Name: Stripe Assay die anziehende oder abstoßende Aktivität eines Proteins Substrat unter Verwendung Dissociated Neuronen im Hippocampus zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Stripe-Assay-Methode zur Untersuchung anziehender oder abstoßender Axon-Führungsmoleküle mit dissoziierten Hippocampus-Neuronen. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Analyse zahlreicher Wachstumskegel.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grants-in-Aid for Scientific Research von der Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 und 26670090 to S.Y.).

Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an Hamamatsu University School of Medicine zugelassen. 1. Herstellung von Matrices <ol><li> Sieden 4-8 Silikon-Matrices in einer Mikrowelle oder auf einer heißen Platte für 5 min und lassen sie für 1 h unter laminaren Strömungs (striped Seite nach oben) vollständig trocknen. Hinweis: Die folgenden Verfahren sollten unter laminaren Strömung durchgeführt werden. </li><li> Preßluft oder verwenden transparente Klebeband Staub von der gestreiften Seite der Matrizen zu entfernen. Halten Sie die gestreifte Seite sauber, so dass es fest an der Plattenoberfläche haften. </li><li> Vorsichtig die Matrizen auf 6 cm Plastikschalen, indem sie mit einem Finger (eine Matrix pro Schale; Streifen Seite nach unten) drücken. Vermeiden Sie Luftblasen zwischen der Matrix und zu dem Teller. Markieren die Lage der Streifen auf der Unterseite der Kulturschale. </li><li> Wenn die Matrix zu befestigen fehlschlägt, wiederholen Sie die Schritte 1.2. </li></ol>2. Streifen Erzeugung und Laminin Beschichtung für Neuron Kultur <ol><li> Bereiten fluoreszierend markiertes rekombinantes Protein (25 &amp; mgr; l jeder Injektions [Schritt 2.2] bzw. 100 &amp; mgr; l jeweils für die Platzierungsmethode [Schritt 2.2.1]) durch Mischen des Fc-tagged Protein (10-50 ug / ml) und einen fluoreszierenden Farbstoff konjugierten anti-human Fc Antikörper (1 bis 3 Verhältnis: 30-150 &amp; mgr; g / ml) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Dann Inkubieren der Mischung für 30 min bei RT. </li><li> Verwendung einer 22-G - Spritze, injizieren 25 &amp; mgr; l des rekombinanten Proteins im vorherigen Schritt (2.1) durch das kleine Loch auf der Seite der Matrix (Pfeile in 1A, 1C und 1E). <ol><li> Alternativ setzen 100 ul des rekombinanten Proteins in den oberen Schlitz der Matrix und Aspirat etwa die Hälfte der Lösung aus dem kleinen Loch (Pfeile in 1A, 1C und 1E), so daß das rekombinante Protein bleibt in den Streifenbereichen. </li></ol></li><li> Inkubieren Sie die Schale für 30 min bei 37 ° C in einem Zellkulturbrutschrank. </li><li> Platzieren 300 ul PBS in den oberen Schlitz (1B) und Aspirat aus dem kleinen Loch auf der Seite der Matrix angeordnet (Pfeile in Figur 1A, C und E) zu entfernen unattached rekombinanter Proteine. Sie nicht das PBS vollständig absaugen, weil die Proteine ​​trocken wird. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. (3-mal insgesamt) </li><li> Vorsichtig die Matrix zu entfernen und sofort platzieren ~ 100 ul Kontrollprotein (10-50 ug / ml; Fc) den gesamten Streifenbereich abzudecken, eine alternative Beschichtung zu schaffen. Dann brüten die Schale für 30 min bei 37 ° C in der Zellkultur-Inkubator. </li><li> Nach der Geschirroberfläche dreimal Waschen mit PBS, streicht es mit ~ 100 ul von 20 ug / ml Laminin in PBS. Hinweis: Laminin sollte auf Eis aufgetaut werden Erstarrung zu verhindern. </li><li> Inkubiere die Schale für 1 h bei 37 ° C in der Zellkultur-Inkubator. </li><li> Waschen Sie die Geschirroberfläche dreimal mit PBS und Kultur medi hinzufügenÄh. Legen Sie die beschichtete Schale mit Kulturmedium in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 3. Anzucht Neuronen im Hippocampus von E15.5 Maus Embryonen <ol><li> Euthanize Mutter über Genickbruch und zu isolieren, drei E15.5 Embryonen. </li><li> Schneiden Sie die Haut und Schädel sagital an der Mittellinie des Kopfes mit einer Schere, und entfernen Sie das Gehirn einen kleinen Löffel. Übertragen, das Gehirn vorsichtig zu einer 60-mm-Petrischale mit 3 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). </li><li> Mit einem Skalpell ausgeschnitten die Hemisphären einschließlich Cortex, Hippocampus und Striatum (2A). Dann sezieren aus dem Hippocampus - Region durch sorgfältig die Meningen zu entfernen, und übertragen Sie die seziert Hippocampus - Gewebe in ein 15-ml - Zentrifugenröhrchen mit 2 ml HBSS - Lösung, auf Eis (2B-C). Sammelt 6 Hippocampi von 3 Embryonen in der Röhre, die zum Züchten von Neuronen in 8 Geschirr ausreichend sind. </li><li> Ersetzen Sie die HBSS-Lösung mit Trypsin / EDTA-Lösung (2 ml) und das Röhrchen bei 37 ° C für 15 min in einem Wasserbad inkubiert. Hinweis: Aspirate HBSS ohne Zentrifugation und nicht die HBSS-Lösung dekantieren, indem das Röhrchen Neigen. </li><li> Neutralisieren des Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 500 ul fötales Rinderserum (FBS). </li><li> Zentrifugieren der Mischung bei 100 g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und wäscht das Pellet mit 2 ml Kulturmedium. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. </li><li> Pipettieren die hippocampi nach oben und unten 10-mal in Kulturmedium, das eine 1000-ul Spitze mit einem großen Loch mit (Cut-Spitze), um das Gewebe zu distanzieren. </li><li> Wechseln Sie zu einem regelmäßigen (uncut) 1000-ul Spitze und pipettieren die dissoziierten up Gewebe und unten eine Einzelzellsuspension zu erhalten. </li><li> Trennen Sie die einzelnen Zellen, indem sie durch eine 80-100-um-Mesh-Zelle Sieb vorbei. </li><li> Zentrifugieren Sie die gefilterte Einzelzellsuspension bei 150 g für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen und resuspendieren Pellet (Neuronen) in 2 ml Kulturmedium. </li><li> Zählen Sie die Zellen einer Zählkammer mit Trypan-Blau-Färbung mit der Dichte und die Lebensfähigkeit zu bestimmen. Dann Platte 10.000 Neuronen in 150 ul Kulturmedium für jede Gruppe von stripes.The Suspension sollte sorgfältig den gesamten Streifenbereich abzudecken platziert werden. </li></ol> 4. Visualisierung von Zellkörper und Axone durch Immunfluoreszenzanfärbung unter Verwendung eines Anti-Tau1 Antikörper <ol><li> Nach 24 Stunden Kultur absaugen Medium ohne die anhaftenden Zellen zu stören, und befestigen Sie die Neuronen, die mit vorgewärmter 4% Paraformaldehyd (PFA) / 4% Saccharose / PBS bei RT für 15 min. </li><li> Waschen Sie die Plattenoberfläche 3-mal mit PBS. Falls gewünscht, verwenden Sie einen wasserabstoßenden Stift einen Kreis um den gestreiften Bereich zu ziehen benötigt, um die Menge an Antikörper zu verringern. </li><li> Permeabilisierung die Neuronen mit 0,3% Triton X-100/5 min PBS. </li><li> Inkubieren der Neuronen mit Blocking-Lösung enthaltend 3% Eselserum und 0,1% Triton X-100 für30 min, gefolgt von einer Inkubation mit einem Anti-Tau1 Antikörper (1: 200) in 1% Eselsserum / 0,1% Triton X-100 / PBS O / N bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Plattenoberfläche 3-mal mit PBS. Inkubieren der Neuronen mit einem Fluorophor-konjugierten Anti-Maus-IgG-Antikörper in 1% Rinderserumalbumin (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS für 30 min. </li><li> Waschen Sie die Plattenoberfläche 3-mal mit PBS. Decken Sie den Streifenbereich mit einer 18 mm x 18 mm Deckglas mit 50 ul Antifade-Lösung. vermeiden Luftblasen, die mit der Abbildungs ​​stören. </li><li> Erhalten Fluoreszenzbilder mit einem Fluoreszenzmikroskop das entsprechende System, beispielsweise x10 Objektivlinse, Filtersätze für GFP und RFP und 1000 msec Belichtungszeit (Abbildung 3). </li></ol>

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<li>Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).</li>
<li>Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stripe+assay%3A+studying+growth+preference+and+axon+guidance+on+binary+choice+substrates+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro.</a> Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functional+relevance+of+the+Slit2+homodimerization+domain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain.</a> EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).</li>
<li>Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+of+ephrin%2FEph+forward+and+reverse+signaling+as+the+driving+force+of+adaptive+topographic+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping.</a> Development. 139 (2), 335-345 (2012).</li>
<li>Atapattu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+binding+the+ADAM10+substrate+recognition+domain+inhibit+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function.</a> J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).</li>
<li>Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2Fephrin+interactions+modulate+muscle+satellite+cell+motility+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning.</a> Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT+Structure%3A+Balancing+Repulsion+and+Cell+Adhesion+in+Cortical+and+Vascular+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development.</a> Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).</li>
<li>Yamagishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT2+and+FLRT3+act+as+repulsive+guidance+cues+for+Unc5-positive+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons.</a> EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll beschreibt einen Streifen Assay, rekombinantes Protein und dissoziierte Neuronen aus dem Hippocampus E15.5 Maus verwendet. Dieser Assay ermöglicht die effiziente Beobachtung repulsive, attraktiv, oder neutrale Antworten von Neuronen auf ein rekombinantes Protein von Interesse in einem gestreiften Muster angeordnet. Ein wesentlicher Vorteil dieses Protokolls ist die einfache Methode für die Streifen zu erzeugen, in dem das Protein direkt auf die Oberfläche einer Kunststoffschale aufgedruckt ist, im Vergl...

Axon Führung ist der Prozess , durch den neu gebildeten Neuronen Axone zu ihrem Ziel bei der Entwicklung des Nervensystems 1,2 senden. Die Entwicklung Axone tragen eine sehr bewegliche Struktur an ihrer Spitze der Wachstumskegel genannt. Der Wachstumskegel spürt extrazelluläre Signale des Axons in den Weg zu navigieren. Guidance Moleküle, wie Spalt, Semaphorin und Ephrinen kann Axone in Abhängigkeit von ihrer Wechselwirkung mit geeigneten Rezeptoren und Co-Rezeptoren auf der Axon 1,3,4 anziehen oder abstoßen. Die aktivierten Rezeptoren übertragen Signale an den Wachstumskegel, der seine Organisation des Zytoskeletts für Axon und wachstums Kegel Bewegungen beeinflussen. Verschiedene Verfahren wurden entwickelt, um die Wirkung der Lockstoff und abweisende Moleküle zu bewerten. Chemo-Lockstoffen und Repellentien können mit einem Gradienten - Konzentration (z. B. Dunn Kammer oder μ-Dias) 5,6, in einer hochkonzentrierten Stelle von Mikro-p in das Wachstum / Kulturmedium verabreicht werdenipette (z. B. Drehen assay) 7 oder mit einer homogenen Konzentration von Badanwendung (z. B. Wachstumskegel collapse assay) 8,9. Andere Verfahren umfassen ein Streifentest oder Mikrokontakt- Drucken ( &amp; mgr ; CP), in dem eine chemo-Lockstoff oder Repellent auf der Oberfläche einer Platte als Substrat 10-12 beschichtet ist. Thestripe Test wurde ursprünglich von Bonhoeffer und Kollegen im Jahr 1987 entwickelte 13 topographische Kartierung in den Küken retino-tectal System zu analysieren. Die ursprüngliche Methode benötigt, um ein Vakuumsystem zur Beschichtung von Proteinen auf Polycarbonat Nukleopore Membranen mit gestreiften und vermaschten Matrizen. In späteren Versionen wurden die rekombinanten Proteine ​​auf der Oberfläche einer Kulturplatte in einem Streifenmuster mit schmalen Schlitz Silizium - Matrizen 14,15 direkt gedruckt. In jüngster Zeit haben verschiedene Forschergruppen erfolgreich angewendet diesen Streifen - Assay auf die Analyse von Axon Führung Molekülaktivitäten 16-21. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Hier präsentieren wir die detaillierte Protokoll für einen Streifen Assay, der die Anziehung oder Abstoßung von Axon Führung Moleküle für die dissoziierten Neuronen im Hippocampus misst. Bemerkenswert ist, kann dieses Verfahren in der minimal ausgestatteten Labor-Einstellungen angewendet werden. Für diesen Assay abwechselnde Streifen aus einem fluoreszenzmarkierten Substrat und einem Kontrollprotein sind auf einer Kunststoffschale erzeugt eine Siliciummatrix mit 90 &amp; mgr; m Schlitzen und beschichtet mit Laminin verwenden. In unserer Demonstration, distanzierte Neuronen im Hippocampus von E15.5 Mäusen auf abwechselnden Streifen von rekombinanten Ektodomäne von Fibronektin und Leucin-reichen Transmembranprotein-2 (FLRT2) und Kontroll - Fc - Protein 21 kultiviert. Nach 24 h der Kultur, sowohl die Axone und Zellkörper der Neuronen wurden aus den FLRT2 Streifen stark abgestoßen. Anfärbung mit einem Antikörper anti-Tau1 ergab, dass ~ 90% der Neuronen auf der Fc-beschichteten Bereiche verteilt wurden, im Vergleich zu ~ 10% auf die FLRT2-Fc, das anzeigt, daß eine starke Abstoßungs FLRT2 hatFunktion für Neuronen im Hippocampus 21.

<table><tbody><tr><td>15 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Violamo&nbsp;</td><td>1-3500-01</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Nacalai</td><td>01954-85</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Human-IgG-Antikörper</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11013</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Esel-Anti-Maus-IgG-Antikörper</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21203</td><td>Verdünnung 1/500</td></tr><tr><td>Anti-Tau1-Antikörper</td><td>Chemicon</td><td>MAB3420</td><td>Verdünnung 1/200</td></tr><tr><td>Anti-Fading</td><td>Thermo Scientific</td><td>P7481</td><td>Alternative Einbettmedien können verwendet werden</td></tr><tr><td>B27-Ergänzung</td><td>Thermo Scientific</td><td>17504-044</td><td>Verdünnung 1/50</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>01-2030-2</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb 100 um</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugationsmaschine</td><td>Kubota</td><td>2410</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 18mmx18mm</td><td>Matsunami</td><td>18x18 mm Nr. 1</td><td></td></tr><tr><td>DAKO Stift</td><td>DAKO</td><td>S2002</td><td>Alternativer wasserabweisender Stift kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Einwegskalpell</td><td>Feder</td><td>2975#11</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td>E600</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Nr. 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050-061</td><td>Verdünnung 1/100</td></tr><tr><td>Hamilton Spritze</td><td>Hamilton</td><td>805N</td><td>22 Gauge, 50 uL</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Scientific</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Humanes IgG, Fc-Fragment</td><td>Jackson</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Thermo Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Normales Eselserum</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15070-063</td><td>Verdünnung 1/100</td></tr><tr><td>Kulturschale aus Kunststoff, 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Silikonmatrizen</td><td></td><td></td><td>Erhältlich und käuflich erhältlich bei Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Tip, 1000 uL</td><td>Watson</td><td>125-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Transparentes Klebeband</td><td>Tesa</td><td>57315</td><td>Alternatives Klebeband kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau, 0,4%</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Kulturmedium</td><td></td><td></td><td>Neurobasal, ergänzt mit B27, GlutaMAX und Penicillin-Streptomycin.</td></tr></tbody></table>

stripe assay die anziehende oder abstoßende aktivität eines proteins substrat unter verwendung dissociated neuronen im hippocampus zu studieren

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Wachsende Axone entwickeln an ihrer Spitze eine stark bewegliche Struktur, die als Wachstumskegel bezeichnet wird. Der Wachstumskegel kontaktiert extrazelluläre Umweltreize, um das axonale Wachstum zu steuern. Netrin, Slit, Semaphorin und Ephrine sind bekannte Leitmoleküle, die Axone anziehen oder abstoßen können, wenn sie an Rezeptoren und Co-Rezeptoren auf dem Axon binden. Die aktivierten Rezeptoren initiieren verschiedene Signalmoleküle im Wachstumskegel, die die Struktur und Bewegung des Neurons verändern. Hier beschreiben wir das detaillierte Protokoll für einen Stripe-Assay zur Beurteilung der Fähigkeit eines Leitmoleküls, Neuronen anzuziehen oder abzustoßen. Bei dieser Methode werden dissoziierte Hippocampus-Neuronen von E15.5-Mäusen auf lamininbeschichteten Schalen kultiviert, die mit abwechselnden Streifen der Ektodomäne von Fibronektin und leucinreichem Transmembranprotein-2 (FLRT2) und dem Immunglobulin-G (IgG)-Fragment kristallisierbare Region (Fc)-Protein verarbeitet wurden. Sowohl Axone als auch Zellkörper wurden nach 24 h Kultur stark von den FLRT2-beschichteten Streifenregionen abgestoßen. Die Immunfärbung mit tau1 zeigte, dass ~90% der Neuronen auf den Fc-beschichteten Streifen verteilt waren, verglichen mit den FLRT2-Fc-beschichteten Streifen (~10%). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass FLRT2 eine stark abstoßende Wirkung auf diese Neuronen hat. Diese leistungsstarke Methode ist nicht nur für primär kultivierte Neuronen anwendbar, sondern auch für eine Vielzahl anderer Zellen, wie z. B. Neuroblasten.

Dissociated Neuronen im Hippocampus von E15.5 Mäusen wurden plattiert und für 24 h auf Streifen von fluoreszenzmarkierten Kontroll - Fc (3A-C) oder FLRT2-Fc (3D-F) mit nicht-markierten Kontroll - Fc abwechseln. In beiden Fällen waren die Neuronen aggregiert und erweitert ihre Axone als Bündel. Auf der Kontroll - Fc / Fc Streifen wurden die Neuronen gleichmäßig auf die fluoreszenzmarkierten und nicht-markierten Streifen verteilt, und sie erweitert ihre Ax...

Axonleitmoleküle regulieren die neuronale Migration und die gezielte Navigation des Wachstumskegels. Wir stellen eine leistungsfähige Methode, den Stripe-Assay, vor, um die Fähigkeit von Leitmolekülen zu beurteilen, Neuronen anzuziehen oder abzustoßen. In diesem Protokoll demonstrieren wir den Stripe-Assay, indem wir die Fähigkeit von FLRT2 zeigen, kultivierte Hippocampus-Neuronen abzustoßen.

Stripe Assay die anziehende oder abstoßende Aktivität eines Proteins Substrat unter Verwendung Dissociated Neuronen im Hippocampus zu studieren

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Das übergeordnete Ziel des Streifenassays besteht darin, die Fähigkeit bestimmter Proteine, wie zum Beispiel Leitungs­moleküle, zu beurteilen, Neurone anzuziehen oder abzustoßen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Axonleitung zu beantworten, beispielsweise, wie Neurone wandern oder ihre Axone als Reaktion auf die äußere zelluläre Umgebung verlängern können. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass eine große Anzahl von Neuronen in einem einzigen Experiment sichtbar gemacht und viele Wachstumskappen gleichzeitig analysiert werden können.Zur Vorbereitung vier bis acht Silikonmatrizen fünf Minuten lang in Wasser kochen. Anschließend vollständig unter einer laminaren Luftströmung mit den gestreiften Seiten nach oben trocknen lassen. Dies dauert etwa eine Stunde.Arbeiten Sie weiterhin im Abzug. Verwenden Sie Druckluft oder Klebeband, um Staub auf der gestreiften Seite der Matrizen zu entfernen. Platzieren Sie anschließend jede Matrix vorsichtig mit der gestreiften Seite nach unten in eine separate Kunststoffschale mit sechs Zentimeter Durchmesser.Mit einem Finger jede Matrix fest andrücken. Es sollte vermieden werden, Luftblasen zwischen der Matrix und der Schale einzuschließen. Falls die Matrix nicht haftet, den Vorgang wiederholen.Markieren Sie nach dem Anbringen die Position der Streifen auf der Unterseite der Kulturschale. Bereiten Sie die fluoreszenzmarkierten rekombinanten Proteine in PBS vor. Stellen Sie 25 Mikroliter für jede gestreifte Schale her.Lassen Sie das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach pipettieren Sie für jede Schale 25 Mikroliter verdünntes Protein in eine 22-Gauge-Spritze und injizieren es durch die kleine Öffnung an der Seite der Matrix. Vermeiden Sie die Einspritzung von Luftblasen in die Matrizen, da diese die Bindung Ihrer Proteine an die Schalen stören würden.Jetzt die Schalen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Zellkultur-Inkubator inkubieren. Nach der Inkubation 300 Mikroliter PBS in den oberen Schlitz jeder Matrix geben. Anschließend das PBS aus einem kleinen Loch an der Seite jeder Matrix abziehen, um alle nicht gebundenen rekombinanten Proteine zu entfernen.Aspirieren Sie die PBS nicht vollständig, da die Proteine austrocknen würden. Führen Sie diese PBS-Spülung insgesamt dreimal durch. Entfernen Sie danach vorsichtig die Matrix aus jeder Schale. Gegeben Sie dann sofort etwa 100 Mikroliter des kontrollierten Proteins über die gesamte gestreifte Fläche, wodurch eine abwechselnde Beschichtung in jeder Schale entsteht. Inkubieren Sie anschließend die Schalen 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. In der Zwischenzeit tauen Sie Laminin und PBS auf Eis bei 20 Mikrogramm pro Milliliter auf.Nach 30 Minuten die Schalen dreimal mit PBS waschen. Dann jede Schale mit etwa 100 Mikrolitern kaltem Laminin beschichten und die Schalen für eine weitere Stunde in den Inkubator zurückstellen. Eine Stunde später die Schalen erneut dreimal mit PBS waschen.Nach der dritten Wäsche etwa 150 Mikroliter Kulturmedium zu jeder Petrischale hinzufügen. Anschließend die Schalen bis zum nächsten Gebrauch in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 °C inkubieren. Nach der Tötung einer spendenden E15,5-Maus die Haut und den Schädel mittig entlang der Kopfmedianebene mit einer chirurgischen Schere sagittal schneiden und das Gehirn mit einem Mikrospatel herausschaben.Überführen Sie das Gehirn vorsichtig in eine 60-Milliliter-Petri-Schale, die drei Milliliter HBSS enthält. Schneiden Sie in der Schale mit einem Skalpell die Hemisphären einschließlich Kortex, Hippocampus und Striatum aus. Danach dissectieren Sie die hippocampalen Regionen, indem Sie vorsichtig die Hirnhäute entfernen.Überführen Sie das dissezierte Hippocampus-Gewebe in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das zwei Milliliter HBSS-Lösung auf Eis enthält. Sechs Hippocampi von drei Embryonen reichen aus, um Neuronen auf acht Schalen zu kultivieren. Nachdem das gesamte Hippocampus-Gewebe gesammelt wurde, saugen Sie das HBSS ab und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter Trypsin-EDTA.Anschießend den Kolben 15 Minuten lang in einem Wasserbad mit 37 Grad Celsius inkubieren. Danach die Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 500 Mikroliter fetalem Kälberserum neutralisieren. Anschließend die Mischung bei 100 ×g fünf Minuten lang zentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit zwei Milliliter Kulturmedium. Zentrifugieren Sie danach die Probe erneut und ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium. Dissoziieren Sie das Gewebe nun durch vorsichtiges Pipettieren mit einem einkopfigen Pipettenspitzenende von einem Milliliter, dessen Spitze abgeschnitten wurde.Führen Sie das Gewebe etwa 10 Mal auf und ab durch die abgeschnittene Pipettenspitze. Verwenden Sie anschließend eine nicht abgeschnittene Ein-Milliliter-Spitze und wiederholen Sie die Trituration, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Isolieren Sie nun die Einzelzellen, indem Sie die Suspension durch einen Zellfilter mit einer Maschenweite von 80 bis 100 Mikrometer drücken.Anschließend die gefilterte Suspension fünf Minuten lang bei 150 G zentrifugieren, den Überstand abpipettieren und das Pellet in zwei Millilitern Kulturmedium resuspendieren. Die Zellen mit einem Hämozytometer zählen und 10.000 Neuronen in 150 Mikrolitern Kulturmedium auf jede vorbereitete Streifenplatte aussäen. Die Suspension vorsichtig so auftragen, dass der gesamte gestreifte Bereich bedeckt ist.Dissociierte hippocampale Neuronen von E15,5-Mäusen wurden auf Streifen des fluoreszenzmarkierten Kontrollproteins FC ausgesät und 24 Stunden lang kultiviert, oder die Neuronen wurden auf abwechselnden Streifen aus FLRT2-FC und nicht markiertem Kontroll-FC ausgesät. In beiden Fällen bildeten die Neuronen Aggregate und streckten ihre Axone als Bündel aus. Auf der FC-Kontrolle waren die Neuronen gleichmäßig verteilt und streckten ihre Axone in zufällige Richtungen aus. Im Gegensatz dazu mieden die Axone das Wachstum auf den FLRT2-FC-Bereichen, wenn sie mit FLRT2-FC-Streifen kultiviert wurden.Daher wuchsen die wachsenden Axone hauptsächlich auf den FC-Streifen. Bei höherer Vergr&ouml;&szlig;erung ist zu erkennen, dass die Axone entlang der Grenze zu den FLRT2-FC-Streifen wuchsen, jedoch nicht in das FLRT2-Gebiet hineinreichten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verst&auml;ndnis daf&uuml;r haben, wie man einen gestreiften Teppich aus den empfohlenen Proteinen herstellt und die attraktive oder absto&szlig;ende Wirkung mithilfe dissoziierter hippokampaler Neuronen bewertet.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von fünf Stunden durchgeführt werden.

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Dieses Video zeigt einen Antikörper-Fütterungsansatz, um den Transport von Glutamatrezeptoren in primären neuronalen Kulturen im Hippocampus zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglicht die Beobachtung von Rezeptorpopulationen sowohl an der Plasmamembran als auch an der inneren Membran. Die Unterscheidung zwischen diesen Untergruppen wird durch die Markierung der Rezeptoren vor und nach der Membranpermeabilisierung erreicht, wobei derselbe Primärantikörper, aber Sekundärantikörper verwendet werden,...

Eine In-vitro-Technik zur Untersuchung des Glutamatrezeptor-Handels in Hippocampus-Neuronen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Bewertung der Proteinaktivität mit Hilfe von Hippocampus-Neuronen über gemusterten Proteinzonen. Neuronen zeigen eine Abstoßung in den Testproteinzonen und eine Bindung in den Kontrollproteinzonen, was die Auswirkungen attraktiver oder abstoßender Proteinaktivität unterstreicht.

Bewertung der anziehenden oder abstoßenden Aktivität von Proteinen mit Hilfe von Hippocampus-Neuronen

Die reversible Zugabe von Palmitat an Proteine ​​ist ein wichtiger Regulator des intrazellulären Protein-Trafficking. Dies ist von besonderem Interesse, wo viele Neuronen synaptische Proteine ​​palmitoyliert. Wir nutzen einen einfachen biochemischen Verfahren zur palmitoylierten Proteinen in kultivierten Neuronen, die für mehrere Zelltypen und Gewebe angepasst werden kann zu detektieren.

Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Wir beschreiben ein Verfahren, um Protein auf der Oberfläche von lebenden Neuronen mit einem spezifischen polyklonalen Antikörper, der an die extrazelluläre Epitope zu beschriften. Protein, das von dem Antikörper auf der Zelloberfläche gebunden und anschließend über Endozytose aus Protein verbleibende unterschieden werden können, oder an der Oberfläche während der Inkubation gehandelt.

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Induktion von Langzeit-Potenzierung in der CA1-Region des Hippocampus und der anschließenden Trennung der Kern angereicherten Fraktionen aus dem tetanized Bereich der Scheibe. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um abhängig Kernproteinimport in Zellmodellen von Lernen und Gedächtnis zu bestimmen Aktivität.

Isolierung der CA1 Kern angereicherten Fraktionen von Hippocampus-abhängigen Aktivität zu Nuclear Import von Synapto-Atom-Messenger Proteine ​​Studieren

Synaptischen Vesikel Endozytose wird durch Lichtmikroskopie pHluorin verschmolzen mit synaptischen Vesikel Protein und Elektronenmikroskopie der Vesikel Aufnahme erkannt.

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

Neuronale Erregbarkeit kann durch einen dynamischen Prozess der Endo- und Exozytose von exzitatorischen Ionotropic Glutamat-Rezeptoren moduliert werden. Hier beschriebenen ist ein leicht zugängliche, High-Content Assay zur Quantifizierung der Oberfläche und interne Rezeptor Bevölkerung Pools.

Ein High-Content-Assay für die Überwachung der AMPA Rezeptor Menschenhandel

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Reinigung der dendritischen Filopodia-reichen Fraktion

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels (GluR) in dissoziierten primären Hippocampuskulturen vor. Mit einem Antikörper-Fütterungsansatz zur Kennzeichnung endogenes oder überexprimierter Rezeptoren in Kombination mit pharmakologischen Ansätzen ermöglicht diese Methode die Identifizierung molekularer Mechanismen zur Regulierung der GluR-Oberflächenexpression durch Modulation Internalisierungs- oder Recyclingprozesse.

Ein Antikörper-Fütterungsansatz zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels in dissoziierten primären Hippocampuskulturen

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Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

Hier zeigen wir, wie die Transfektion von primären hippokampalen Nagetierneuronen mit konfokaler Bildgebung in lebenden Zellen kombiniert werden kann, um pathologische Protein-induzierte Effekte auf den axonalen Transport zu analysieren und mechanistische Signalwege zu identifizieren, die diese Effekte vermitteln.

Verwendung von Lebendzell-Imaging zur Messung der Auswirkungen pathologischer Proteine auf den axonalen Transport in primären Hippocampus-Neuronen

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Stripe Assay die anziehende oder abstoßende Aktivität eines Proteins Substrat unter Verwendung Dissociated Neuronen im Hippocampus zu studieren (Video) | JoVE Journal

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