Name: RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Erfahren Sie die gezielte RNA-Sequenzierung zur Anreicherung spezifischer Transkripte für Next-Generation-Sequencing. Diese kosteneffiziente Methode ermöglicht die schnelle Analyse von Genexpression, Mutationen und Genfusionen.

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Wir danken besonders Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto und Eric Samorodnitsky für die technische Unterstützung. Wir möchten uns auch bei Jenny Badillo für ihre administrative Unterstützung unseres Teams bedanken. Wir danken dem Ohio Supercomputer Center (OSC) für die Bereitstellung von Speicherplatz, Verarbeitungskapazität und Support für die Durchführung unserer Analysen. Wir danken dem Comprehensive Cancer Center (CCC) am Wexner Medical Center der Ohio State University für die administrative Unterstützung dieser Arbeit. S.R. und sein Team werden von der American Cancer Society (MRSG-12-194-01-TBG), einem Young Investigator Award der Prostate Cancer Foundation, NHGRI (UM1HG006508-01A1), der Fore Cancer Research Foundation, der American Lung Association und Pelotonia unterstützt.

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<li>Kim, D., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat-Fusion%3A+an+algorithm+for+discovery+of+novel+fusion+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts.</a> Genome Biol. 12, R72(2011).</li>
<li>Fernandez-Cuesta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+fusion+genes+in+lung+cancer+using+breakpoint+assembly+of+transcriptome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data.</a> Genome Biol. 16, 7(2015).</li>
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S.R. erhält von Novartis und Ariad Pharmaceuticals Mittel für die Durchführung klinischer Studien. Unmittelbare Familienmitglieder von S.R. besitzen Aktien von Johnson and Johnson.

RNA-Seq Capture ist eine Zwischen Strategie zwischen RNA-Seq und Microarray-Ansätze für einen ausgewählten Teil der Transkriptom-Auswertung. Die Vorteile von Capture beinhalten Kosten, schnelle Durchlaufzeit auf einem Desktop-Sequenzer, einen hohen Durchsatz und der Nachweis genomischer Veränderungen reduziert. Das Verfahren angepasst werden kann , nicht-kodierenden RNAs 23, erkennen single nucleotide zu charakterisieren Varianten 4-6, RNA - Splicing untersuchen und 24 Genfusionen oder s...

Whole transcriptom or RNA sequencing (RNAseq) ist eine unvoreingenommene Sequenzierungsmethode zur Bewertung aller RNA-Produkte. Das Ziel von targeted RNAseq (Capture) ist eine fokussierte Evaluierung ausgewählter Transkripte mit erhöhter Sensitivität, dynamischem Bereich, reduzierten Kosten oder Skalenumfang und erhöhtem Durchsatz im Vergleich zu Standard-RNAseq. Ähnlich wie bei Standard-RNAseq können gezielte Anreicherungsanreicherungsansätze verwendet werden, um die Genexpression, mehrere RNA-Spezies wie mRNA, microRNA (miRNA), lncRNA1, andere nichtkodierende RNAs2, Genfusionen3 und Mutationen4-6 zu bewerten.
Capture beinhaltet die Hybridisierung von komplementären Oligonukleotiden, um cDNA-Bibliotheken für die Sequenzierung anzureichern. Die Begründung für die RNAseq-Erfassung ist ähnlich wie bei Microarray-Ansätzen, bei denen komplementäre Oligonukleotide oder Sonden mit Proben hybridisiert und dann auf relative Häufigkeit gemessen werden. Bei Microarray-Technologien basiert die Expression auf dem relativen Signal, das für Transkripte gemessen wird, die an diese Sonden binden. Microarrays sind daher durch die Reichweite, das potenzielle Hintergrundrauschen durch unspezifische Bindung und die Kreuzhybridisierung von Sonden begrenzt. Darüber hinaus haben Arrays im Vergleich zuRNAseq 1 einen begrenzten Dynamikbereich für niedrig und stark exprimierte Transkripte. Microarrays werden aufgrund ihrer reduzierten Kosten und ihrer hohen Durchsatzkapazität im Vergleich zu RNAseq häufig eingesetzt. 
Hier demonstrieren wir eine Methode zur RNAseq-Erfassung, die einen Mittelweg zwischen RNAseq- und Microarray-Ansätzen zur Bewertung des Transkriptoms bietet. RNAseq Capture verfügt über einen mittleren Durchsatz, einen größeren Dynamikbereich und eine höhere Empfindlichkeit und ist für eine schnelle Bearbeitung auf Desktop-Sequenzierern skaliert. Die RNAseq-Erfassung erfordert auch einen reduzierten Rechenaufwand in Bezug auf Speicherplatz und Datenverarbeitung.

<table><tbody><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Biology Grade Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock 24 x 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagenzienkit v2 (300- </td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Desktop Sequencer</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2301</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Universelles Blockierungs-Oligo - TS-p5</td><td>IDT</td><td>127040822</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Universelles Blockierungs-Oligo - TS-p7(6nt)</td><td>IDT</td><td>127040823</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Universelles Blockierungs-Oligo - TS-p7(8nt)</td><td>IDT</td><td>127040824</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&reg; AMPure&reg; XP - PCR-Aufreinigungskügelchen&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&reg; M-270 Streptavidin</td><td>Life Technologies</td><td>65305</td><td></td></tr><tr><td>COT Menschliche DNA, fluorometrische Qualität, 1 mg</td><td>Roche Applied Science</td><td>05480647001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; Analyseröhrchen&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; dsDNA HS Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap&reg; EZ Hybridisierungs- und Waschkits&nbsp; (24 oder 96 Reaktionen)</td><td>Roche NimbleGen&nbsp;</td><td>05634261001 oder 05634253001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg 2.0 Fluorometer&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>10 x 2 ml IDTE pH 8,0 (1x TE Lösung)</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Life Technologies</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Thermocycler mit 96&ndash; Well Fast Rection Module</td><td>Biorad</td><td>185-1196</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ Hybridisierungs- und Waschkits</td><td>Roche Applied Science</td><td>05634253001</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transkription 200 u/&#956; l</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP - 40 ml</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Leiter</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5578</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Probenpuffer</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5577</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>DYNAMAG -96 SIDE EACH</td><td>Life Technologies</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart ReadyMix</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>My Block Mini Trockenbad</td><td>Benchmark</td><td>BSH200</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reagenzien</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067- 5583</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>022829861&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

rna-sequenzierung assay gezieltes genexpression und genomic Änderungen an charakterisieren

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist ein vielseitiges Verfahren, die verwendet werden können, um die Genexpression, Mutationen Genfusionen und nichtkodierenden RNAs nachzuweisen und zu charakterisieren. Standard-RNA-Seq erfordert 30-100000000 Sequenzierung liest und können mehrere RNA-Produkte wie mRNA und nicht-kodierenden RNAs enthalten. Wir zeigen, wie gezielte RNA-Seq (Capture) ermöglicht eine gezielte Untersuchung an ausgewählten RNA-Produkte einen Desktop-Sequenzer. RNA-Seq-Capture können unkommentierte, niedrig, charakterisieren oder transient Transkripte ausgedrückt, die sonst übersehen werden traditionelle RNA-Seq-Methoden. Hier beschreiben wir die Extraktion von RNA aus Zelllinien, ribosomale RNA Verarmungs, cDNA-Synthese, Herstellung von barcodierten Bibliotheken, Hybridisierung und Einfangen von Ziel Transkripte und multiplex-Sequenzierung auf einem Desktop-Sequenzer. Wir skizzieren auch die rechnerische Analyse-Pipeline, die Bewertung der Qualitätskontrolle beinhaltet, Ausrichtung, Fusion Erkennung, Genexpression Quantifizierung und Identifizierung von einzelnen Nukleotide Varianten. Dieser Test ermöglicht die gezielte Sequenzierung Transkript Genexpression, Genfusionen und Mutationen zu charakterisieren.

Eine schematische Hervorhebung Schlüsselschritte in RNA-Seq - Capture ist in Fig . 1 vier Krebszelllinien mit bekannten Mutationen , die Wirksamkeit der RNA-Seq - Capture - Technik (K562 mit ABL1 Fusion, LC2 mit RET - Fusion, EOL1 mit PDGFRalpha Fusion und RT- verwendet wurde gezeigt , demonstrieren 4 mit FGFR3 Fusion). Die vier Proben wurden gepoolt und sequenziert mit 2x 100 bp auf einem Desktop-Sequenzer liest, die ...

Wir beschreiben eine zielgerichtete RNA-Sequenzierungsmethode, die die Vorbereitung indizierter cDNA-Bibliotheken, Hybridisierung und Erfassung mit benutzerdefinierten Sonden und Datenanalyse umfasst, um ausgewählte Transkripte auf Genexpression, Mutationen und Genfusionen zu untersuchen. Targeted RNAseq ermöglicht die kostengünstige und schnelle Auswertung ausgewählter Transkripte auf einem Desktop-Sequenzierer.

RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Das übergeordnete Ziel dieses Assays besteht darin, Zieltranskripte für die Sequenzierung der nächsten Generation anzureichern. Dieser gezielte RNA-Sequenzierungs-Assay ist ein mehrstufiges Verfahren, das mit der Depletion ribosomaler RNA aus Gesamt-RNA beginnt, gefolgt von chemischer Fragmentierung und Synthese komplementärer DNA, der Herstellung barcodierter Bibliotheken, der Hybridisierung und Anreicherung gezielter Transkripte, der multiplexierten Sequenzierung und endet mit der Datenanalyse. In diesem Video werden die Verfahren für Hybridisierung, gezielte Anreicherung und PCR-Amplifikation nach der Anreicherung für vier Proben demonstriert.Daher kann diese Methode dabei helfen, zentrale Fragen der Molekularbiologie zu beantworten, wie beispielsweise die Identifizierung von Genfusionen, Einzelnukleotidvariationen, relativer Genexpression und alternativer Spleißen, die gezielte Transkripte betreffen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie für beliebige Gene von Interesse anpassbar ist. Um mit dem Hybridisierungsschritt zu beginnen, entnehmen Sie dem -20 °C-Gefrierschrank und tauchen auf Eis folgende Reagenzien auf: kundenspezifische hydratisierte Sonden, Cot-1-DNA, universelle blockierende Oligos und adapterspezifische blockierende Oligos.In einem Low-Bindings-Röhrchen mit 1,5 Milliliter geben Sie 500 Nanogramm DNA-Proben, 5 Mikroliter Cot-1-DNA, ein Mikroliter universelle Blockier-Oligos, 0,5 Mikroliter sechsnukleotid-spezifische Adapter-Blockier-Oligos und 0,5 Mikroliter achtnukleotid-spezifische Adapter-Blockier-Oligos zusammen. Stellen Sie das Probenröhrchen mit geöffnetem Deckel in einen Vakuumkonzentrator, wobei der Deckel in die entgegengesetzte Drehrichtung weist. Trocknen Sie den Inhalt bei 45 Grad Celsius für 20 Minuten oder bis zur vollständigen Verdunstung der Flüssigkeit.Als Nächstes suspendieren Sie den getrockneten Inhalt erneut in 8,5 µL 2x Hybridisierungspuffer, 3,4 µL Hybridisierungskomponente A und 1,1 µL nukleasefreiem Wasser. Lassen Sie die Re-Suspension 10 Minuten lang unter Vortexen alle 2,5 Minuten stattfinden. Überführen Sie das resuspendierte Material in eine 0,2-mL-PCR-Röhrchen und inkubieren Sie es in einem Thermocycler bei 95 °C für 10 Minuten.Entfernen Sie das Hybridisierungsprobengefäß aus dem Thermocycler und geben Sie zwei Mikroliter maßgeschneiderter Sonden hinzu, die in einer Konzentration von 1,5 Pikomol pro Mikroliter resuspendiert wurden. Inkubieren Sie die Hybridisierungsreaktion über Nacht bei 65 Grad Celsius. Der nächste Schritt nach der multiplexen Hybridisierung ist die Anreicherung der gezielten RNA unter Verwendung von Streptavidin-gekoppelten paramagnetischen Kügelchen.Entnehmen Sie eine Flasche mit Perlen aus dem vier Grad Celsius kalten Bereich und äquilibrieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Bereiten Sie 1x-Arbeitslösungen aller benötigten Puffer vor. Portionieren Sie 140 Mikroliter 1x Waschpuffer eins in ein frisches 1,5-Milliliter-Gefäß ab.Erhitzen Sie diesen aliquoten Puffer und die gesamte Menge des 1x stringenter Puffers für mindestens zwei Stunden bei 65 Grad Celsius in einem Wärmeprotokoll. Portionieren Sie die geeignete Menge an Kügelchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie es in den magnetischen Trennhalter und entfernen Sie den Überstand.Fügen Sie Waschpuffer für die Kügelchen hinzu und wirbeln Sie 10 Sekunden lang vortexartig um. Stellen Sie das Röhrchen für zwei bis fünf Minuten oder bis das Überstand klar ist in ein magnetisches Trenngestell. Entsorgen Sie den Überstand.Wiederholen Sie dies insgesamt zwei Waschungen. Nach dem Entfernen des Bead-Waschpuffers fügen Sie ein gleiches Volumen Bead-Waschpuffer hinzu, wie das ursprüngliche Startvolumen. Resuspendieren Sie die Probe und überführen Sie sie in eine 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen.Stellen Sie das Röhrchen zwei bis fünf Minuten lang oder bis die Überstände klar sind auf ein Magnetgestell. Entsorgen Sie den Überstand. Stellen Sie das Röhrchen mit den Perlen in einen Mini-Heizblock bei 65 Grad Celsius.Überführen Sie die Hybridisierungsprobe in das Röhrchen mit den Kügelchen, pipettieren Sie 10-mal auf und ab, um sie zu mischen, und inkubieren Sie sie 45 Minuten bei 65 Grad Celsius. Vortexen Sie die Probe alle 15 Minuten und zentrifugieren Sie sie für vier Sekunden mit einer festen Drehzahl in einer Tischminizentrifuge. Sobald die 45-minütige Inkubation abgeschlossen ist, nehmen Sie das Capture-Röhrchen vom Wärmeblock. Fügen Sie 100 Mikroliter vorgewärmtes 1x Waschpuffer eins dem Röhrchen hinzu und wirbeln Sie 10 Sekunden lang, um zu mischen. Überführen Sie das Gemisch in ein neues, niedrig-bindendes 1,5-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie das Röhrchen in den Magnetständer und lassen Sie zwei bis fünf Minuten zur Trennung ab, oder bis der Überstand klar ist.Entfernen Sie den Überstand. Geben Sie 200 Mikroliter vorgewärmten 1x strengen Waschpuffer hinzu und pipettieren Sie 10-mal auf und ab, um zu mischen. Inkubieren Sie bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten.Stellen Sie das Röhrchen in den Magnetständer und lassen Sie es zwei bis drei Minuten zur Trennung stehen. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die stringente Waschung einmal, sodass insgesamt zwei Waschungen durchgeführt werden.Geben Sie 200 Mikroliter 1x Waschpuffer eins mit Raumtemperatur hinzu und wirbeln Sie zwei Minuten lang, um zu mischen. Stellen Sie das Röhrchen in den Magnetständer, lassen Sie es zwei bis fünf Minuten zur Trennung stehen und entfernen Sie den Überstand. Geben Sie 200 Mikroliter 1x Waschpuffer zwei mit Raumtemperatur hinzu und wirbeln Sie eine Minute lang, um zu mischen.Stellen Sie das Röhrchen für zwei bis fünf Minuten in den Magnetrack und entsorgen Sie anschließend den Überstand. Geben Sie 200 Mikroliter 1x Waschpuffer drei bei Raumtemperatur hinzu und wirbeln Sie 30 Sekunden lang, um die Probe zu mischen. Stellen Sie das Röhrchen für zwei bis fünf Minuten in den Magnetrack und entsorgen Sie anschließend den Überstand.Entfernen Sie abschließend das Röhrchen vom magnetischen Trennstand und geben Sie 20 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu, um die Perlen erneut in Lösung zu bringen. Mischen Sie gründlich durch zehnmaliges Auf- und Abpipettieren. Vor dem Aufbau der PCR-Amplifikation nach der Anreicherung nehmen Sie die paramagnetischen Perlen von vier Grad Celsius und lassen Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibrieren.Entfernen Sie die 2x Hot-Start-PCR-Fertigmischung und die PCR-Primer-Mischung aus dem Gefrierschrank bei -20 °C, tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf und stellen Sie sie anschließend auf Eis. Bereiten Sie eine Mastermischung für die Bibliotheksamplifikation vor, indem Sie 27,5 µL 2x Hot-Start-PCR-Fertigmischung, 2,75 µL PCR-Primer eins und 2,75 µL PCR-Primer zwei kombinieren. Richten Sie die Reaktion in einem PCR-Röhrchen ein, indem Sie 20 µL der Kugeln mit gebundener DNA mit 30 µL der Mastermischung für die Bibliotheksamplifikation versetzen.Schließen Sie das Röhrchen ordnungsgemäß und wirbeln Sie es, um es zu mischen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen vier Sekunden lang mit einer festen Geschwindigkeit in einer kleinen Tischzentrifuge bei sechsfacher Erdbeschleunigung. Stellen Sie das Röhrchen in den Thermocycler und starten Sie die PCR-Amplifikation mit dem folgenden PCR-Programm: Eine initiale Denaturierung bei 98 Grad Celsius für 45 Sekunden, 10 bis 12 Zyklen mit Denaturierung bei 98 Grad Celsius für 15 Sekunden, Annealing bei 65 Grad Celsius für 30 Sekunden und Extension bei 72 Grad Celsius für 60 Sekunden.Ein letzter Verlängerungszyklus bei 75 Grad Celsius für 60 Sekunden und anschließende Inkubation bei vier Grad Celsius. Wenn die PCR abgeschlossen ist, entnehmen Sie die Probe aus dem Thermocycler. Geben Sie 75 Mikroliter paramagnetische Kügelchen hinzu, mischen Sie gründlich und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.Stellen Sie das Röhrchen zwei bis drei Minuten lang bei Raumtemperatur in das Magnetgestell und entfernen Sie anschließend den Überstand. Waschen Sie die Perlen auf dem Magneten, indem Sie 200 Mikroliter 80-prozentiges Ethanol hinzufügen, 30 Sekunden lang inkubieren und dann den Überstand entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt insgesamt zweimal.Nach dem Entfernen des Überstandes aus der zweiten Ethanol-Waschung bei Raumtemperatur fünf bis zehn Minuten inkubieren, um die Trocknung der Kügelchen zu ermöglichen, jedoch nicht so lange, dass sie austrocknen und reißen. Die Kügelchen in 22 Mikrolitern Tris-EDTA pH 8,0 resuspendieren und drei Minuten zur Elution zugestehen. Die Probe drei bis fünf Minuten auf den Magneten stellen.Überführen Sie abschließend 20 Mikroliter des eluierten Produkts in ein frisches, low-binding 1,5-Milliliter-Röhrchen, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Beads mitübertragen werden. Ein Vergleich der Genexpression zwischen der Capture-Methode und der nicht gezielten RNA-Sequenzierung in vier Krebszelllinien zeigte, dass die Capture-Methode die gezielten Gene, dargestellt in Blau, um das 10- bis 1000-fache gegenüber den nicht gezielten Genen, dargestellt in Grau, anreicherte. Zusätzlich war der Anteil der Reads, die auf gezielte Regionen abgebildet wurden, in den Capture-basierten Bibliotheken im Vergleich zu den nicht gezielten RNA-Sequenzierungsbibliotheken erhöht.Eine Bewertung der Qualitätskontrollmaßnahmen zeigte, dass die Capture- und die nichtzielgerichtete RNA-Sequenzierung hinsichtlich der Alignierung an das Transkriptom und die Hauptinsertgröße gleich gut abschneiden. Bei Verwendung der Capture-Methode wurden ein höherer Prozentsatz exoner Regionen und ein geringerer Prozentsatz introner Regionen sequenziert. Wie erwartet, erzeugte die nichtzielgerichtete RNA-Sequenzierung pro Probe über 50-mal mehr Gesamtsequenzierungsreads als die Capture-Methode.Bei Verwendung der Capture-Methode war der Prozentsatz an ribosomalen RNA-Sequenzen in jeder Probe geringer. Schließlich zeigen Vergleiche von Einzelnukleotidvarianten, die in überlappenden Bereichen von Capture- und RNA-Sequenzierung für jede der vier Zelllinien identifiziert wurden, eine hohe Übereinstimmung der Varianz zwischen Capture- und RNA-Sequenzierung innerhalb des Zielbereichs. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in drei bis vier Tagen durchgeführt werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, bei der Erfassung der hybridisierten Zielstrukturen schnell zu arbeiten und sicherzustellen, dass die Reaktion bei 65 Grad Celsius gehalten wird. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik es Forschern auf dem Gebiet der Molekularbiologie ermöglicht, Transkripte von Interesse auf eine hochdurchsatzfähige und kosteneffiziente Weise zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

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