RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

Das übergeordnete Ziel dieses Assays besteht darin, Zieltranskripte für die Sequenzierung der nächsten Generation anzureichern. Dieser gezielte RNA-Sequenzierungs-Assay ist ein mehrstufiges Verfahren, das mit der Depletion ribosomaler RNA aus Gesamt-RNA beginnt, gefolgt von chemischer Fragmentierung und Synthese komplementärer DNA, der Herstellung barcodierter Bibliotheken, der Hybridisierung und Anreicherung gezielter Transkripte, der multiplexierten Sequenzierung und endet mit der Datenanalyse. In diesem Video werden die Verfahren für Hybridisierung, gezielte Anreicherung und PCR-Amplifikation nach der Anreicherung für vier Proben demonstriert.

Daher kann diese Methode dabei helfen, zentrale Fragen der Molekularbiologie zu beantworten, wie beispielsweise die Identifizierung von Genfusionen, Einzelnukleotidvariationen, relativer Genexpression und alternativer Spleißen, die gezielte Transkripte betreffen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie für beliebige Gene von Interesse anpassbar ist. Um mit dem Hybridisierungsschritt zu beginnen, entnehmen Sie dem -20 °C-Gefrierschrank und tauchen auf Eis folgende Reagenzien auf: kundenspezifische hydratisierte Sonden, Cot-1-DNA, universelle blockierende Oligos und adapterspezifische blockierende Oligos.

In einem Low-Bindings-Röhrchen mit 1,5 Milliliter geben Sie 500 Nanogramm DNA-Proben, 5 Mikroliter Cot-1-DNA, ein Mikroliter universelle Blockier-Oligos, 0,5 Mikroliter sechsnukleotid-spezifische Adapter-Blockier-Oligos und 0,5 Mikroliter achtnukleotid-spezifische Adapter-Blockier-Oligos zusammen. Stellen Sie das Probenröhrchen mit geöffnetem Deckel in einen Vakuumkonzentrator, wobei der Deckel in die entgegengesetzte Drehrichtung weist. Trocknen Sie den Inhalt bei 45 Grad Celsius für 20 Minuten oder bis zur vollständigen Verdunstung der Flüssigkeit.

Als Nächstes suspendieren Sie den getrockneten Inhalt erneut in 8,5 µL 2x Hybridisierungspuffer, 3,4 µL Hybridisierungskomponente A und 1,1 µL nukleasefreiem Wasser. Lassen Sie die Re-Suspension 10 Minuten lang unter Vortexen alle 2,5 Minuten stattfinden. Überführen Sie das resuspendierte Material in eine 0,2-mL-PCR-Röhrchen und inkubieren Sie es in einem Thermocycler bei 95 °C für 10 Minuten.

Entfernen Sie das Hybridisierungsprobengefäß aus dem Thermocycler und geben Sie zwei Mikroliter maßgeschneiderter Sonden hinzu, die in einer Konzentration von 1,5 Pikomol pro Mikroliter resuspendiert wurden. Inkubieren Sie die Hybridisierungsreaktion über Nacht bei 65 Grad Celsius. Der nächste Schritt nach der multiplexen Hybridisierung ist die Anreicherung der gezielten RNA unter Verwendung von Streptavidin-gekoppelten paramagnetischen Kügelchen.

Entnehmen Sie eine Flasche mit Perlen aus dem vier Grad Celsius kalten Bereich und äquilibrieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Bereiten Sie 1x-Arbeitslösungen aller benötigten Puffer vor. Portionieren Sie 140 Mikroliter 1x Waschpuffer eins in ein frisches 1,5-Milliliter-Gefäß ab.

Erhitzen Sie diesen aliquoten Puffer und die gesamte Menge des 1x stringenter Puffers für mindestens zwei Stunden bei 65 Grad Celsius in einem Wärmeprotokoll. Portionieren Sie die geeignete Menge an Kügelchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie es in den magnetischen Trennhalter und entfernen Sie den Überstand.

Fügen Sie Waschpuffer für die Kügelchen hinzu und wirbeln Sie 10 Sekunden lang vortexartig um. Stellen Sie das Röhrchen für zwei bis fünf Minuten oder bis das Überstand klar ist in ein magnetisches Trenngestell. Entsorgen Sie den Überstand.

Wiederholen Sie dies insgesamt zwei Waschungen. Nach dem Entfernen des Bead-Waschpuffers fügen Sie ein gleiches Volumen Bead-Waschpuffer hinzu, wie das ursprüngliche Startvolumen. Resuspendieren Sie die Probe und überführen Sie sie in eine 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen.

Stellen Sie das Röhrchen zwei bis fünf Minuten lang oder bis die Überstände klar sind auf ein Magnetgestell. Entsorgen Sie den Überstand. Stellen Sie das Röhrchen mit den Perlen in einen Mini-Heizblock bei 65 Grad Celsius.

Überführen Sie die Hybridisierungsprobe in das Röhrchen mit den Kügelchen, pipettieren Sie 10-mal auf und ab, um sie zu mischen, und inkubieren Sie sie 45 Minuten bei 65 Grad Celsius. Vortexen Sie die Probe alle 15 Minuten und zentrifugieren Sie sie für vier Sekunden mit einer festen Drehzahl in einer Tischminizentrifuge. Sobald die 45-minütige Inkubation abgeschlossen ist, nehmen Sie das Capture-Röhrchen vom Wärmeblock.

Fügen Sie 100 Mikroliter vorgewärmtes 1x Waschpuffer eins dem Röhrchen hinzu und wirbeln Sie 10 Sekunden lang, um zu mischen. Überführen Sie das Gemisch in ein neues, niedrig-bindendes 1,5-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie das Röhrchen in den Magnetständer und lassen Sie zwei bis fünf Minuten zur Trennung ab, oder bis der Überstand klar ist.

Entfernen Sie den Überstand. Geben Sie 200 Mikroliter vorgewärmten 1x strengen Waschpuffer hinzu und pipettieren Sie 10-mal auf und ab, um zu mischen. Inkubieren Sie bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten.

Stellen Sie das Röhrchen in den Magnetständer und lassen Sie es zwei bis drei Minuten zur Trennung stehen. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die stringente Waschung einmal, sodass insgesamt zwei Waschungen durchgeführt werden.

Geben Sie 200 Mikroliter 1x Waschpuffer eins mit Raumtemperatur hinzu und wirbeln Sie zwei Minuten lang, um zu mischen. Stellen Sie das Röhrchen in den Magnetständer, lassen Sie es zwei bis fünf Minuten zur Trennung stehen und entfernen Sie den Überstand. Geben Sie 200 Mikroliter 1x Waschpuffer zwei mit Raumtemperatur hinzu und wirbeln Sie eine Minute lang, um zu mischen.

Stellen Sie das Röhrchen für zwei bis fünf Minuten in den Magnetrack und entsorgen Sie anschließend den Überstand. Geben Sie 200 Mikroliter 1x Waschpuffer drei bei Raumtemperatur hinzu und wirbeln Sie 30 Sekunden lang, um die Probe zu mischen. Stellen Sie das Röhrchen für zwei bis fünf Minuten in den Magnetrack und entsorgen Sie anschließend den Überstand.

Entfernen Sie abschließend das Röhrchen vom magnetischen Trennstand und geben Sie 20 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu, um die Perlen erneut in Lösung zu bringen. Mischen Sie gründlich durch zehnmaliges Auf- und Abpipettieren. Vor dem Aufbau der PCR-Amplifikation nach der Anreicherung nehmen Sie die paramagnetischen Perlen von vier Grad Celsius und lassen Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibrieren.

Entfernen Sie die 2x Hot-Start-PCR-Fertigmischung und die PCR-Primer-Mischung aus dem Gefrierschrank bei -20 °C, tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf und stellen Sie sie anschließend auf Eis. Bereiten Sie eine Mastermischung für die Bibliotheksamplifikation vor, indem Sie 27,5 µL 2x Hot-Start-PCR-Fertigmischung, 2,75 µL PCR-Primer eins und 2,75 µL PCR-Primer zwei kombinieren. Richten Sie die Reaktion in einem PCR-Röhrchen ein, indem Sie 20 µL der Kugeln mit gebundener DNA mit 30 µL der Mastermischung für die Bibliotheksamplifikation versetzen.

Schließen Sie das Röhrchen ordnungsgemäß und wirbeln Sie es, um es zu mischen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen vier Sekunden lang mit einer festen Geschwindigkeit in einer kleinen Tischzentrifuge bei sechsfacher Erdbeschleunigung. Stellen Sie das Röhrchen in den Thermocycler und starten Sie die PCR-Amplifikation mit dem folgenden PCR-Programm: Eine initiale Denaturierung bei 98 Grad Celsius für 45 Sekunden, 10 bis 12 Zyklen mit Denaturierung bei 98 Grad Celsius für 15 Sekunden, Annealing bei 65 Grad Celsius für 30 Sekunden und Extension bei 72 Grad Celsius für 60 Sekunden.

Ein letzter Verlängerungszyklus bei 75 Grad Celsius für 60 Sekunden und anschließende Inkubation bei vier Grad Celsius. Wenn die PCR abgeschlossen ist, entnehmen Sie die Probe aus dem Thermocycler. Geben Sie 75 Mikroliter paramagnetische Kügelchen hinzu, mischen Sie gründlich und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Stellen Sie das Röhrchen zwei bis drei Minuten lang bei Raumtemperatur in das Magnetgestell und entfernen Sie anschließend den Überstand. Waschen Sie die Perlen auf dem Magneten, indem Sie 200 Mikroliter 80-prozentiges Ethanol hinzufügen, 30 Sekunden lang inkubieren und dann den Überstand entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt insgesamt zweimal.

Nach dem Entfernen des Überstandes aus der zweiten Ethanol-Waschung bei Raumtemperatur fünf bis zehn Minuten inkubieren, um die Trocknung der Kügelchen zu ermöglichen, jedoch nicht so lange, dass sie austrocknen und reißen. Die Kügelchen in 22 Mikrolitern Tris-EDTA pH 8,0 resuspendieren und drei Minuten zur Elution zugestehen. Die Probe drei bis fünf Minuten auf den Magneten stellen.

Überführen Sie abschließend 20 Mikroliter des eluierten Produkts in ein frisches, low-binding 1,5-Milliliter-Röhrchen, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Beads mitübertragen werden. Ein Vergleich der Genexpression zwischen der Capture-Methode und der nicht gezielten RNA-Sequenzierung in vier Krebszelllinien zeigte, dass die Capture-Methode die gezielten Gene, dargestellt in Blau, um das 10- bis 1000-fache gegenüber den nicht gezielten Genen, dargestellt in Grau, anreicherte. Zusätzlich war der Anteil der Reads, die auf gezielte Regionen abgebildet wurden, in den Capture-basierten Bibliotheken im Vergleich zu den nicht gezielten RNA-Sequenzierungsbibliotheken erhöht.

Eine Bewertung der Qualitätskontrollmaßnahmen zeigte, dass die Capture- und die nichtzielgerichtete RNA-Sequenzierung hinsichtlich der Alignierung an das Transkriptom und die Hauptinsertgröße gleich gut abschneiden. Bei Verwendung der Capture-Methode wurden ein höherer Prozentsatz exoner Regionen und ein geringerer Prozentsatz introner Regionen sequenziert. Wie erwartet, erzeugte die nichtzielgerichtete RNA-Sequenzierung pro Probe über 50-mal mehr Gesamtsequenzierungsreads als die Capture-Methode.

Bei Verwendung der Capture-Methode war der Prozentsatz an ribosomalen RNA-Sequenzen in jeder Probe geringer. Schließlich zeigen Vergleiche von Einzelnukleotidvarianten, die in überlappenden Bereichen von Capture- und RNA-Sequenzierung für jede der vier Zelllinien identifiziert wurden, eine hohe Übereinstimmung der Varianz zwischen Capture- und RNA-Sequenzierung innerhalb des Zielbereichs. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in drei bis vier Tagen durchgeführt werden.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, bei der Erfassung der hybridisierten Zielstrukturen schnell zu arbeiten und sicherzustellen, dass die Reaktion bei 65 Grad Celsius gehalten wird. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik es Forschern auf dem Gebiet der Molekularbiologie ermöglicht, Transkripte von Interesse auf eine hochdurchsatzfähige und kosteneffiziente Weise zu untersuchen.