Name: Isolierung von Riesen Lampbrush Chromosome von Living Oozyten von Fröschen und Salamandern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Riesen-Lampenbürstenchromosomen aus Amphibienoozyten für Zellbiologie und Genetik. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Transkription und RNA-Dynamik in vivo.

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Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer R01 GM33397 unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder. J.G.G. ist Professor für Entwicklungsgenetik an der American Cancer Society.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die ersten Beobachtungen von &quot;lebenden&quot; LBCS von Hand isoliert GVs von Fröschen und Salamandern wurden durch die amerikanische Biologe William Duryee, 19 vor fast 80 Jahren vor der Einführung der Phasenkontrast und DIC - Mikroskopie vor Fluoreszenzimmunfärbung und vor FISH. Die Vorteile von LBCS für Details von Chromosomenstruktur und Transkription auf der individuellen Gen-Ebene erforderlich Entwicklung von Techniken der Untersuchung der LBCS auf Glasobjektträger zu befestigen, sie in einer naturge...

Die meisten Wirbeltiere, mit der bemerkenswerten Ausnahme von Beuteltiere und Plazentatiere, produzieren große yolky Eier. Trotz ihrer zum Teil enorme Größe sind diese Eier einzelne Zellen, die ihre endgültige Dimension erreichen, während noch im Ovar der weiblichen. Ovarian Eier werden Eizellen genannt und jedes enthält typischerweise einen einzigen riesigen Kern, seit dem Anfang des 19. Jahrhunderts als Keimbläschen bekannt oder einfach GV. 1 Oozyten der gemeinsamen Labor Frösche, Xenopus laevis und Xenopus tropicalis, einen maximalen Durchmesser von 1,2 mm und 0,8 mm bzw. (Abbildung 1) erreichen. Die GVs von reifen Eizellen dieser beiden Frösche sind 0,3-0,4 mm Durchmesser (2, 3). Molche haben in der Regel noch größere Eizellen und GVs. Völlig reife Eizellen des mexikanischen Axolotl Ambystoma mexicanum, sind mehr als 2 mm im Durchmesser und der GV ist etwa 0,5 mm. Somit sind diese Kerne gut sichtbar für das bloße Auge und kannwerden in vielfältiger Weise manipuliert, die mit den Kernen der typischen somatischen Zellen unmöglich sind. Ebenso bemerkenswert ist die gigantische Größe der Chromosomen innerhalb der GV, was sich bereits am Ende des 19. Jahrhunderts anerkannt. Einzelnen Chromosomen von Ambystoma und andere Molche kann bis zu 1 mm in der Länge (4, 5) liegen. Diejenigen von Xenopus sind beträchtlich kleiner ist , wenn auch mit Längen bis zu 100 &amp; mgr; m oder mehr ist , sie die typischen somatische Chromosomen der meisten Organismen dwarf. Ein wichtiges Merkmal der Eizelle Chromosomen ist ihre außergewöhnliche Transkriptionsaktivität, die auf einer ihrer charakteristischen morphologischen Merkmale führt - Hunderte von paarigen seitlichen Schleifen (Abbildung 5). Jede Schleife besteht aus einem oder wenigen Transkriptionseinheiten, die aktiv RNA synthetisieren. Die Schleifen geben Eizelle Chromosomen einer Fuzzy-Auftritt, der auf den Namen &quot;Lampbrush&quot; Chromosom führte nach ihrer oberflächlichenÄhnlichkeit mit den in früheren Zeiten verwendet Bürsten Petroleumlampe Schornsteine ​​zu reinigen. 2 Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Verwendung von isolierten GVs LBCS und Kernorganellen (Kernkörperchen, Histon-Locus Körper und Sprenkel) zu studieren. Zwei ziemlich unterschiedliche Techniken beschrieben werden. In der ersten, häufiger Technik, GVs werden in einer Salzlösung unter Verwendung von Juwelier Zange isoliert, kurz adhärenten Eigelb zu entfernen, gespült und der Kernhülle entfernt wurde, wieder mit Juwelier Zange. Die gallertartiger Inhalte, die LBCS und Kernorganellen enthält, dürfen sich auf einen Glasobjektträger oder Deckglas zu begleichen. Solche Präparate können direkt durch Phasenkontrast oder DIC-Mikroskopie untersucht werden. Alternativ zentrifugiert werden können Zubereitungen, die die LBCS und Organellen mit dem Schlitten oder Deckglas zu befestigen. Solche Präparate können dann für detaillierte molekulare Analyse von Nukleinsäuren und Proteinen verarbeitet werden, in erster Linie durch Immunofluoreszenz und fluorescent in situ - Hybridisierung (FISH). 3-7 Eine zweite Technik beinhaltet die Isolierung des GV in Mineralöl. 8 Öl isoliert GVs bleiben transcriptionsaktive für viele Stunden und sind potentiell nützlich für Studien , in denen man will , dass die Kerninhalte möglichst naturgetreu zu sein. 9,10 Da der Brechungsindex des Kern &quot;Saft&quot; zu der der LBCS Nähe und andere Kernorganellen (Abbildung 3) kann mikroskopischer Techniken eine Herausforderung mit öl isoliert GVs sein. Schließlich aufgrund ihrer Größe und Leichtigkeit der Manipulation, GVs sind ideale Material für Studien über die Kernhülle. Die Kernporenkomplex wurde zuerst aus elektronenmikroskopische Untersuchungen an Amphibien GV Umschläge 11 und neueren Hochauflösungs - Beobachtungen haben das gleiche Material verwendet , beschrieben. 12,13

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd (Reagenzqualität, kristallin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Trotz Warnungen in vielen Protokollen kann eine konzentrierte Lösung unbegrenzt bei RT gelagert werden</td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-100G</td> Manchmal <td>auch als MS-222</td></tr><tr><td>bezeichnet Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 Nähte</td><td>VWR&nbsp;</td><td>95057-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast (Paraffinwachs)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3558-1KG</td><td></td></tr><tr><td>p-Phenylendiamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Lebensmittelgeschäft</td><td></td><td>Kommerziell Knox Gelatine funktioniert gut</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifading-Eindeckmittel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Gold Seal Deckglas&nbsp; 22 x 22 mm #1 1/2 (0,16 - 0,19 mm dick)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>63786-01</td><td>Diese Deckgläser sind die empfohlene Dicke für die hochauflösende Mikroskopie</td></tr><tr><td>Dumont Pinzette #5</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72700-D</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx</td></tr><tr><td>Paraffinöl (leicht)&nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>PX0047-1</td><td>Zur Isolierung von GVs in</td></tr><tr><td>Öl Adhäsive in situ PCR- und Hybridisierungskammern (25 & Mikro; L)</td><td>BioRad</td><td>Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers</td></tr><tr><td>Silikonisolatoren</td><td>Grace-Biolabs</td><td>aus dem Katalog auswählen Link</td><td>http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html</td></tr><tr><td>Coplin Tiegel und Färbeschalen</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>aus Kataloglink</td> <td>auswählenhttp://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx</td></tr></tbody></table>

isolierung von riesen lampbrush chromosome von living oozyten von fröschen und salamandern

Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

Wir beschreiben Methoden für die riesigen transcriptionsaktive Lampbrush Chromosomen studieren (LBCS) in der Eizelle gefunden, oder unlaid Ei, von Fröschen und Salamandern. Einzelne LBCS kann bis zu 1 mm lang sein und sie befinden sich in einem gigantischen Kern, selbst mit einem Durchmesser von 0,5 mm. Die große Größe der Chromosomen ermöglicht unvergleichliche Beobachtungen von aktiven Genen, die durch Licht optische Mikroskopie, aber zugleich werden spezielle Techniken zur Isolierung des Kerns, das Entfernen der Kernhülle erforderlich, und die Chromosomen auf einem Objektträger verteilen. Die Eizelle Kern auch die Keimbläschen (GV) genannt wird, wird in einem Medium isoliert, die teilweise Gelieren des nuklearen Aktin ermöglicht und bewahrt die empfindliche Struktur der LBCS. Dieser Schritt erfolgt manuell unter einem Binokular Juwelier Pinzette. Als nächstes wird die Kernhülle, wieder manuell mit Juwelier einer Pinzette entfernt. Die Kerninhalte werden schnell auf ein Medium überführt, die dispeRSES das Aktin-Gel und ermöglicht es, die unbeschädigte LBCS auf einen Objektträger zu begleichen. An diesem Punkt die LBCS und andere Kernorganellen kann durch Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrastmikroskopie betrachtet werden, obwohl feinere Details durch die Brownsche Bewegung verdeckt sind. Für hochauflösende mikroskopische Beobachtung oder molekulare Analyse wird die gesamte Zubereitung die empfindlichen LBCS fest an der Folie zu befestigen zentrifugiert. Eine kurze Fixierung in Paraformaldehyd wird dann durch Immunfluoreszenzfärbung oder in situ - Hybridisierung verfolgt. LBCS sind in einem transkriptionell aktiven Zustand und ihre enorme Größe ermöglicht auf der individuellen Genniveau molekulare Analyse mittels konfokaler oder superauflösende Mikroskopie.

Um zu untersuchen, Riese Lampbrush Chromosomen beginnt man von Eizellen aus einem Frosch oder Salamander zu isolieren. Abbildung 1 zeigt eine Gruppe von reifen Eizellen in einer gepufferten Salzlösung nach der Entnahme aus dem Ovar des Frosches Xenopus. Solche Eizellen bleiben für Tage bei Raumtemperatur in einem guten Zustand. Der Kern (oder Keimbläschen) wird dann von einer Oocyte mit Juwelierpinzette, entweder in einer Salzlösung (Abbildung 2)</strong...

Wir präsentieren einfache Techniken für aus lebenden Eizellen von Fröschen und Salamandern Riese transcriptionsaktive Lampbrush Chromosomen zu isolieren. Wir beschreiben , wie diese Chromosomen &quot;lebendig&quot; durch Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrast zu beobachten, und wie man sie in - situ - Hybridisierung oder Immunfluoreszenzanfärbung für fluoreszierende zu beheben.

Isolierung von Riesen Lampbrush Chromosome von Living Oozyten von Fröschen und Salamandern

We describe methods for studying the giant transcriptionally active lampbrush chromosomes (LBCs) found in the oocyte, or unlaid egg, of frogs and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den riesigen Kern, auch Keimvesikel genannt, aus einer Amphibien-Oozyte zu isolieren und die Lampenbürstenchromosomen sowie andere nukleäre Organellen auf einem Objektträger auszubreiten, um sie für Immunfärbungen, in-situ-Hybridisierungen und andere molekularbiologische Techniken vorzubereiten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur grundlegenden Struktur von Chromosomen, Nukleoli und anderen nukleären Organellen sowie zu molekularen Details der Transkription, des Spleißens und des RNA-Exports zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der einfachen Untersuchbarkeit der Chromosomenstruktur und der Transkription mittels konventioneller Lichtmikroskopie unter Verwendung von Immunfluoreszenz, in-situ-Hybridisierung und anderen molekularbiologischen Methoden.Den Versuch wird Dr. Zehra Nizami, eine Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstrieren. Nachdem alle benötigten Lösungen vorbereitet wurden, stellen Sie Objektträger mit Vertiefungen zusammen, die aus beschichteten Glasobjektträgern bestehen, an die mit Paraffin Plastikrinnen befestigt wurden, wie im textlichen Protokoll beschrieben. Sammeln Sie anschli

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