Name: RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Erfahren Sie die gezielte RNA-Sequenzierung zur Anreicherung spezifischer Transkripte für Next-Generation-Sequencing. Diese kosteneffiziente Methode ermöglicht die schnelle Analyse von Genexpression, Mutationen und Genfusionen.

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Wir danken besonders Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto und Eric Samorodnitsky für die technische Unterstützung. Wir möchten uns auch bei Jenny Badillo für ihre administrative Unterstützung unseres Teams bedanken. Wir danken dem Ohio Supercomputer Center (OSC) für die Bereitstellung von Speicherplatz, Verarbeitungskapazität und Support für die Durchführung unserer Analysen. Wir danken dem Comprehensive Cancer Center (CCC) am Wexner Medical Center der Ohio State University für die administrative Unterstützung dieser Arbeit. S.R. und sein Team werden von der American Cancer Society (MRSG-12-194-01-TBG), einem Young Investigator Award der Prostate Cancer Foundation, NHGRI (UM1HG006508-01A1), der Fore Cancer Research Foundation, der American Lung Association und Pelotonia unterstützt.

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Mercer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sequencing+for+gene+discovery+and+quantification+using+RNA+CaptureSeq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq.</a> Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).</li>
<li>Maher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+transcript+discovery+by+paired-end+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).</li>
<li>Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+identification+of+genomic+variants+from+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data.</a> Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).</li>
<li>Quinn, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+strategies+for+SNP+detection+in+RNA-seq+data%3A+application+to+lymphoblastoid+cell+lines+and+evaluation+using+1000+Genomes+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data.</a> PLoS One. 8, e58815(2013).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eSNV-detect%3A+a+computational+system+to+identify+expressed+single+nucleotide+variants+from+transcriptome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data.</a> Nucleic Acids Res. 42, e172(2014).</li>
<li>Invitrogen. Qubit dsDNA HS Assay Kit Manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf">http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf</a> (2010).</li>
<li>Agilent. Agilent D1000 ScreenTape System Quick Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf">http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf</a> (2013).</li>
<li>Illumina. Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq®. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf</a> (2013).</li>
<li>Illumina. MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html">https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html</a> (2012).</li>
<li>Andrews, S. FastQC. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2015).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14, R36(2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>Broad Institute. Picard. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> (2014).</li>
<li>DeLuca, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-SeQC%3A+RNA-seq+metrics+for+quality+control+and+process+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization.</a> Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).</li>
<li>Van der Auwera, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+FastQ+data+to+high+confidence+variant+calls%3A+the+Genome+Analysis+Toolkit+best+practices+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline.</a> Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li>
<li>Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChimeraScan%3A+a+tool+for+identifying+chimeric+transcription+in+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data.</a> Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).</li>
<li>Kim, D., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat-Fusion%3A+an+algorithm+for+discovery+of+novel+fusion+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts.</a> Genome Biol. 12, R72(2011).</li>
<li>Fernandez-Cuesta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+fusion+genes+in+lung+cancer+using+breakpoint+assembly+of+transcriptome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data.</a> Genome Biol. 16, 7(2015).</li>
<li>Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncofuse%3A+a+computational+framework+for+the+prediction+of+the+oncogenic+potential+of+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions.</a> Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).</li>
<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gene+profiling+of+long+noncoding+RNAs+with+targeted+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing.</a> Nat Methods. 12, 339-342 (2015).</li>
<li>Cieslik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exome+capture+RNA-seq+for+highly+degraded+RNA+with+application+to+clinical+cancer+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing.</a> Genome Res. , (2015).</li>
<li>Cabanski, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cDNA+hybrid+capture+improves+transcriptome+analysis+on+low-input+and+archived+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples.</a> J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).</li>
<li>Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+screening%3A+from+the+RT-PCR+to+the+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Lung+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq.</a> Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA-Seq+by+poly+%28A%29+capture%2C+ribosomal+RNA+depletion%2C+and+DNA+microarray+for+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling.</a> BMC Genomics. 15, 419(2014).</li>
</ol>

S.R. erhält von Novartis und Ariad Pharmaceuticals Mittel für die Durchführung klinischer Studien. Unmittelbare Familienmitglieder von S.R. besitzen Aktien von Johnson and Johnson.

RNA-Seq Capture ist eine Zwischen Strategie zwischen RNA-Seq und Microarray-Ansätze für einen ausgewählten Teil der Transkriptom-Auswertung. Die Vorteile von Capture beinhalten Kosten, schnelle Durchlaufzeit auf einem Desktop-Sequenzer, einen hohen Durchsatz und der Nachweis genomischer Veränderungen reduziert. Das Verfahren angepasst werden kann , nicht-kodierenden RNAs 23, erkennen single nucleotide zu charakterisieren Varianten 4-6, RNA - Splicing untersuchen und 24 Genfusionen oder s...

Whole transcriptom or RNA sequencing (RNAseq) ist eine unvoreingenommene Sequenzierungsmethode zur Bewertung aller RNA-Produkte. Das Ziel von targeted RNAseq (Capture) ist eine fokussierte Evaluierung ausgewählter Transkripte mit erhöhter Sensitivität, dynamischem Bereich, reduzierten Kosten oder Skalenumfang und erhöhtem Durchsatz im Vergleich zu Standard-RNAseq. Ähnlich wie bei Standard-RNAseq können gezielte Anreicherungsanreicherungsansätze verwendet werden, um die Genexpression, mehrere RNA-Spezies wie mRNA, microRNA (miRNA), lncRNA1, andere nichtkodierende RNAs2, Genfusionen3 und Mutationen4-6 zu bewerten.
Capture beinhaltet die Hybridisierung von komplementären Oligonukleotiden, um cDNA-Bibliotheken für die Sequenzierung anzureichern. Die Begründung für die RNAseq-Erfassung ist ähnlich wie bei Microarray-Ansätzen, bei denen komplementäre Oligonukleotide oder Sonden mit Proben hybridisiert und dann auf relative Häufigkeit gemessen werden. Bei Microarray-Technologien basiert die Expression auf dem relativen Signal, das für Transkripte gemessen wird, die an diese Sonden binden. Microarrays sind daher durch die Reichweite, das potenzielle Hintergrundrauschen durch unspezifische Bindung und die Kreuzhybridisierung von Sonden begrenzt. Darüber hinaus haben Arrays im Vergleich zuRNAseq 1 einen begrenzten Dynamikbereich für niedrig und stark exprimierte Transkripte. Microarrays werden aufgrund ihrer reduzierten Kosten und ihrer hohen Durchsatzkapazität im Vergleich zu RNAseq häufig eingesetzt. 
Hier demonstrieren wir eine Methode zur RNAseq-Erfassung, die einen Mittelweg zwischen RNAseq- und Microarray-Ansätzen zur Bewertung des Transkriptoms bietet. RNAseq Capture verfügt über einen mittleren Durchsatz, einen größeren Dynamikbereich und eine höhere Empfindlichkeit und ist für eine schnelle Bearbeitung auf Desktop-Sequenzierern skaliert. Die RNAseq-Erfassung erfordert auch einen reduzierten Rechenaufwand in Bezug auf Speicherplatz und Datenverarbeitung.

<table><tbody><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Biology Grade Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock 24 x 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagenzienkit v2 (300- </td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Desktop Sequencer</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2301</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Universelles Blockierungs-Oligo - TS-p5</td><td>IDT</td><td>127040822</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Universelles Blockierungs-Oligo - TS-p7(6nt)</td><td>IDT</td><td>127040823</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Universelles Blockierungs-Oligo - TS-p7(8nt)</td><td>IDT</td><td>127040824</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&reg; AMPure&reg; XP - PCR-Aufreinigungskügelchen&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&reg; M-270 Streptavidin</td><td>Life Technologies</td><td>65305</td><td></td></tr><tr><td>COT Menschliche DNA, fluorometrische Qualität, 1 mg</td><td>Roche Applied Science</td><td>05480647001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; Analyseröhrchen&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; dsDNA HS Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap&reg; EZ Hybridisierungs- und Waschkits&nbsp; (24 oder 96 Reaktionen)</td><td>Roche NimbleGen&nbsp;</td><td>05634261001 oder 05634253001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg 2.0 Fluorometer&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>10 x 2 ml IDTE pH 8,0 (1x TE Lösung)</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Life Technologies</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Thermocycler mit 96&ndash; Well Fast Rection Module</td><td>Biorad</td><td>185-1196</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ Hybridisierungs- und Waschkits</td><td>Roche Applied Science</td><td>05634253001</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transkription 200 u/&#956; l</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP - 40 ml</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Leiter</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5578</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Probenpuffer</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5577</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>DYNAMAG -96 SIDE EACH</td><td>Life Technologies</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart ReadyMix</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>My Block Mini Trockenbad</td><td>Benchmark</td><td>BSH200</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reagenzien</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067- 5583</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>022829861&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

rna-sequenzierung assay gezieltes genexpression und genomic Änderungen an charakterisieren

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist ein vielseitiges Verfahren, die verwendet werden können, um die Genexpression, Mutationen Genfusionen und nichtkodierenden RNAs nachzuweisen und zu charakterisieren. Standard-RNA-Seq erfordert 30-100000000 Sequenzierung liest und können mehrere RNA-Produkte wie mRNA und nicht-kodierenden RNAs enthalten. Wir zeigen, wie gezielte RNA-Seq (Capture) ermöglicht eine gezielte Untersuchung an ausgewählten RNA-Produkte einen Desktop-Sequenzer. RNA-Seq-Capture können unkommentierte, niedrig, charakterisieren oder transient Transkripte ausgedrückt, die sonst übersehen werden traditionelle RNA-Seq-Methoden. Hier beschreiben wir die Extraktion von RNA aus Zelllinien, ribosomale RNA Verarmungs, cDNA-Synthese, Herstellung von barcodierten Bibliotheken, Hybridisierung und Einfangen von Ziel Transkripte und multiplex-Sequenzierung auf einem Desktop-Sequenzer. Wir skizzieren auch die rechnerische Analyse-Pipeline, die Bewertung der Qualitätskontrolle beinhaltet, Ausrichtung, Fusion Erkennung, Genexpression Quantifizierung und Identifizierung von einzelnen Nukleotide Varianten. Dieser Test ermöglicht die gezielte Sequenzierung Transkript Genexpression, Genfusionen und Mutationen zu charakterisieren.

Eine schematische Hervorhebung Schlüsselschritte in RNA-Seq - Capture ist in Fig . 1 vier Krebszelllinien mit bekannten Mutationen , die Wirksamkeit der RNA-Seq - Capture - Technik (K562 mit ABL1 Fusion, LC2 mit RET - Fusion, EOL1 mit PDGFRalpha Fusion und RT- verwendet wurde gezeigt , demonstrieren 4 mit FGFR3 Fusion). Die vier Proben wurden gepoolt und sequenziert mit 2x 100 bp auf einem Desktop-Sequenzer liest, die ...

Wir beschreiben eine zielgerichtete RNA-Sequenzierungsmethode, die die Vorbereitung indizierter cDNA-Bibliotheken, Hybridisierung und Erfassung mit benutzerdefinierten Sonden und Datenanalyse umfasst, um ausgewählte Transkripte auf Genexpression, Mutationen und Genfusionen zu untersuchen. Targeted RNAseq ermöglicht die kostengünstige und schnelle Auswertung ausgewählter Transkripte auf einem Desktop-Sequenzierer.

RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Das übergeordnete Ziel dieses Assays besteht darin, Zieltranskripte für die Sequenzierung der nächsten Generation anzureichern. Dieser gezielte RNA-Sequenzierungs-Assay ist ein mehrstufiges Verfahren, das mit der Depletion ribosomaler RNA aus Gesamt-RNA beginnt, gefolgt von chemischer Fragmentierung und Synthese komplementärer DNA, der Herstellung barcodierter Bibliotheken, der Hybridisierung und Anreicherung gezielter Transkripte, der multiplexierten Sequenzierung und endet mit der Datenanalyse. In diesem Video werden die Verfahren für Hybridisierung, gezielte Anreicherung und PCR-Amplifikation nach der Anreicherung für vier Proben demonstriert.Daher kann diese Methode dabei helfen, zentrale Fragen der Molekularbiologie zu beantworten, wie beispielsweise die Identifizierung von Genfusionen, Einzelnukleotidvariationen, relativer Genexpression und alternativer Spleißen, die gezielte Transkripte betreffen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie für beliebige Gene von Interesse anpassbar ist. Um mit dem Hybridisierungsschritt zu beginnen, entnehmen Sie dem -20 °C-Gefrierschrank und tauchen auf Eis folgende Reagenzien auf: kundenspezifische hydratisierte Sonden, Cot-1-DN

targeted-rna-sequencing-assay-to-characterize-gene-expression-genomic

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben die Herstellung von mit Strichcode-DNA-Bibliotheken und die anschließende Hybridisierung Basis Exon Erfassung zur Erkennung von Schlüssel Krebs-assoziierten Mutationen in der klinischen Tumorproben von massiv parallelen Sequenzierung der "nächsten Generation". Gezielte Exon-Sequenzierung bietet die Vorteile der hohen Durchsatz, geringe Kosten, und tiefe Sequenzabdeckung, woraus sich eine hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Niederfrequenz-Mutationen.

Erkennen Somatische Genetische Veränderungen in Tumorproben von Exon-Abscheidung und-Massively Parallel Sequencing

RNA-Sequenzierung und Bioinformatik-Analysen wurden verwendet, um deutlich und differentiell exprimiert Transkriptionsfaktoren in Lin-CD34 + und Lin-CD34- Subpopulationen von Maus EMLcells identifizieren. Diese Transkriptionsfaktoren könnten eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Wechsel zwischen Selbsterneuerung Lin-CD34 + und teilweise differenziert Lin-CD34- Zellen spielen.

Identifizierung von Schlüsselfaktoren Regelselbsterneuerung und Differenzierung in EML hämatopoetischen Vorläuferzellen durch RNA-Sequenzierungsanalyse

Ein integriertes System für die gezielte Next-Generation-Sequenzierung von onkologischen Proben wird beschrieben. Dieses plattformübergreifende System ist für Tumorbiopsien von geringer Qualität und geringen Mengen optimiert, ermöglicht geringe DNA-Eingaben, umfasst gut charakterisierte Mehrvariantenkontrollen und verfügt über einen neuartigen Variantenaufrufer, der auf quantitativen präanalytischen Qualitätskontrollmaßnahmen basiert.

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

Hier haben wir ein Protokoll beschreiben bei der Untersuchung der Auswirkungen von anomalen Spleißen auf Medikamentenresistenz bei soliden Tumoren und hämatologischen Malignitäten ausgerichtet. Zu diesem Ziel haben wir analysiert , die transkriptomischen Profile der elterlichen und beständig in - vitro - Modellen durch RNA-seq und gründete eine qRT-PCR - basierte Methode Kandidatengene zu validieren.

Mit RNA-Sequenzierung Neuartige Splice-Varianten zu Arzneimittelresistenz mit Bezug zu erkennen in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Hier beschreiben wir einen in Situ Hybridisierung Test sensitiver und spezifischer Nachweis von Sequenzen so kurz wie 50 Nukleotide mit Einzel-Nukleotid-Auflösung auf die einzelne Zelle Ebene ermöglicht. Assays, die manuell oder automatisch ausgeführt werden kann, kann Visualisierung von Splice-Varianten, kurze Sequenzen und Mutationen im Zusammenhang mit Gewebe ermöglichen.

Visualisierung von genetischen Varianten, kurze Ziele und Punktmutationen in Zusammenhang mit morphologischen Gewebe mit einem RNA In Situ Hybridisierung Assay

MiRNA-Therapeutika haben erhebliches Potenzial bei der Regulierung der Tumorprogression. Hier demonstriert werden analytische Ansätze zur Identifikation der Aktivität einer kombinatorischen MiRNA-Behandlung in der Eindämmung des Zellzyklus und Angiogenese verwendet.

Analyse der kombinatorischen MiRNA Behandlungen zur Regulierung des Zellzyklus und Angiogenese

Hier zeigen die Autoren den Nutzen von MULTI-seq für die Phänotypisierung und nachfolgende gepaarte scRNA-seq und scATAC-seq bei der Charakterisierung der transkriptomischen und chromatinischen Zugänglichkeitsprofile in der Netzhaut.

Multiplexe Analyse der retinalen Genexpression und der Chromatinzugänglichkeit mittels scRNA-seq und scATAC-seq

Hier stellen wir ein Protokoll für die Durchführung von Gen-Knockouts vor, die in vivo in gentechnisch veränderten Mausmodell-abgeleiteten Tumoren embryonal tödlich sind, und bewerten dann die Wirkung, die der Knockout auf Tumorwachstum, Proliferation, Überleben, Migration, Invasion und das Transkriptom in vitro und in vivo hat.

Definition von Genfunktionen in der Tumorgenese durch Ex-vivo-Ablation von Flox-Allelen in bösartigen peripheren Nervenscheidentumorzellen

Das Protokoll beschreibt einen Tandem-Immunfluoreszenz-Hybridisierungsassay mit formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe zum gleichzeitigen Nachweis und zur Quantifizierung von microRNA und Multiplexproteinen.

MicroRNA-Amplifikation und -Erkennung durch In-situ-Hybridisierung mit gesperrten Nukleinsäuren als neuartige Detektions- und Quantifizierungsmethode

Dieses Verfahren beschreibt, wie primäre hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus zu etablieren und wird durch Transfektion mit dem Gene Pulser MXCell Elektroporation Systems.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

Erfahren Sie die gezielte RNA-Sequenzierung zur Anreicherung spezifischer Transkripte für Next-Generation-Sequencing. Diese kosteneffiziente Methode ermöglicht die schnelle Analyse von Genexpression, Mutationen und Genfusionen.

RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

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