnittstelle bilden. Zentrifugieren Sie anschließend die Proben fünf Minuten lang bei 1.500 g, um Zellpellets zu sammeln.Verwerfen Sie das Übergewicht und resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern vollständigem RPMI-1640-Medium. Übertragen Sie dann jede Suspension in ein Durchflusszytometrie-Röhrchen und geben Sie 20 Mikroliter frisch hergestellte LPS-Arbeitslösung in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Proben vier Stunden lang, bevor Sie eine Durchflusszytometrie durchführen.Zu Beginn wird die Maus mit einer intraparetonealen Injektion eines Anästhesiecocktails anästhesiert und eine adäquate Sedierung mit einem Zehenkneiftest bestätigt. Tragen Sie anschließend Haarentfernungscreme auf die Rückenfläche beider Ohren auf, wischen Sie sie innerhalb einer Minute ab und waschen Sie die Haut mit Wasser. Messen Sie die Dicke des Ohrs, wo die Anwendungen durchgeführt wurden, mit einem Mikrometer.Später bringen Sie die Maus in ihren eigenen Käfig zurück, nachdem sie sich von der Narkose erholt hat, und lassen Sie die Maus mindestens drei Tage ruhen, bevor Sie weitere Tests durchführen. Nach drei Tagen betäuben Sie die Maus erneut und messen Sie die Ohrdicke erneut, um sicherzustellen, dass sie nicht gereizt wird. Tragen Sie dann 12,5 Mikroliter 1,25% Oxazolon auf jede Seite des rechten Ohrs auf und tragen Sie 12,5 Mikroliter der Aceton-Olivenöl-Vehikellösung auf jede Seite des linken Ohrs auf.Beobachten Sie wie immer, wie sich die Maus von der Narkose erholt. Messen Sie 24 Stunden später erneut die Dicke des Ohrs unter Narkose, um sicherzustellen, dass die durch Oxazolon induzierte Hautentzündung aufgetreten ist. Übertragen Sie zunächst 100 Mikroliter monokolonalen Anti-Lyse-Antikörper XG in eine U100-Insulinspritze mit einer 28-Gauge-Nadel.Als nächstes betäuben Sie eine behandelte Maus wie zuvor beschrieben. Üben Sie mit dem Bauch der Maus nach unten einen sanften Abwärtsdruck auf die Haut aus, dorsal und ventral zu einem Auge, um den Augapfel teilweise hervorzustehen. Platzieren Sie dann die Nadel vorsichtig mit einer Abschrägung nach unten, etwa 30 Grad zum medialen Canthus und führen Sie die Nadel vorsichtig in den Retroorbitalsinus ein.Der Einstichdruck wird entlastet, wenn die Nadel in die Nasennebenhöhle eintritt. Werfen Sie dann den Inhalt aus und entfernen Sie die Nadel schnell. Eine kleine Menge Blutung deutet auf eine erfolgreiche Injektion hin.Tragen Sie nun sofort 1,25% Oxazolon und Vehikellösung wie zuvor auf das rechte und linke Mausohr auf. Acht Stunden später verabreichen Sie jeder Maus eine zweite Dosis desselben Antikörpers. Um die Blutgefäße sichtbar zu machen, verabreichen Sie retroorbital 100 Mikroliter fitc dextran.Für dieses Verfahren betäuben Sie die Maus zunächst wie zuvor. Tragen Sie dann Veterinärsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit während der Bildgebung zu vermeiden. Legen Sie als Nächstes ein Glasdeckglas in die Mitte eines Bildgebungstisches und befestigen Sie die Kanten des Deckglases mit Klebeband.Geben Sie außerdem einen Tropfen PVS auf das Deckglas. Positionieren Sie nun das Ohr der Maus mit der Rückenseite nach unten über dem Deckglas. Befeuchten Sie anschließend die ventrale Oberfläche des Mausohrs mit einem Tropfen PVS.Befestigen Sie dann die Spitze des Ohrs mit einem Glasobjektträger darauf und befestigen Sie den Objektträger mit Klebeband. Schalten Sie nun ein konfokales Multi-Laser-Fluoreszenzmikroskop und die zugehörige Ausrüstung ein. Schalten Sie die Raumbeleuchtung aus, um die Exposition gegenüber Umgebungslicht zu minimieren.Nehmen Sie dann dreidimensionale Bilder mit dem konfokalen Mikroskop auf. Für Zeitraffer-Bildgebungsexperimente können Sie bis zu acht Stunden lang alle zwei bis vier Minuten dreidimensionale Bilder aufnehmen. Achten Sie dabei auf zuckende Schnurrhaare, die darauf hindeuten, dass sich die Maus allmählich von der Narkose erholt.In solchen Situationen verabreichen Sie fünf bis 10 Mikroliter einer halben Dosis eines Anästhesiecocktails über eine Schmetterlingsnadel. pIL-1-DsRed-Mäuse wurden mittels Durchflusszytometrie auf phänotypische DsRed-Fluoreszenz untersucht, die in peripheren Blutleukozyten produziert wird. Zirkulierende myeloische Zellen von Wildtyp-Mäusen exprimieren minimal DsRed, während dieselben Zellen von pIL1-DsRed-Mäusen unterscheidbare DsRed-Signale exprimieren.Die Aktivierung des IL-1-beta-Promotors ist ein Marker für das Priming von Neutrophilen und kann am besten in lebenden pIL-1DsRed-Mäusen sichtbar gemacht werden. Als nächstes wurde ein Hautsensibilisator, Oxazolon, topisch auf das rechte Ohr aufgetragen. Später wurden die Neutrophilen vor und nach einer zweiten Applikation des Oxazolon-Sensibilisators mittels retroorbitaler Injektion markiert.Ebenso wurde fitc Dextran injiziert, um Blutgefäße zu lokalisieren. Im extravaskulären Raum wurden viele doppelt markierte Zellen gefunden, die geprimte Neutrophile darstellen. Eine kleine Anzahl von Zellen wurde nur mit dem lyse XG-Antikörper markiert, bei denen es sich wahrscheinlich um ruhende Neutrophile handelte.Darüber hinaus wurde eine kleine Population von DsRed-positiven Zellen beobachtet, die aus entzündlichen Monozyten und aktivierten Makrophagen bestehen können. Die Zellmigrationspfade wurden verfolgt, um die beiden Neutrophilenpopulationen zu vergleichen. Beide Neutrophilenpopulationen zeigten eine zufällige Migration, sobald der extrazelluläre Raum betreten worden war.Interessanterweise wiesen die mutmaßlich geprimten Neutrophilen eine signifikant höhere Geschwindigkeit auf als ihre mutmaßlich ruhenden Gegenstücke. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie. Zwei untersuchen das Verhalten und die Funktion vieler Immunzellen in verschiedenen Entzündungszuständen, an denen verschiedene T-Zellen beteiligt sind.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den dynamischen Prozess des Neutrophilen-Primings bei lebenden Tieren überwachen können.

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir eine nicht-invasive Zwei-Photonen (2P)-Mikroskopie Ansatz zur Untersuchung Leukozyten homing in der Maus Fußballen. Wir besprechen die technischen Aspekte unserer Tissue Imaging Vorbereitung und gehen den Leser durch ein typisches Experiment von der ersten bis zur Ausführung und Datensammlung eingestellt.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Wir beschreiben ein Protokoll von Hellfeld Intravitalmikroskopie zur Messung dynamischer Neutrophilen-Endothel-Zell-Interaktionen während der neutrophilen Granulozyten Rekrutierung in Reaktion auf die Quelle eines neutrophilen Lockstoff in vivo. Neutrophile intraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Maus cremaster Muskelgewebe visualisiert mit Zeitraffer-Video Fotografie und verfolgt mit ImageJ.

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

Dieses Video zeigt in vivo Bildgebung, um die Rekrutierungsdynamik von Neutrophilen an einer Infektionsstelle in einer immungeschwächten, transgenen Maus mit GFP-exprimierenden Neutrophilen zu untersuchen. Dabei werden Leuchtbakterien injiziert, um eine Infektion auszulösen. Dies führt zur Rekrutierung von Neutrophilen an der Infektionsstelle, deren Verfolgung durch Bildgebung erfolgt.

Überwachung der Rekrutierungsdynamik von Neutrophilen und der bakteriellen Belastung an der Infektionsstelle in einem Mausmodell

Dieses Video demonstriert eine in vivo Technik zur Bewertung eines Testantigens durch Induktion einer Hautentzündung in einem Mausmodell. Das Testantigen – ein Hapten in einer Öl/Aceton-Lösung – wird topisch auf die Haut des Mausohrs aufgetragen, und die Entzündung der Haut wird nach einer angemessenen Zeit beurteilt.

Eine Technik zur Beurteilung der Immunantwort gegen ein Antigen durch Induktion einer Hautentzündung

Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Hochauflösende intravitalen Bildgebung mit Kontrastverstärkung von bis zu 120 &amp;mgr; m Tiefe in Lymphknoten von erwachsenen Mäusen durch räumliches Modulieren des Erregungsmusters einer multifokalen Zwei-Photonen-Mikroskop erreicht. In 100 um Tiefe gemessen wir Auflösungen von 487 nm (lateral) und 551 nm (axial) und damit umgehen, Streuung und Beugung Grenzen.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Die Mechanismen, die die interstitielle Motilität von CD4 Effektor T-Zellen an Entzündungsstellen bestimmen, sind relativ unbekannt. Wir stellen eine nicht-invasive Ansatz zu visualisieren und in vitro -geprimte CD4 - T - Zellen in den entzündeten Ohr Dermis, so dass für das Studium des dynamischen Verhaltens dieser Zellen in situ zu manipulieren.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Visualisierung der IL-8-Promotor-abhängigen Entzündungsaktivierung in den Lungen von Mäusen durch nicht-invasive Biolumineszenz-Bildgebung (BLI). Das gleiche Tier kann BLI mehrmals für bis zu zwei Monate ab dem Zeitpunkt der Auslieferung des Luciferase-Reporter-Konstrukts unterworfen werden.

Ein IL-8 transientes transgenisiertes Mausmodell für die<em&gt; In vivo</em&gt; Langzeitüberwachung von entzündlichen Reaktionen

Hier zeigen wir, wie man eine intravitale Mikroskopie auf postkapillaren Venulen des Maus-Cremaster-Muskels durchführt. Häufig angewendet auf verschiedene Modelle von Entzündungen und Sepsis, insbesondere solche, die durch Chemokine und Zytokine induziert werden, heben wir ihre Relevanz in der Untersuchung von Muskopathien mit übertriebener Muskel-Leukozyten-Infiltration hervor.

Leukozyten-Infiltration von Cremaster-Muskeln bei Mäusen bewertet durch Intravital-Mikroskopie

Die Migration von Neutrophilen beruht auf dem schnellen und kontinuierlichen Umbau der Plasmamembran als Reaktion auf den Chemolockstoff und seine Wechselwirkungen mit der extrazellulären Mikroumgebung. Hierin wird ein Verfahren beschrieben, das auf der Intravitalen Subzellulären Mikroskopie basiert, um die Dynamik des Membranumbaus bei Neutrophilen zu untersuchen, die in das Ohr von anästhesierten Mäusen injiziert werden.

Bildgebung der Migration von Neutrophilen in der Maushaut zur Untersuchung des subzellulären Membranumbaus unter physiologischen Bedingungen

Erfahren Sie, wie Sie das Neutrophilen-Priming in lebenden Tieren mittels intravitaler Bildgebung und fluoreszenter Reporter in Echtzeit visualisieren. Diese Methode ermöglicht neue Einblicke in Immunantworten bei seltenen Erkrankungen.

Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Weitere Videos entdecken