Stripe Assay die anziehende oder abstoßende Aktivität eines Proteins Substrat unter Verwendung Dissociated Neuronen im Hippocampus zu studieren
19. Juni 2016
Axonleitmoleküle regulieren die neuronale Migration und die gezielte Navigation des Wachstumskegels. Wir stellen eine leistungsfähige Methode, den Stripe-Assay, vor, um die Fähigkeit von Leitmolekülen zu beurteilen, Neuronen anzuziehen oder abzustoßen. In diesem Protokoll demonstrieren wir den Stripe-Assay, indem wir die Fähigkeit von FLRT2 zeigen, kultivierte Hippocampus-Neuronen abzustoßen.
Das übergeordnete Ziel des Streifenassays besteht darin, die Fähigkeit bestimmter Proteine, wie zum Beispiel Leitungsmoleküle, zu beurteilen, Neurone anzuziehen oder abzustoßen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Axonleitung zu beantworten, beispielsweise, wie Neurone wandern oder ihre Axone als Reaktion auf die äußere zelluläre Umgebung verlängern können. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass eine große Anzahl von Neuronen in einem einzigen Experiment sichtbar gemacht und viele Wachstumskappen gleichzeitig analysiert werden können.
Zur Vorbereitung vier bis acht Silikonmatrizen fünf Minuten lang in Wasser kochen. Anschließend vollständig unter einer laminaren Luftströmung mit den gestreiften Seiten nach oben trocknen lassen. Dies dauert etwa eine Stunde.
Arbeiten Sie weiterhin im Abzug. Verwenden Sie Druckluft oder Klebeband, um Staub auf der gestreiften Seite der Matrizen zu entfernen. Platzieren Sie anschließend jede Matrix vorsichtig mit der gestreiften Seite nach unten in eine separate Kunststoffschale mit sechs Zentimeter Durchmesser.
Mit einem Finger jede Matrix fest andrücken. Es sollte vermieden werden, Luftblasen zwischen der Matrix und der Schale einzuschließen. Falls die Matrix nicht haftet, den Vorgang wiederholen.
Markieren Sie nach dem Anbringen die Position der Streifen auf der Unterseite der Kulturschale. Bereiten Sie die fluoreszenzmarkierten rekombinanten Proteine in PBS vor. Stellen Sie 25 Mikroliter für jede gestreifte Schale her.
Lassen Sie das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach pipettieren Sie für jede Schale 25 Mikroliter verdünntes Protein in eine 22-Gauge-Spritze und injizieren es durch die kleine Öffnung an der Seite der Matrix. Vermeiden Sie die Einspritzung von Luftblasen in die Matrizen, da diese die Bindung Ihrer Proteine an die Schalen stören würden.
Jetzt die Schalen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Zellkultur-Inkubator inkubieren. Nach der Inkubation 300 Mikroliter PBS in den oberen Schlitz jeder Matrix geben. Anschließend das PBS aus einem kleinen Loch an der Seite jeder Matrix abziehen, um alle nicht gebundenen rekombinanten Proteine zu entfernen.
Aspirieren Sie die PBS nicht vollständig, da die Proteine austrocknen würden. Führen Sie diese PBS-Spülung insgesamt dreimal durch. Entfernen Sie danach vorsichtig die Matrix aus jeder Schale.
Gegeben Sie dann sofort etwa 100 Mikroliter des kontrollierten Proteins über die gesamte gestreifte Fläche, wodurch eine abwechselnde Beschichtung in jeder Schale entsteht. Inkubieren Sie anschließend die Schalen 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. In der Zwischenzeit tauen Sie Laminin und PBS auf Eis bei 20 Mikrogramm pro Milliliter auf.
Nach 30 Minuten die Schalen dreimal mit PBS waschen. Dann jede Schale mit etwa 100 Mikrolitern kaltem Laminin beschichten und die Schalen für eine weitere Stunde in den Inkubator zurückstellen. Eine Stunde später die Schalen erneut dreimal mit PBS waschen.
Nach der dritten Wäsche etwa 150 Mikroliter Kulturmedium zu jeder Petrischale hinzufügen. Anschließend die Schalen bis zum nächsten Gebrauch in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 °C inkubieren. Nach der Tötung einer spendenden E15,5-Maus die Haut und den Schädel mittig entlang der Kopfmedianebene mit einer chirurgischen Schere sagittal schneiden und das Gehirn mit einem Mikrospatel herausschaben.
Überführen Sie das Gehirn vorsichtig in eine 60-Milliliter-Petri-Schale, die drei Milliliter HBSS enthält. Schneiden Sie in der Schale mit einem Skalpell die Hemisphären einschließlich Kortex, Hippocampus und Striatum aus. Danach dissectieren Sie die hippocampalen Regionen, indem Sie vorsichtig die Hirnhäute entfernen.
Überführen Sie das dissezierte Hippocampus-Gewebe in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das zwei Milliliter HBSS-Lösung auf Eis enthält. Sechs Hippocampi von drei Embryonen reichen aus, um Neuronen auf acht Schalen zu kultivieren. Nachdem das gesamte Hippocampus-Gewebe gesammelt wurde, saugen Sie das HBSS ab und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter Trypsin-EDTA.
Anschießend den Kolben 15 Minuten lang in einem Wasserbad mit 37 Grad Celsius inkubieren. Danach die Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 500 Mikroliter fetalem Kälberserum neutralisieren. Anschließend die Mischung bei 100 ×g fünf Minuten lang zentrifugieren.
Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit zwei Milliliter Kulturmedium. Zentrifugieren Sie danach die Probe erneut und ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium. Dissoziieren Sie das Gewebe nun durch vorsichtiges Pipettieren mit einem einkopfigen Pipettenspitzenende von einem Milliliter, dessen Spitze abgeschnitten wurde.
Führen Sie das Gewebe etwa 10 Mal auf und ab durch die abgeschnittene Pipettenspitze. Verwenden Sie anschließend eine nicht abgeschnittene Ein-Milliliter-Spitze und wiederholen Sie die Trituration, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Isolieren Sie nun die Einzelzellen, indem Sie die Suspension durch einen Zellfilter mit einer Maschenweite von 80 bis 100 Mikrometer drücken.
Anschließend die gefilterte Suspension fünf Minuten lang bei 150 G zentrifugieren, den Überstand abpipettieren und das Pellet in zwei Millilitern Kulturmedium resuspendieren. Die Zellen mit einem Hämozytometer zählen und 10.000 Neuronen in 150 Mikrolitern Kulturmedium auf jede vorbereitete Streifenplatte aussäen. Die Suspension vorsichtig so auftragen, dass der gesamte gestreifte Bereich bedeckt ist.
Dissociierte hippocampale Neuronen von E15,5-Mäusen wurden auf Streifen des fluoreszenzmarkierten Kontrollproteins FC ausgesät und 24 Stunden lang kultiviert, oder die Neuronen wurden auf abwechselnden Streifen aus FLRT2-FC und nicht markiertem Kontroll-FC ausgesät. In beiden Fällen bildeten die Neuronen Aggregate und streckten ihre Axone als Bündel aus. Auf der FC-Kontrolle waren die Neuronen gleichmäßig verteilt und streckten ihre Axone in zufällige Richtungen aus. Im Gegensatz dazu mieden die Axone das Wachstum auf den FLRT2-FC-Bereichen, wenn sie mit FLRT2-FC-Streifen kultiviert wurden.
Daher wuchsen die wachsenden Axone hauptsächlich auf den FC-Streifen. Bei höherer Vergrößerung ist zu erkennen, dass die Axone entlang der Grenze zu den FLRT2-FC-Streifen wuchsen, jedoch nicht in das FLRT2-Gebiet hineinreichten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen gestreiften Teppich aus den empfohlenen Proteinen herstellt und die attraktive oder abstoßende Wirkung mithilfe dissoziierter hippokampaler Neuronen bewertet.
Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von fünf Stunden durchgeführt werden.
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Übersicht
Der Streifen-Assay ist eine leistungsstarke Methode, um die Fähigkeit von Axon-Leitungs-Molekülen zu untersuchen, Neuronen anzuziehen oder abzustoßen. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung einer großen Anzahl von Neuronen und Wachstumskonen in einem einzigen Experiment und liefert Erkenntnisse über die neuronale Migration und die Axonverlängerung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Neuronale Entwicklung
Hintergrund
- Axonleit-Moleküle spielen eine entscheidende Rolle bei der neuronalen Migration.
- Das Verständnis dafür, wie Neuronen auf ihre Umgebung reagieren, ist entscheidend für die Neurowissenschaften.
- Mithilfe des Streifenassays lässt sich die Analyse mehrerer Wachstumskonen gleichzeitig durchführen.
- Diese Methode kann dazu beitragen, die Mechanismen des neuronalen Verhaltens aufzuklären.
Zweck der Studie
- Um die Wirkung spezifischer Leitstoffe auf das neuronale Verhalten zu untersuchen.
- Um die Nützlichkeit des Streifenassays in der neurowissenschaftlichen Forschung zu demonstrieren.
- Um ein Protokoll zur Beurteilung neuronaler Reaktionen auf Leitsignale bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Silikonmatrizen für den Streifenassay.
- Aufkochen der Matrizen, um geeignete Oberflächeneigenschaften sicherzustellen.
- Trocknen der Matrizen unter kontrollierten Bedingungen an der Luft.
- Sichtbarmachung neuronaler Reaktionen auf Leitstoffe.
Hauptergebnisse
- Es wurde gezeigt, dass FLRT2 kultivierte hippocampale Neuronen abstößt.
- Mithilfe des Streifenassays ließen sich die abstossenden Wirkungen von Leitstoffen effektiv nachweisen.
- Eine große Anzahl von Neuronen wurde gleichzeitig analysiert.
- Die Methode lieferte klare Erkenntnisse über die neuronale Navigation.
Schlussfolgerungen
- Der Streifen-Assay ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Axonführung.
- Führungsmoleküle wie FLRT2 können das neuronale Verhalten erheblich beeinflussen.
- Diese Methode vertieft unser Verständnis der neuronalen Migration und der Navigation des Wachstumskonus.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mit dem Streifen-Assay lässt sich die Aktivität von Axonleitungs-Molekülen hochdurchsatzfähig bewerten, was die Zielvalidierung bei der entwicklung von Wirkstoffen für neurodevelopmentale Erkrankungen unterstützt. Durch die Quantifizierung attraktiver oder repulsiver neuronaler Reaktionen ermöglicht er eine mechanistische Ent-Risiko-Bewertung für therapeutische Kandidaten, die auf die neuronale Migration oder Pfadfindung abzielen. Diese Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem sie molekulare Aktivität mit funktionellem neuronalem Verhalten verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem getestet wird, ob Leitstoffe wie FLRT2 abstossende Wirkungen auf neuronale Axone ausüben.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Target-Validierung durch quantitative Verteilungsanalyse von Neuronen auf proteinbeschichteten Streifen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem Leitstoffe identifiziert werden, die starke richtungsspezifische Effekte auf das neuronale Wachstum haben.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte gestreifte Substrate für eine konsistente Untersuchung von Verbindungen oder Proteinen in neuronalen Systemen vor.
- Reproduzierbarkeit: Standardisiert die Darbietung extrazellulärer Signale, um zuverlässige Ergebnisse hinsichtlich Attraktion oder Repulsion über verschiedene Experimente hinweg sicherzustellen.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die gleichzeitige Analyse zahlreicher Wachstumskonen und unterstützt damit Screening-Formate mit mittlerer Durchsatzleistung.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert hippocampale neuronale Reaktionen, die auf neurodevelopmentelle Störungen mit Axonleitungsdefekten anwendbar sind.
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckungsergebnisse mit der präklinischen Validierung, indem die Wirkung von Leitstoffen in primären Neuronensystemen bestätigt wird.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt die Festlegung von Weiterentwicklungskriterien, indem dosis- oder konzentrationsabhängige abstossende Schwellenwerte etabliert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Streifen-Assay fügt sich in die Entdeckungskontinuum von der Zielstrukturnbindung bis zur funktionalen Validierung ein, insbesondere in neurowissenschaftlich ausgerichteten Pipelines zur Bewertung von Axonmodulatoren.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem untersucht wird, ob kandidatenbasierte Proteine die neuronale Trajektorie oder die Wachstumskegel-Dynamik verändern.
- Screening: Liefert quantitative Ergebnisse wie Prozentangaben zur Verteilung neuronaler Streifen und ermöglicht so den Vergleich der Wirksamkeit von Leitstoffmolekülen.
- Analytik: Bietet messbare Endpunkte wie Axonvermeidung oder Ausrichtung an Grenzflächen und erleichtert statistische Vergleiche zwischen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Knüpft an präklinische Studien an, indem primäre hippocampale Neuronen verwendet werden, wodurch die physiologische Relevanz der Ergebnisse erhöht wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Plattform zum Screening verschiedener Leitstoffmoleküle oder therapeutischer Antikörper, die die neuronale Navigation gezielt beeinflussen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem die Beschichtung des Protein-Substrats direkt mit der gerichteten neuronalen Antwort verknüpft wird.
- Operationaler Wert: Stellt Standardisierung durch Protokolle zur Matrixpräparation und Proteinbeschichtung sicher und verbessert so die Konsistenz zwischen Experimenten.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch klare phänotypische Aussagen zur axonalen Anziehung oder Abstoßung.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen in Leitsignalwegen basierend auf funktionellen Daten zum neuronalen Vermeidungsverhalten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der primären neuronale Dissoziation und der sterilen Matrixpräparation unter laminarer Strömung.
- Hängt vom Zugang zu fluoreszenzmarkierten rekombinanten Proteinen und Werkzeugen zur Herstellung von Silikonmatrizen ab.
- Erfordert die Standardisierung von Inkubations-, Wasch- und Beschichtungsschritten, um eine ungleichmäßige Streifenbildung zu vermeiden.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf nicht-neuronale Zelltypen oder alternative extrazelluläre Matrixproteine ausgeweitet wird.
- Ist durch die Notwendigkeit einer präzisen Kontrolle des Mikroumfelds begrenzt, um das Austrocknen der Proteine oder die Ablösung der Matrix während des Assays zu verhindern.
