Name: Modellierung Muskeldystrophie 1 in C2C12 Myoblastenzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Erfahren Sie die Modellierung von Myotone Dystrophie 1 durch Transfektion und Transduktion von C2C12-Myoblasten. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung genetischer Krankheitsmechanismen und fördern die Muskelkrankheitsforschung.

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Wir danken Dr. Tom Cooper vom Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan von der University of Wisconsin-Madison und Didier Trono von der Universität Genf für die Reagenzien. Diese Arbeit wird von einem Startup-Fonds der University of Houston (YL), einem Stipendium der American Heart Association (YL, 11SDG5260033) und der National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047) unterstützt.

1. C2C12 Zellkultur <ol><li> Pflegen C2C12-Maus-Myoblasten in einer 100 mm-Platte in Wachstumsmedium (Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)), ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin. Lassen Sie C2C12 agierten Zellen etwa 50 werden - 60% konfluent. </li><li> Verwerfen das Wachstumsmedium und wasche C2C12 Zellen mit 3 ml Raumtemperatur phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen Sie die PBS und fügen 500 ul 0,25% Trypsin-EDTA die Zellen zu lösen. Die Platte wird in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator 3 - 5 min. </li><li> Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 3 ml Wachstumsmedium. Pipette 6 - 8 mal um die Zellen zu suspendieren. 1 ml suspendierter Zellen zu einer neuen 100 - mm - Platte und inkubiere bei 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 2. C2C12 Zelltransfektion / Transduktion und Selektion <ol><li> C2C12 Plasmidtransfektion <ol><li> 24 Stunden vor der Transfektion, pspäten 7,0 x 10 5 C2C12 Zellen in eine Vertiefung einer Sechs-Well - Platte für jede Transfektion. Anmerkung: Dies führt zu einer 50 bis 60% Konfluenz durch den Zeitpunkt der Transfektion. </li><li> Lassen Sie das Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch zu kommen. </li><li> In 2 ug Plasmid-DNA (GFP-CUG5 oder GFP-CUG200) in 200 &amp; mgr; l vorgewärmten serumfreien Medium und Wirbel kurz. In 6 ul Transfektionsreagenz auf das Medium und mischen sofort für 30 Sekunden einen Wirbel verwenden. Inkubieren der Mischung für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Ändern Sie die Medien von C2C12-Zellen zu 2,5 ml Serum-freien Wachstumsmedium. Fügen Sie das Transfektionsgemisch zu den Zellen nach der Inkubation. Rück die Platten zu einer 5% CO 2, 37 ° C Inkubator. </li><li> Halten Sie die Zellen in Transfektionsgemischs / Serum-freien Wachstumsmedium für 4 Stunden oder bis über Nacht. Ändern Medien zurück zu den Wachstumsmedien am nächsten Tag oder wenn Zytotoxizität ist offensichtlich. Hinweis: Die Zytotoxizität wird beurteilt durch mikroskopische Untersuchung des cells. Beachten Sie die Veränderungen der Zellmorphologie und Zellablösung. Solange es keine offene Zytotoxizität ist, Inkubation über Nacht in serumfreiem Wachstumsmedium erhöht die Transfektionseffizienz. </li><li> Markieren Sie die Zellen 48 Stunden nach der Transfektion durch Zugabe von 1,2 bis 1,6 mg / ml G418 für ~ 10 Tage, bis die Kontrollkultur (ohne die Plasmide transfiziert) keine lebenden Zellen haben. Ändern Sie die Medien alle zwei Tage mit Wachstumsmedien mit G418 ergänzt. </li><li> Pflegen die G418 - resistenten Zellen in Wachstumsmedium und 5% CO 2 bei 37 ° C für nachfolgende Experimente. </li></ol></li><li> Retrovirus Vorbereitung und C2C12 retrovirale Transduktion <ol><li> Bereiten HEK 293 Kulturmedium durch DMEM mit hohem Glucose mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin. <ol><li> Etwa 24 Stunden nach der Transfektion vor, Platte 4,0 x 10 6 ekotropischen HEK 293-basierte Verpackungszellen in einer 100 - mm - Platte (80% Zusammenfluß bei Transfektion) containing Zellkulturmedium. </li></ol></li><li> Lassen Sie das Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch zu kommen. </li><li> Mischen Sie 15 ug Plasmid-DNA (pMSCV-Puro oder pMSCV-Celf1Flag-Puro) in 1 ml Serum-freien Wachstumsmedium. Vortex kurz. In 30 ul Transfektionsreagenz aus Schritt 2.2.2 in die DNA / Serum-freien Wachstumsmedium Rohr und gut mischen Wirbel verwenden. Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> In Transfektionsgemisch tropfenweise zu den ekotropischen HEK 293-basierte Verpackungszellen. Vorsichtig die Platten wirbeln und sie zurück in die 5% CO 2, 37 ° C Inkubator zurück. Nach 24 Stunden ändern, um die Medien zu 10 ml frischem Wachstumsmedium vorgewärmten. </li><li> Ernten Sie den Überstand (mit Retrovirus) 48 Stunden nach der Transfektion mit einer Pipette und den Überstand in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit. 10 ml neue warme Medien auf die Platte und wieder in den Inkubator. Halten der Überstand bei 4 ° C. Hinweis: Das Medium wird hinzugefügt sanft bis ter Seite des Bohrloches, um nicht die Zellschicht zu stören. </li><li> Ernten Sie die zweite Charge von Überstand 60 Stunden nach der Transfektion und bündeln es mit dem Überstand von 2.2.5. Zentrifuge bei 500 × g, 4 ° C für 7 min Zelldebris zu entfernen. </li><li> Den Überstand in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen. Verwenden Retro C2C12-Zellen an diesem Punkt zu transduzieren durch Vorgehen 2.2.9 oder aliquoten zu Schritt und speichern Sie den Überstand bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung. </li><li> Auftauen Retrovirus aus 2.2.7 bei Raumtemperatur, wenn ein gefrorener Lager hier verwendet wird. Hinweis: Vermeiden Sie mehrere Gefrier-Auftau-Zyklen. </li><li> Platte C2C12-Zellen am Tag der Transduktion 30 Ziel - 40% Konfluenz. <ol><li> Entsorgen Sie das Wachstumsmedium und waschen C2C12-Zellen mit 3 ml Raumtemperatur PBS. Entfernen Sie die PBS, 500 &amp; mgr; l 0,25% Trypsin-EDTA und Inkubation der Platte in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator 3 - 5 min. </li><li> Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 3 ml Wachstums medium. Pipette 6 - 8 mal um die Zellen zu suspendieren. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer und fügen 8,0 x 10 5 C2C12 - Zellen auf eine 60 - mm - Platte. </li></ol></li><li> 0,5 ml Retrovirus ein 60-mm-Platte von Zellen in 3 ml Wachstumsmedium zu infizieren. Bringen Sie die Platte in den Inkubator. </li><li> Ersetzen durch 3 ml frisches Medium mit Selektionsantibiotikum ergänzt (Puromycin 1-3 ug / ml) 48 Stunden nach der Infektion. Ersetzen 3 ml Medium mit Antibiotikum jeden Tag für ~ 5 Tage, bis die untransduzierten C2C12 Kontrollkultur stirbt aus. </li></ol></li><li> Lentiviren Vorbereitung und C2C12 lentivirale Transduktion Hinweis: Führen Sie alle Lentiviren bezogene Verfahren in Biosafety Level 2 Schrank und biologische Sicherheitsrichtlinien befolgen. Flüssige Abfälle, das Virus enthalten, müssen vor der Entsorgung desinfiziert werden. <ol><li> Platte 4.0 x 10 6 293T - Zellen in einer 100 mm Platte (~ 80% Konfluenz am Tag der Transfektion) mit HEK 293 - Zellkulturmedium (DMEM high Glucose, ergänzt mit 10% fötalemRinderserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin) 24 h vor der Transfektion. </li><li> Wärmen Sie das Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur. Mischen Sie die lentivirale Verpackungsvektoren (4 ug pMD2.G und 6 ug psPAX2) zusammen mit 8 ug lentiviralen Transfervektor (Celf1 shRNA oder verschlüsselt Kontrolle shRNA) in 1 ml Serum-freiem Zellkulturmedium. Vortex kurz. </li><li> In 36 ul vorgewärmte Transfektionsreagenz an die DNA / DMEM Rohr und gut mischen durch Wirbel. Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Entfernen Sie die 293T-Zellen aus dem Inkubator und zu der Platte die Transfektionsgemischs. Die Platte vorsichtig wirbeln und es Inkubator zurück zu 5% zurückkehren CO 2, 37 ° C. Nach 24 Stunden, ersetzen Sie das Transfektionsgemisch mit 10 ml frischem Kulturmedium. </li><li> Die überstehende Flüssigkeit enthält Lentiviren 48 Stunden nach der Transfektion und gibt sie in eine 50 ml Zentrifugenröhrchen. 10 ml neue warme Medien auf die Platte und senden Sie esInkubator. Lagern Sie den Überstand bei 4 ° C. </li><li> Sammeln Sie die zweite Charge von Überstand 60 Stunden nach der Transfektion und kombinieren es mit dem Überstand von 2.3.5. Zentrifuge kurz bei 500 · g, 4 ° C für 7 min. </li><li> Den Überstand in ein frisches 50 ml Zentrifugenröhrchen. Wenn frische Virus verwenden, fahren 2.3.9 zu treten. Für eine zukünftige Verwendung, Speicherung virushaltigen Überstand bei -20 ° C in Aliquots von 10 ml. </li><li> Auftauen das Virus aus 2.3.7 bei Raumtemperatur vor der Verwendung, wenn ein gefrorener Vorrat verwendet wird. Hinweis: Vermeiden Sie mehrere Gefrier-Auftau-Zyklen. </li><li> Platte C2C12-CUG200 Zellen (erhalten in Abschnitt 2.1), wie in 2.2.9 am gleichen Tag der Transduktion beschrieben. Hinweis: Ziel für 30 - 40% der Einmündung. </li><li> 0,5 ml Virus eine 60-mm-Platte von C2C12-CUG200 zu infizieren und die Platte in den Inkubator zurück. </li><li> Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium mit der Auswahl Antibiotikum ergänzt (Puromycin 1-3 ug / ml) 72 Stunden nach der Transduktion.Aktualisieren Kulturmedien jeden Tag mit dem Selektionsantibiotikum für ~ 5 Tage, bis alle untransduzierten C2C12-CUG200 Kontrollkultur stirbt aus. </li><li> Verwenden Western-Blot-Celf1 Knockdown in GFP-CUG200 transfizierten Zellen zu überprüfen. </li></ol></li></ol> 3. C2C12 Zelldifferenzierung <ol><li> Platte 2 x 10 6 Zellen in einer Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen in 2,5 ml Wachstumsmedium 24 h vor der Initiierung der Differenzierung. Hinweis: Die Beschichtungsdichte eingestellt werden kann, so dass eine vollständige Konfluenz in 24 h erreicht ist. <ol><li> Spülen konfluenten Zellen mit PBS und fügen Sie 2,5 ml serumarmen Differenzierungsmedium (Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit 2% Pferdeserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 1 uM Insulin) . Ersetzen Sie das Medium alle zwei Tage. Hinweis: Bewahren Sie Lager Insulin gefroren und fügen Sie es bei jedem Mediumwechsel zu den Medien. </li></ol></li><li> Während C2C12 Differenzierung, sammeln Proben für Quantitative RT-PCR in den folgenden Zeitpunkten (siehe Abschnitt 4): Tag0, 1, 2, 4 und 6. Verfahren die Kultur für Tag bei immunostaining 6 - 8 (siehe Abschnitt 5). </li></ol> 4. RNA Isolation und Quantitative RT-PCR <ol><li> Verwenden des Protokolls des Herstellers für die RNA-Isolierung. Nach der Isolierung resuspendieren RNA-Pellet in 30 ul RNase-freies Wasser und pipettieren nach oben und unten mehrmals. Hinweis: Die Proben Quantitative RT-PCR erfolgen kann oder kann bei -80 ° C gelagert werden. </li><li> Verwenden Sie einen RT - qPCR - Kit für die quantitative RT-PCR 10 und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Bereiten Sie die Reaktionsmischung gemäß Tabelle 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen (ul) </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> 2x Reaktionspuffer </td><td> 10 </td><td> 1x </td&gt; </tr><tr><td> Vorwärtsprimer </td><td> 0,5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> Reverse-Primer </td><td> 0,5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> Sonde </td><td> 0,5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> Reverse Transkriptase und RNase Inhibitor </td><td> 0,1 </td><td> 0,25 U / ml </td></tr><tr><td> Vorlage </td><td> 1 </td><td> 100 ng Gesamt-RNA </td></tr><tr><td> RNase freies Wasser </td><td> 7.4 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> insgesamt Mix </td><td> 20 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1 : Quantitative RT-PCR Master Mix Herstellungs <ol start="3"><li> Führen Sie einen 20 &amp; mgr; l RT-qPCR - Reaktion unter Verwendung thermischen Profils Tabelle 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reverse Transkriptionsschritt </td><td> 30 min, 48 ° C </td></tr><tr><td> DNA-Polymerase Aktivierung / Reverse-Transkriptase-Inaktivierung </td><td> 10 min, 95 ° C </td></tr><tr><td rowspan="2"> 40 Zyklen </td><td> 15 sec, 95 ° C </td></tr><tr><td> 1 min, 60 ° C </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Quantitative RT-PCR - Thermoprofil 5. Immunostaining <ol><li> Befestigen Sie die Monolayer-Kultur in 2,5 ml frisch 4% Paraformaldehyd / PBS bei Raumtemperatur für 10 Minuten vorbereitet. </li><li> Permeabilisieren die Proben in 2,5 ml 0,1% Triton X-100 / PBS für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Übertragen Sie die Proben auf einer feuchten Kammer. Blockieren die Proben in 2,5 ml Blockierungspuffer (0,1% nichtionisches Tensid / PBS, 10% normales Ziegenserum) für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Verwerfen Blockierungspuffer und anzuwenden 800 ul primärem Antikörper gegen Myosin schwere Kette in Blockierungspuffer verdünnt (1: 100). Inkubieren in einer befeuchteten Kammer über Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Platte 3 times (jeweils 10 Minuten) mit 2,5 ml Waschpuffer (0,1% Polysorbat 20 / PBS) am 2. Tag. </li><li> Entfernen der Waschpuffer und 800 ul gelten Sekundärantikörper (Ziege-anti-Maus-IgG, 1: 500 in PBS verdünnt). Inkubieren in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur für 1 Std. </li><li> Waschen zweimal (jeweils 10 Minuten) mit 2,5 ml Waschpuffer. </li><li> Inkubieren mit 800 &amp; mgr; l DAPI (1 ug / ml, in destilliertem deionisiertem H 2 O verdünnt) für 5 min. </li><li> Waschen mit 2,5 ml Waschpuffer wieder für 10 min. </li><li> Ändern Sie den Waschpuffer auf 2,5 ml PBS und mit einem Fluoreszenz-Mikroskop Bilder zu erfassen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

C2C12 - Zelllinie wurde als Modell verwendet worden myogenesis 11-14 zu studieren. Diese Zellen behalten einen Fibroblasten-ähnliche Aussehen, proliferieren schnell in den Medien 20% fötales Rinderserum enthält , und unterscheiden sich leicht in Medien mit 2% Pferdeserum 15. Das schnelle Wachstum und die Differenzierung sind vorteilhafte Eigenschaften in einem myogenesis Zellmodell. Hier zeigen wir die Verwendung des Plasmids, retroviralen und lentiviralen Vektoren einzuführen cDNA, 3&#39;-UTR und ...

Muskeldystrophie (DM) ist eine autosomal dominante Erkrankung , die mehrere Systeme betrifft, vor allem Herz- und Skelettmuskulatur 1. Es gibt zwei Subtypen dieser Krankheit, DM1 und DM2. DM1 ist häufiger und hat 2 eine schwere Manifestation als DM2. Die genetische Mutation DM1 zugrunde liegt , ist eine Erweiterung der CUG Triplett - Wiederholungen in der 3&#39; - untranslatierten Region liegt (UTR) von DM - Proteinkinase - Gen (DMPK) 3. Der CUG Wiederholungszahl in nicht betroffenen Individuen variiert von 5 bis 37. Im Gegensatz dazu erhöht sich auf mehr als 50, und manchmal bis zu Tausenden in DM1 Patienten 4. Als Ergebnis RNA-bindende Proteine, wie muscle-like 1 (MBNL1), CUGBP und Elav-like Familie 1 (Celf1) falsch reguliert sind. Aufgrund der Sequestrierung auf den CUG repeats erweitert, verliert seine Fähigkeit MBNL1 5 alternatives Spleißen zu regulieren. Celf1, andererseits wird 6,7 hochreguliert. Die Überexpression von Celf1 mit Muskelverlust verbundenund Schwäche, die zum Verlust nicht von MBNL1 Funktion zugeschrieben werden. Tiermodelle DM1 bedingte Veränderungen Simulieren, einschließlich DMPK 3&#39;-UTR CUG Expansion, Verlust von MBNL1 und Überexpression von Celf1, festgelegt wurden. Allerdings bietet die Modellierung DM1 in Myoblasten eine effiziente Alternative, vor allem für Sezieren DM1 bezogenen zellulären und molekularen Ereignisse. C2C12 Myoblasten - Zelllinie wurde zum ersten Mal von verletzten C3H Maus Muskel isoliert und weit verbreitete Muskeldifferenzierung 8,9 zu studieren. C2C12 Zellen vermehren sich rasch in fötalem Rinderserum (FBS) Medien -haltigen und leicht Differenzierung durchmachen, wenn FBS erschöpft ist. Doch dieses Myoblastendifferenzierung Modell stellt zwei Herausforderungen: C2C12-Zellen sind oft resistent gegen Gen-Transfektion / Virusübertragung; und leichte Variationen in die Handhabung von Zellen und Differenzierungsverfahren kann zu deutlichen Veränderungen in Myotube Bildung führen. Unser Labor routinemäßig verwendet C2C12 Myoblasten als acell - Modell und hat Protokolle entwickelt , die effektiv Gene durch Plasmidtransfektion 10, retrovirale Transduktion und lentivirale Transduktion in C2C12 - Zelllinie zu liefern. Im Video zeigen wir die optimierte Verfahren für die Transfektion / Transduktion C2C12-Zellen und die Differenzierung Konsistenz beibehalten in Modellen DM1 Myoblasten zu etablieren.

<table><tbody><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td>für Kulturmedium</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>für Kulturmedium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamin (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>für Kulturmedium</td></tr><tr><td>Insulin aus der bovinen Bauchspeicheldrüse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-100MG</td><td>für Differenzierungsmedium</td></tr><tr><td>Equine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12150</td><td>für Differenzierungsmedium</td></tr><tr><td>FuGENE&nbsp; HD-Transfektionsreagenz</td><td>Promega</td><td>E2311&nbsp;</td><td>zur Transfektion</td></tr><tr><td>G418 Sulfat&nbsp;</td><td>Gold Biotechnologie&nbsp;</td><td>G-418-10</td><td>für die arzneimittelresistente Selektion</td></tr><tr><td>Puromycin-Dihydrochlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>sc-108071</td><td>für die arzneimittelresistente Selektion</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gele, 1,0 mm, 15 Well</td><td>Life Technologies</td><td>NP0323BOX</td><td>für Western Blot</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP00061</td><td>für Western Blot</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0002</td><td>für Western Blot</td></tr><tr><td>Amersham Protran Supported 0,2 NC, 300 mm x 4 m</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>10600015</td><td>für Western Blot</td></tr><tr><td>MF 20</td><td>Entwicklungshybridom Bank</td><td>MF 20</td><td>primäres Ab für die Immunfärbung</td></tr> von <tr><td>Ziegen Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärantikörper, Texas Red-X Konjugat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T-862</td><td>sekundäres Ab für Immunfärbung</td></tr><tr><td>Einstufige qRT-PCR MasterMix</td><td>AnaSpec</td><td>05-QPRT-032X</td><td>für qRT-PCR</td></tr><tr><td>TriPure Isolierung Reagenz</td><td></td><td>Roche 11667165001</td><td>für RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>CUG-BP1 Antikörper (3B1)</td><td>santa cruz</td><td>sc-20003</td><td>primär Ab Western Blot</td></tr><tr><td>Aktin Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1615</td><td>polyklonales IgG aus Ziege für die Ladekontrolle</td></tr><tr><td>293T Ecopack</td><td>Clontech</td><td>631507</td><td>Zellen zur Herstellung von Retroviren</td></tr><tr><td>pMSCV-puro</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td>leerer retroviraler Vektor zur Herstellung von Retroviren</td></tr><tr><td>pMSCV-Celf1Flag-puro</td><td>hauskonstruierter</td><td>nicht</td><td>verfügbarer retroviraler Vektor, der für Celf1Flag kodiert</td>ist psPAX2-Geschenk</tr><tr><td></td><td>von Didier Trono</td><td>nicht verfügbar</td><td>für die Lentivirus-Zubereitung</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Geschenk von Didier Trono</td><td>nicht verfügbar</td><td>für Lentivirus-Präparat</td></tr><tr><td>GFP-CUG5</td><td>Geschenk von M.S. Mahadevan</td><td>nicht verfügbar</td><td>Details in Referenz 10&nbsp;</td></tr><tr><td>GFP- CUG200</td><td>Geschenk von M.S. Mahadevan</td><td>nicht verfügbar</td><td>Details in der Referenz 10&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>für die Immunfärbung</td></tr><tr><td>von Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>für die Immunfärbung</td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp; 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>für die Immunfärbung</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>für die Immunfärbung</td></tr></tbody></table>

modellierung muskeldystrophie 1 in c2c12 myoblastenzellen

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Muskeldystrophie 1 (DM1) ist eine häufige Form der Muskeldystrophie. Obwohl mehrere Tiermodelle haben für DM1, Myoblasten Zellmodelle sind nach wie vor wichtig, weil sie eine effiziente zelluläre Alternative für die Untersuchung zellulärer und molekularer Ereignisse bieten etabliert. Obwohl in großem Umfang Zellen C2C12 Myoblasten verwendet myogenesis, Resistenz gegen Gen-Transfektion oder virale Transduktion zu studieren, behindert die Forschung in C2C12-Zellen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll, das die tägliche Wartung umfasst, Transfektion und Transduktion Verfahren Gene in C2C12 Myoblasten und die Induktion von myocyte Differenzierung einzuführen. Gemeinsam ermöglichen diese Verfahren am besten Transfektion / Transduktionseffizienzen sowie konsequente Differenzierung Ergebnisse. Das Protokoll bei der Einrichtung DM1 Myoblasten Zellmodelle beschrieben würde die Studie von Muskeldystrophie zugute kommen, sowie andere Muskelerkrankungen.

C2C12-Zellen wurden mit GFP-CUG5 oder GFP-CUG200 transfiziert. Nach Medikamentenresistenz Selektion wurden stabile Pools hergestellt, das durch die GFP - Expression (Abbildung 1A) sichtbar gemacht werden kann. Myotube Bildung in den differenzierten Myoblasten wurde von Myosin schwere Kette Immunofärbung 10 (1B) detektiert. Die Quantifizierung der Myotube Bildung zeigte , dass Fusions Indizes von 35,4 ± 4,1% auf 2,6 ± 1,1% und Myotube Bereiche ...

In diesem Protokoll stellen wir die Verfahren in Muskeldystrophie 1 Myoblasten Modelle Gründung, einschließlich optimierte C2C12 Zell Wartung, Gen-Transfektion / Transduktion und Myozyten-Differenzierung.

Modellierung Muskeldystrophie 1 in C2C12 Myoblastenzellen

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren zur Kultivierung, Transfektion und Transduktion von Myoblasten besteht darin, ein zelluläres Modell für die myotone Dystrophie Typ 1 zu etablieren, das der Erforschung der myotonen Dystrophie und anderer Muskelerkrankungen dient. Diese Methode kann dabei helfen, M1-Myoblasten-Zellmodelle zu etablieren, die nützlich sein werden, um den detaillierten Mechanismus der M1-Pathogenese zu untersuchen. Diese mehrstufige Genmanipulation von C2C12-Myoblasten ermöglicht die Modellierung sequenzieller und genetischer pathologischer Vorgänge in der M1.24 Stunden vor der Transfektion werden 7 × 10⁵ C2C12-Zellen pro gut in eine 6-Loch-Platte eingesät.Am nächsten Tag zwei Mikrogramm der gewünschten Plasmid-DNA in 200 Mikroliter Medium ohne Serum bei Raumtemperatur geben und die Lösung kurz verwirbeln. Danach sechs Mikroliter Transfektionsreagenz bei Raumtemperatur zum Medium hinzufügen und die Lösung unverzüglich 30 Sekunden lang verwirbeln. Anschließend das Medium 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Während der letzten fünf Minuten der Inkubation ersetzen Sie das Medium in jedem Wells durch 2,5 ml frisches, serumfreies Wachstumsmedium und geben Sie 200 µl Transfektionsmischung zu jedem Wells hinzu. Stellen Sie die Platte für vier Stunden zurück in den Zellkultur-Inkubator.Überprüfen Sie anschließend die Zellen unter dem Mikroskop auf Veränderungen in ihrer Morphologie und Anheftung. Bei Beobachtung von Zytotoxizität ersetzen Sie das serumfreie Medium durch Wachstumsmedium. 48 Stunden nach der Transfektion fügen Sie alle zwei Tage über einen Zeitraum von 10 Tagen das geeignete Selektionsantibiotikum in frischem Wachstumsmedium hinzu.Bis die Kontrolle, die ohne Plasmide transfiziert wurde, keine lebenden Zellen mehr enth&auml;lt. F&uuml;r die Herstellung des Retrovirus s&auml;en Sie zun&auml;chst vier mal zehn hoch sechs ektrope HEK293-basierte Verpackungszellen in einer 100-Millimeter-Platte mit Zellkulturmedium aus. Am n&auml;chsten Tag mischen Sie 15 Mikrogramm der gew&uuml;nschten Plasmid-DNA in einem Milliliter serumfreiem Wachstumsmedium und wirbeln das R&ouml;hrchen kurz an.Fügen Sie anschließend 30 µL Transfektionsreagenz mit Raumtemperatur dem Medium hinzu und wirbeln Sie die Lösung unmittelbar 30 Sekunden lang kräftig um. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur geben Sie die Transfektionsmischung tropfenweise zu den ektropen Zellen und schwenken die Platte vorsichtig. Stellen Sie die Platte für 24 Stunden in den Zellkulturinkubator und ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch 10 mL frisches Wachstumsmedium mit 37 °C.48 Stunden nach der Transfektion das retrovirale haltige Überstandmedium mit einer Pipette in ein einzelnes kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen überführen und über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Anschließend 10 Milliliter frisches, warmes Medium die Wand der Platte entlang zugeben und die Kultur in den Inkubator zurückstellen. Die zweite Charge Retrovirus 60 Stunden nach der Transfektion gewinnen.Vereinigen Sie es mit dem Retrovirus, das nach 48 Stunden gesammelt wurde. Zentrifugieren Sie das Überstandsvolumen, um zelluläre Bestandteile zu entfernen, und überführen Sie das Retrovirus in ein neues 50-Milliliter-Gefäß. Waschen Sie nun jede Vertiefung einer C2C12-Zellkultur mit drei Millilitern PPS bei Raumtemperatur, gefolgt von der Zugabe von 500 µL Trypsin-EDTA mit 0,25 % für eine fünfminütige Inkubation bei 37 °C.Wenn sich die Zellen gelöst haben, neutralisieren Sie die Reaktion in jedem Well mit drei Milliliter Wachstumsmedium und pipettieren Sie die Kultur sechs bis acht Mal um, um die Zellen in eine Einzelzell-Suspension zu dissoziieren. Nach der Zellzählung geben Sie 8 × 10⁵ Zellen in eine 60-Milliliter-Platte und fügen drei Milliliter Wachstumsmedium hinzu. Infizieren Sie die Zellen anschließend mit 0,5 Milliliter Retrovirus und stellen Sie die Platte für 48 Stunden in den Inkubator.Nach zwei Tagen die Zellen mit drei Millilitern frischem Wachstumsmedium versorgen, das täglich über fünf Tage mit dem geeigneten Selektionsantibiotikum ergänzt wird, bis in der nicht transduzierten C2C12-Kontrollkultur keine lebenden Zellen mehr vorhanden sind. Für die lentivirale Transduktion von C2C12-Zellen in einem Sicherheitswerkbank der Sicherheitsstufe zwei 4 × 10⁶ 293T-Zellen in einer 100-Millimeter-Platte mit HEK293-Zellkulturmedium ansäen.Am nächsten Tag mischen Sie die lentiviralen Packaging-Vektoren mit acht Mikrogramm des entsprechenden lentiviralen Transfervektors in einem Milliliter serumfreiem Zellkulturmedium. Vortexen Sie die Mischung kurz und geben Sie 36 Mikroliter vorgewärmtes Transfektionsreagenz hinzu. Vortexen Sie das Medium anschließend weitere 30 Sekunden und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten.Am Ende der Inkubation das Transfektionsgemisch den 293T-Zellen hinzufügen, die Platte vorsichtig schwenken und die Zellen zurück in den Inkubator stellen. Nach 24 Stunden das Transfektionsgemisch durch 10 Milliliter frisches Kulturmedium ersetzen. Nach 48 Stunden das Lentivirus enthaltende Überstand in ein 50-Milliliter-Konischglas zur Lagerung bei vier Grad Celsius überführen und 10 Milliliter frisches, warmes Medium in die Platte geben.Nach 60 Stunden das zweite Überstandsgemisch mit dem Lentivirus, das nach 48 Stunden gesammelt wurde, vereinigen und das Virus zentrifugieren, um zelluläre Trümmer zu entfernen. Anschließend 0,5 mL Lentivirus zu einer 30 bis 40 % konfluenten Kultur von C2C12 CUG200-Zellen hinzufügen, die wie gerade gezeigt in einer 60-mm-Platte kultiviert werden. 72 Stunden nach der Transfektion den Überstand mit frischem Medium ersetzen, das mit dem geeigneten Selektionsantibiotikum ergänzt wurde.Das Kulturmedium fünf Tage lang täglich mit frischem, mit Selektionsantibiotikum angereichertem Medium erneuern, bis alle nicht transduzierten C2C12 CUG200-Kontrollzellen abgestorben sind. Nach der Selektion mittels Medikamentenresistenz können die GFP-Expression und die Bildung von Myotuben in differenzierten Myoblasten durch eine fluoreszenzmikroskopische Analyse beurteilt werden. Die Quantifizierung der Myotubenbildung in diesem repräsentativen Experiment zeigt, dass die Fusionsindizes und die Myotubenflächen durch die abnormale CUG-Expansion sowie in GFP CUG 200-transfizierten Zellen signifikant verringert sind.Die Hochregulation von Celf1 ist außerdem mit der CUG-Expansion bei myogener Dystrophie Typ eins assoziiert. Weiterhin zeigen Western-Blot-Analysen durchgängig eine Erhöhung der Celf1-Proteinspiegel bei gehemmter Expression von MyoD, MyoG und Mef2C durch CUG während der Differenzierung. Dies legt nahe, dass die CUG-Expansion Myotubusdefekte und eine beeinträchtigte Myoblastendifferenzierung induziert.Die Western-Blot-Analyse zeigt außerdem, dass das mit einem FLAG-Tag markierte Celf1 nur in mit retroviralem Vektor transduzierten Kulturen vorhanden ist und dass seine Expression in diesen Kulturen hochreguliert ist. Tatsächlich ist die Bildung von Myotuben in Zellen mit Celf1-Überexpression im Vergleich zu Kontrollkulturen selten. Dies legt nahe, dass die Überexpression von Celf1 die Differenzierung von Myoblasten erheblich beeinträchtigt.Außerdem ist der Spiegel des endogenen Celf1-Proteins und der doppelt antibiotisch selektierten, mit einem lentiviralen Vektor transduzierten GFP-CUG-200-Zellen deutlich verringert in Gegenwart von Celf1-short-hairpin-RNA. Dabei wurde die Bildung von Myotuben, die Myotuben-Fusionsindizes und die Myotuben-Areale in diesen Kulturen wiederhergestellt. Gleichzeitig deuten Echtzeit-RTPCR-Ergebnisse darauf hin, dass die Expression von MyoD, MyoG und Mef2C in Zellen, die Celf1-short-hairpin-RNA exprimieren, signifikant erhöht ist, was die Möglichkeit unterstützt, dass eine Verringerung von Celf1 die Differenzierungsdefizite in diesen Kulturen behebt.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Dichte der C2C12-Zellen unter 70 Prozent Konfluenz zu halten. Nach der Zelltransfektion die Zellen mindestens vier, jedoch höchstens zwölf Stunden mit serumfreiem Medium behandeln. Gleichzeitig die Zytotoxizität der Zellen überwachen.Mithilfe der Plasmid-Transfektion sowie der retroviralen und lentiviralen Transduktion haben wir erfolgreich ein Zellmodell für die myotone Dystrophie etabliert, das der Forschung an dieser und anderen Muskelerkrankungen zugutekommen wird.

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