Isolation und zelluläre Phänotypisierung von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet von Synovialflüssigkeit und Knochenmark von Minipigs

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die nicht-invasive Entnahme von Synovialflüssigkeit und Knochenmark von Minischweinen zur Gewinnung mesenchymaler Stammzellen, die in Regenerations- und Immunmodulationsstudien verwendet werden sollen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der ostologenen MSC-Therapie zu beantworten, z. B. wie die Synovialflüssigkeit bei MSC etabliert und wie sie im Vergleich zur Knochenmark-MSC charakterisiert werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, die Schlüsseleigenschaften von Synovialflüssigkeit und aus Knochenmark gewonnenen MSCs aus Minischweinen effektiv zu bestimmen, was für die Anwendung bei Patienten nützlich sein wird.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie verschiedener Gelenkerkrankungen, da die Population der aus der Synovialflüssigkeit gewonnenen MSC in der Synovialhöhle bei sportlichen Patienten signifikant erhöht ist. Obwohl diese Methode Einblicke in die regenerative Medizin geben kann, kann sie auch auf andere Studien wie die Erforschung von Autoimmunerkrankungen angewendet werden. Da Minipig-MSCs autologe sind, könnte die Immunsuppression für den Menschen interessant sein.

Zusätzlich zu den anderen Wissenschaftlern werden Hyeon-Jeong Lee und Won-Jae Lee aus meiner dritten Stufe das Verfahren demonstrieren. Richten Sie zunächst ein anästhesiertes Minischwein so aus, dass es Zugang zum Beckenkamm hat. Enthaaren Sie anschließend einen 15 Quadratzentimeter großen Bereich auf dem Beckenkamm mit einem Rasiermesser oder einer Haarschneidemaschine.

Schrubben Sie dann abwechselnd die exponierte Haut dreimal mit Povidon-Jod und 70% Ethanol. Sobald sie vollständig getrocknet sind, sterile Abdeckungen anbringen. Beschichten Sie nun eine Zehn-Milliliter-Spritze mit Heparin und spülen Sie sie mit drei bis vier Millilitern aus.

Dadurch wird verhindert, dass das Knochenmark während der Extraktion gerinnt. Befestigen Sie dann genau am Beckenknochenkamm einen Knochenmarkextraktor fest an der heparinbeschichteten Spritze und extrahieren Sie mindestens fünf Milliliter Knochenmark. Um die Zellen aus dem extrahierten Knochenmark zu isolieren, verdünnen Sie es zunächst mit einem gleichen Volumen DPBS in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen bei Raumtemperatur.

Laden Sie dann drei Milliliter Dichtezentrifugationsmedium in ein zweites konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Übertragen Sie anschließend vorsichtig vier Milliliter des verdünnten Knochenmarks auf das Dichtezentrifugationsmedium, um zwei Lösungsschichten zu bilden. Zentrifugieren Sie nun das Röhrchen bei 400 g für 40 Minuten bei Raumtemperatur.

Die gewünschten multinationalen Unternehmen werden in der zentralen weißen Schicht gesammelt. Aspirieren Sie nur diese Schicht. Werfen Sie die MNC-Schicht in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen aus und verdünnen Sie es mit sieben bis acht Millilitern DPBS.

Zentrifugieren Sie die Zellen dann zehn Minuten lang bei Raumtemperatur bei 500 g. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die palettierten Zellen zweimal mit zehn Millilitern DPBS, wobei der vorherige Zentrifugationszyklus wiederholt wird. Nach den beiden Wäschen suspendieren wir die MNCs in zwei Millilitern ADMEM.

Laden Sie dann die Zellen auf eine 35-Millimeter-Gewebekulturschale und inkubieren Sie sie bei 38,5 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-Inkubator. Nach 48 Stunden aspirieren Sie das Medium zusammen mit den nicht angeschlossenen MNCs. Fügen Sie dann wieder zwei Milliliter frisches ADMEM hinzu und setzen Sie die Inkubation fort, wobei Sie das Medium alle drei Tage wechseln.

Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreichen, waschen Sie die Kultur mit frischem DPBS. Dissoziieren Sie dann die Zellen mit einem Milliliter 0,25 % Trypsin-EDTA für drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie die Zellen in zehn Millilitern ADMEM und geben Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Schleudern Sie dann die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 g herunter und entsorgen Sie den Überstand. Suspendieren Sie nun die geernteten multinationalen Unternehmen in einem Milliliter frischem ADMEM und messen Sie ihre Dichte. Zum Schluss werden zwischen 1/2 und dreiviertel Million Zellen mit vier Millilitern ADMEM in T25-Kolben überzogen.

Inkubieren Sie die Kolben genau wie die Platten und wechseln Sie das Medium jeden dritten Tag. Bereiten Sie einen 15x10 Zentimeter großen Hautabschnitt über dem Schenkelgelenk vor, wie es bei der Vorbereitung der Knochenmarkentnahme gemacht wurde. Berühren Sie dann die Patella- und Tibiakämme unter der Haut, um das Synovialgelenk zu identifizieren, und führen Sie eine Drei-Milliliter-Spritze mit einer 23-Gauge-Nadel genau in das Gelenk ein.

Extrahieren Sie mit sanftem Saugen zwischen 1/2 und einem Milliliter Flüssigkeit und ziehen Sie die Nadel sofort zurück. Wenn das Volumen der Synovialflüssigkeit zu klein ist, spülen Sie den Hohlraum mit DPBS, um die Synovialflüssigkeit mit DPBS aufzufangen. Das Volumen des zu verwendenden DPBS variiert mit der Größe der Synovialhöhle.

Das optimale Volumen der Gelenkflüssigkeit ist in gesunden Gelenken begrenzt. Das Volumen variiert mit der Größe und dem pathologischen Zustand des Gelenks. Um die Zellen von der Synovialflüssigkeit zu isolieren, verdünnen Sie die Flüssigkeit mit einem gleichen Volumen DPBS in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen bei Raumtemperatur.

Als nächstes bewegen wir die Ablagerungen, indem wir die Verdünnung durch ein 40-Mikron-Nylon-Zellsieb filtern. Fügen Sie dann zehn weitere Milliliter DPBS hinzu und zentrifugieren Sie die Suspension zehn Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400 g. Entsorgen Sie als Nächstes den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS.

Wir suspendieren die gewaschene Zellpalette in zwei Millilitern ADMEM. Fahren Sie dann mit der Kultivierung der Zellen fort, wie sie mit den MSCs gezeigt wurde. MSCs wurden erfolgreich aus dem Knochenmark und den Gelenken der Minipigs isoliert und in vitro expandiert.

Die Morphologie der aus der Synovialflüssigkeit gewonnenen MSCs ist ähnlich wie die der aus dem Knochenmark gewonnenen MSCs: Beide haben eine fibroblastische Spindelform und sind homogen adhärent. Die MSCs zeigten eine positive Expression für die Alkali-Phosphatase-Färbung nach Abschluss der dritten Subkultur. Als nächstes wurden Oberflächenmarker in beiden Kulturen analysiert.

Erwartungsgemäß exprimierten beide Arten von MSCs signifikant CD29, CD44 und Vimentin. Im Gegensatz dazu war die Expression von CD34 und CD45 negativ und gering. Diese Ergebnisse waren identisch mit denen, die durch unterschiedliche MSCs erzielt wurden, einschließlich Zellen, die aus Synovialflüssigkeit isoliert wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Synovialflüssigkeit und Knochenmark nicht-invasiv aspiriert, um ihre MSC von Minischweinen zu isolieren, und wie man den Vergleich und die Phänotypisierung dieser MSC durchführt. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, den objektiven Punkt auf dem Beckenkamm und der Synoviale zu lokalisieren, der durch sorgfältiges Abtasten bestimmt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. in Modellen der Osteoarthritis oder rheumatoiden Arthritis, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z.B. ob nicht nur MSCs aus dem Knochenmark, sondern auch aus der Synovialflüssigkeit die gleiche Kapazität für die Knorpel- oder Knocheninitiation und Immunsuppression haben.

Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik die autologe Therapie von Gelenkerkrankungen vorangetrieben, indem sie dazu beigetragen hat, MSCs zu charakterisieren, die von angegriffenen oder entzündeten Gelenken bei Arthritis-Patienten stammen.