Name: Isolierung von Riesen Lampbrush Chromosome von Living Oozyten von Fröschen und Salamandern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Riesen-Lampenbürstenchromosomen aus Amphibienoozyten für Zellbiologie und Genetik. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Transkription und RNA-Dynamik in vivo.

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Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer R01 GM33397 unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder. J.G.G. ist Professor für Entwicklungsgenetik an der American Cancer Society.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die ersten Beobachtungen von &quot;lebenden&quot; LBCS von Hand isoliert GVs von Fröschen und Salamandern wurden durch die amerikanische Biologe William Duryee, 19 vor fast 80 Jahren vor der Einführung der Phasenkontrast und DIC - Mikroskopie vor Fluoreszenzimmunfärbung und vor FISH. Die Vorteile von LBCS für Details von Chromosomenstruktur und Transkription auf der individuellen Gen-Ebene erforderlich Entwicklung von Techniken der Untersuchung der LBCS auf Glasobjektträger zu befestigen, sie in einer naturge...

Die meisten Wirbeltiere, mit der bemerkenswerten Ausnahme von Beuteltiere und Plazentatiere, produzieren große yolky Eier. Trotz ihrer zum Teil enorme Größe sind diese Eier einzelne Zellen, die ihre endgültige Dimension erreichen, während noch im Ovar der weiblichen. Ovarian Eier werden Eizellen genannt und jedes enthält typischerweise einen einzigen riesigen Kern, seit dem Anfang des 19. Jahrhunderts als Keimbläschen bekannt oder einfach GV. 1 Oozyten der gemeinsamen Labor Frösche, Xenopus laevis und Xenopus tropicalis, einen maximalen Durchmesser von 1,2 mm und 0,8 mm bzw. (Abbildung 1) erreichen. Die GVs von reifen Eizellen dieser beiden Frösche sind 0,3-0,4 mm Durchmesser (2, 3). Molche haben in der Regel noch größere Eizellen und GVs. Völlig reife Eizellen des mexikanischen Axolotl Ambystoma mexicanum, sind mehr als 2 mm im Durchmesser und der GV ist etwa 0,5 mm. Somit sind diese Kerne gut sichtbar für das bloße Auge und kannwerden in vielfältiger Weise manipuliert, die mit den Kernen der typischen somatischen Zellen unmöglich sind. Ebenso bemerkenswert ist die gigantische Größe der Chromosomen innerhalb der GV, was sich bereits am Ende des 19. Jahrhunderts anerkannt. Einzelnen Chromosomen von Ambystoma und andere Molche kann bis zu 1 mm in der Länge (4, 5) liegen. Diejenigen von Xenopus sind beträchtlich kleiner ist , wenn auch mit Längen bis zu 100 &amp; mgr; m oder mehr ist , sie die typischen somatische Chromosomen der meisten Organismen dwarf. Ein wichtiges Merkmal der Eizelle Chromosomen ist ihre außergewöhnliche Transkriptionsaktivität, die auf einer ihrer charakteristischen morphologischen Merkmale führt - Hunderte von paarigen seitlichen Schleifen (Abbildung 5). Jede Schleife besteht aus einem oder wenigen Transkriptionseinheiten, die aktiv RNA synthetisieren. Die Schleifen geben Eizelle Chromosomen einer Fuzzy-Auftritt, der auf den Namen &quot;Lampbrush&quot; Chromosom führte nach ihrer oberflächlichenÄhnlichkeit mit den in früheren Zeiten verwendet Bürsten Petroleumlampe Schornsteine ​​zu reinigen. 2 Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Verwendung von isolierten GVs LBCS und Kernorganellen (Kernkörperchen, Histon-Locus Körper und Sprenkel) zu studieren. Zwei ziemlich unterschiedliche Techniken beschrieben werden. In der ersten, häufiger Technik, GVs werden in einer Salzlösung unter Verwendung von Juwelier Zange isoliert, kurz adhärenten Eigelb zu entfernen, gespült und der Kernhülle entfernt wurde, wieder mit Juwelier Zange. Die gallertartiger Inhalte, die LBCS und Kernorganellen enthält, dürfen sich auf einen Glasobjektträger oder Deckglas zu begleichen. Solche Präparate können direkt durch Phasenkontrast oder DIC-Mikroskopie untersucht werden. Alternativ zentrifugiert werden können Zubereitungen, die die LBCS und Organellen mit dem Schlitten oder Deckglas zu befestigen. Solche Präparate können dann für detaillierte molekulare Analyse von Nukleinsäuren und Proteinen verarbeitet werden, in erster Linie durch Immunofluoreszenz und fluorescent in situ - Hybridisierung (FISH). 3-7 Eine zweite Technik beinhaltet die Isolierung des GV in Mineralöl. 8 Öl isoliert GVs bleiben transcriptionsaktive für viele Stunden und sind potentiell nützlich für Studien , in denen man will , dass die Kerninhalte möglichst naturgetreu zu sein. 9,10 Da der Brechungsindex des Kern &quot;Saft&quot; zu der der LBCS Nähe und andere Kernorganellen (Abbildung 3) kann mikroskopischer Techniken eine Herausforderung mit öl isoliert GVs sein. Schließlich aufgrund ihrer Größe und Leichtigkeit der Manipulation, GVs sind ideale Material für Studien über die Kernhülle. Die Kernporenkomplex wurde zuerst aus elektronenmikroskopische Untersuchungen an Amphibien GV Umschläge 11 und neueren Hochauflösungs - Beobachtungen haben das gleiche Material verwendet , beschrieben. 12,13

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd (Reagenzqualität, kristallin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Trotz Warnungen in vielen Protokollen kann eine konzentrierte Lösung unbegrenzt bei RT gelagert werden</td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-100G</td> Manchmal <td>auch als MS-222</td></tr><tr><td>bezeichnet Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 Nähte</td><td>VWR&nbsp;</td><td>95057-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast (Paraffinwachs)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3558-1KG</td><td></td></tr><tr><td>p-Phenylendiamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Lebensmittelgeschäft</td><td></td><td>Kommerziell Knox Gelatine funktioniert gut</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifading-Eindeckmittel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Gold Seal Deckglas&nbsp; 22 x 22 mm #1 1/2 (0,16 - 0,19 mm dick)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>63786-01</td><td>Diese Deckgläser sind die empfohlene Dicke für die hochauflösende Mikroskopie</td></tr><tr><td>Dumont Pinzette #5</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72700-D</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx</td></tr><tr><td>Paraffinöl (leicht)&nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>PX0047-1</td><td>Zur Isolierung von GVs in</td></tr><tr><td>Öl Adhäsive in situ PCR- und Hybridisierungskammern (25 & Mikro; L)</td><td>BioRad</td><td>Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers</td></tr><tr><td>Silikonisolatoren</td><td>Grace-Biolabs</td><td>aus dem Katalog auswählen Link</td><td>http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html</td></tr><tr><td>Coplin Tiegel und Färbeschalen</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>aus Kataloglink</td> <td>auswählenhttp://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx</td></tr></tbody></table>

isolierung von riesen lampbrush chromosome von living oozyten von fröschen und salamandern

Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

Wir beschreiben Methoden für die riesigen transcriptionsaktive Lampbrush Chromosomen studieren (LBCS) in der Eizelle gefunden, oder unlaid Ei, von Fröschen und Salamandern. Einzelne LBCS kann bis zu 1 mm lang sein und sie befinden sich in einem gigantischen Kern, selbst mit einem Durchmesser von 0,5 mm. Die große Größe der Chromosomen ermöglicht unvergleichliche Beobachtungen von aktiven Genen, die durch Licht optische Mikroskopie, aber zugleich werden spezielle Techniken zur Isolierung des Kerns, das Entfernen der Kernhülle erforderlich, und die Chromosomen auf einem Objektträger verteilen. Die Eizelle Kern auch die Keimbläschen (GV) genannt wird, wird in einem Medium isoliert, die teilweise Gelieren des nuklearen Aktin ermöglicht und bewahrt die empfindliche Struktur der LBCS. Dieser Schritt erfolgt manuell unter einem Binokular Juwelier Pinzette. Als nächstes wird die Kernhülle, wieder manuell mit Juwelier einer Pinzette entfernt. Die Kerninhalte werden schnell auf ein Medium überführt, die dispeRSES das Aktin-Gel und ermöglicht es, die unbeschädigte LBCS auf einen Objektträger zu begleichen. An diesem Punkt die LBCS und andere Kernorganellen kann durch Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrastmikroskopie betrachtet werden, obwohl feinere Details durch die Brownsche Bewegung verdeckt sind. Für hochauflösende mikroskopische Beobachtung oder molekulare Analyse wird die gesamte Zubereitung die empfindlichen LBCS fest an der Folie zu befestigen zentrifugiert. Eine kurze Fixierung in Paraformaldehyd wird dann durch Immunfluoreszenzfärbung oder in situ - Hybridisierung verfolgt. LBCS sind in einem transkriptionell aktiven Zustand und ihre enorme Größe ermöglicht auf der individuellen Genniveau molekulare Analyse mittels konfokaler oder superauflösende Mikroskopie.

Um zu untersuchen, Riese Lampbrush Chromosomen beginnt man von Eizellen aus einem Frosch oder Salamander zu isolieren. Abbildung 1 zeigt eine Gruppe von reifen Eizellen in einer gepufferten Salzlösung nach der Entnahme aus dem Ovar des Frosches Xenopus. Solche Eizellen bleiben für Tage bei Raumtemperatur in einem guten Zustand. Der Kern (oder Keimbläschen) wird dann von einer Oocyte mit Juwelierpinzette, entweder in einer Salzlösung (Abbildung 2)</strong...

Wir präsentieren einfache Techniken für aus lebenden Eizellen von Fröschen und Salamandern Riese transcriptionsaktive Lampbrush Chromosomen zu isolieren. Wir beschreiben , wie diese Chromosomen &quot;lebendig&quot; durch Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrast zu beobachten, und wie man sie in - situ - Hybridisierung oder Immunfluoreszenzanfärbung für fluoreszierende zu beheben.

Isolierung von Riesen Lampbrush Chromosome von Living Oozyten von Fröschen und Salamandern

We describe methods for studying the giant transcriptionally active lampbrush chromosomes (LBCs) found in the oocyte, or unlaid egg, of frogs and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den riesigen Kern, auch Keimvesikel genannt, aus einer Amphibien-Oozyte zu isolieren und die Lampenbürstenchromosomen sowie andere nukleäre Organellen auf einem Objektträger auszubreiten, um sie für Immunfärbungen, in-situ-Hybridisierungen und andere molekularbiologische Techniken vorzubereiten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur grundlegenden Struktur von Chromosomen, Nukleoli und anderen nukleären Organellen sowie zu molekularen Details der Transkription, des Spleißens und des RNA-Exports zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der einfachen Untersuchbarkeit der Chromosomenstruktur und der Transkription mittels konventioneller Lichtmikroskopie unter Verwendung von Immunfluoreszenz, in-situ-Hybridisierung und anderen molekularbiologischen Methoden.Den Versuch wird Dr. Zehra Nizami, eine Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstrieren. Nachdem alle benötigten Lösungen vorbereitet wurden, stellen Sie Objektträger mit Vertiefungen zusammen, die aus beschichteten Glasobjektträgern bestehen, an die mit Paraffin Plastikrinnen befestigt wurden, wie im textlichen Protokoll beschrieben. Sammeln Sie anschließend Ovarialgewebe, das zuvor von einem erwachsenen, weiblichen Frosch oder einem Salamander gewonnen wurde, und füllen Sie eine kleine Petrischale mit Oozyten-Kulturmedium. Platzieren Sie einen Teil des isolierten Gewebes, der etwa 10 bis 20 Oozyten enth&auml;lt, in diese Platte. Identifizieren Sie anschlie&szlig;end ein einzelnes Oozyt und trennen Sie mit zwei Paar Feinmechaniker-Pinzetten den Stiel ab, der es mit der Eierstockwand verbindet. Sobald es gel&ouml;st ist, &uuml;berf&uuml;hren Sie das Oozyt in eine neue Petrischale, die Medium zur Isolierung des Keimbl&auml;schenkerns (GV) enth&auml;lt.Suchen Sie unter geringer Vergr&ouml;&szlig;erung den Animalpol der Oozyte, der an seiner dunklen F&auml;rbung erkennbar ist. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um ein gro&szlig;es Loch in der N&auml;he des Animalpols zu erzeugen, und dr&uuml;cken Sie vorsichtig den durchsichtigen Oozytenkern, auch GV genannt, heraus. Danach rollen Sie den GV von eventuell mitausgetretenem Dotter weg. Um verbliebenen, festhaftenden Dotter zu entfernen, ziehen Sie den Kern mehrmals in und aus einer Pipette mit einer &Ouml;ffnung, deren Durchmesser etwas gr&ouml;&szlig;er ist als der des GV. Nach der Gewinnung eines GV von einem Frosch &uuml;berf&uuml;hren Sie ihn unverz&uuml;glich in ein Dispersionsmedium, um eine Verh&auml;rtung des Kerns zu verhindern, die sp&auml;tere Schritte st&ouml;ren w&uuml;rde.Danach mit zwei Pinzetten die Kernhülle nahe der Oberseite des GV fassen, wobei darauf geachtet werden muss, nicht nach unten zu drücken. Während die Hülle weiterhin festgehalten wird, die beiden Pinzetten auseinanderziehen und damit rechnen, dass der Zellkerninhalt austritt. Um diesen Inhalt aufzufangen, zunächst eine verstellbare 20-Mikroliter-Pipette mit abgeschnittenem Pipettenspitzenende gemäß der schriftlichen Anleitung vorbereiten.Anschließend aus der Schale zunächst fünf Mikroliter Dispersionsflüssigkeit und danach fünf Mikroliter der Lösung mit den GV-Inhalten aufziehen. Sobald diese Inhalte gesammelt wurden, überführen Sie sie in ein Objektträgerloch, das mit Dispersionslösung gefüllt ist. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit auf dem Objektträger eine konvexe Oberfläche bildet, um in nachfolgenden Schritten die Einschließung von Bläschen zu vermeiden.Anschließend einen 18 Millimeter großen Deckel über die Vertiefung legen und den zusammengesetzten Objektträger 10 bis 60 Minuten lang in eine feuchte Kammer stellen. Während dieser Zeit ist damit zu rechnen, dass sich das Kerngel langsam verteilt, sodass die Chromosomen und kernständigen Organellen an der Oberfläche des Glases zu liegen kommen. Nach dem Entfernen eines Kerns aus einem Salamander-Oozyt diesen im Isoliermedium belassen.Beachten Sie, dass die GV von Salamandern, im Gegensatz zu denen der hier verwendeten Froscharten, in dieser Lösung nicht übermäßig verhärten. Entfernen Sie die nukleäre Hülle des Salamander-GV mit derselben pinzettenbasierten Technik, die für Frösche beschrieben wurde. Danach nehmen Sie den leicht gelierten nukleären Inhalt mit einer Pipette mit abgeschnittenem Spitzenende auf und übertragen das Gel in eine Petrischale, die die Dispersionslösung enthält. Spülen Sie die Pipette schnell in der Dispersionslösung aus und verwenden Sie sie, um das nukleäre Gel zu entnehmen. Bringen Sie anschließend das Gel auf einem Objektträger mit Vertiefung auf, geben Sie einen Deckglaser auf und lassen Sie das Gel wie zuvor beschrieben zerlaufen. Untersuchen Sie dann mithilfe der Phasenkontrastmikroskopie den nuklearen Inhalt und identifizieren Sie die Lampenbürstenchromosomen, abgekürzt als LBCs, anhand ihrer großen Größe und der gepaarten lateralen Schleifen.Nachdem best&auml;tigt wurde, dass die LBCs intakt sind, bereiten Sie den Objekttr&auml;ger f&uuml;r die Zentrifugation vor, indem Sie ein St&uuml;ck Filterpapier auf die Deckglasplatte legen. Dr&uuml;cken Sie dann darauf, um &uuml;bersch&uuml;ssige Fl&uuml;ssigkeit aus der Kammer zu entfernen. F&uuml;gen Sie anschlie&szlig;end an jeder Kante des Deckglases Vaseline hinzu.Erhitzen Sie eine Metallstange auf etwa 70 bis 80 Grad Celsius und schmelzen Sie damit das Gel, um die Deckglasabdeckung auf dem darunterliegenden Kunststoff zu befestigen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für andere Objektträger mit LBCs von guter Qualität. Sobald alle Deckgläser befestigt sind, platzieren Sie die Objektträger in den Zentrifugenhaltern und stellen Sie sicher, dass gegenüberliegende Halter ausbalanciert sind.Unter Verwendung der Langsamstartfunktion die Objektträger wie im Text beschrieben mit speziell angefertigten Trägern zentrifugieren. Alternativ kann ein handelsüblicher Tischzentrifuge verwendet werden, bei der die Objektträger auf einer Platte befestigt und rotiert werden. Um die nukleären Inhalte für die Immunfärbung oder die in-situ-Hybridisierung vorzubereiten, entfernen Sie zunächst die temporäre Vaseline-Dichtung mit einem Rasiermesser und legen Sie den Objektträger dann in den Halter eines handelsüblichen Objektträgerfärbungsgefäßes.Fügen Sie anschließend ausreichend Paraformaldehyd hinzu, um die Objektträger zu bedecken. Entfernen und entsorgen Sie mithilfe einer stumpfen Pinzette jede Deckglasabdeckung, sobald diese untergetaucht ist. Lassen Sie die Objektträger 15 bis 30 Minuten im Fixansatz. Nach der Fixierung eine Objektträger in eine Färbeschale mit eiskalter PBS geben. Anschließend eine scharfe Rasierklinge an der Kante des Plastikquadrats einführen und diese Plastikvertiefung vorsichtig lösen. Sobald dieser Vorgang für alle Objektträger wiederholt wurde, fortfahren mit der Färbung, wie im textlichen Protokoll beschrieben.Im hier gezeigten Bild mit Dunkelfeldbeleuchtung sind die nukleären Inhalte eines einzelnen Axolotl-GV in der Prophase der ersten meiotischen Teilung dargestellt, die mithilfe des beschriebenen Protokolls gewonnen und präpariert wurden. 14 große, gepaarte LBCs sind erkennbar, ebenso amplifizierte Nukleoli. Eine zusätzliche Färbung dieses Präparats mit einem Antikörper gegen phosphoryliertes RNA-Polymerase-II, hier in grün dargestellt, zeigt die Lokalisation der Histonen-Lokus-Körper und liefert zudem Einblicke in die starke transkriptionelle Aktivität dieser Oozytenchromosomen.Die höhere Vergr&ouml;&szlig;erung eines einzelnen axolotl-LBC, in diesem Fall eines, das gr&uuml;n f&uuml;r RNA-Polymerase und blau f&uuml;r DNA angef&auml;rbt wurde, zeigt die auff&auml;lligste morphologische Besonderheit dieser Chromosomen. Hunderte gepaarter lateraler Schleifen, von denen jede mindestens eine Transkriptionseinheit darstellt, die aktiv RNA synthetisiert. Der Vergleich mit einem &auml;hnlich angef&auml;rbten Frosch-LBC, das mit derselben Vergr&ouml;&szlig;erung abgebildet wurde, unterstreicht den enormen Gr&ouml;&szlig;enunterschied zwischen Frosch- und Salamanderchromosomen, ein Unterschied, der mit dem gesamten DNA-Gehalt der Genome der verwendeten Arten korreliert.Jedoch können selbst in der Froschchromosom die einzelnen Transkriptionseinheiten als laterale Chromatin-Schleifen, die sich von der Chromosomenachse erstrecken, gesehen werden, wie in dieser Aufnahme mit höherer Vergrößerung gezeigt. Oozyten von Fischen, Vögeln, Reptilien und einigen Wirbellosen enthalten ebenfalls riesige Lampenbürstenchromosomen. Bemerkenswerterweise entstehen Lampenbürstenchromosomen, wenn Spermienköpfe von anderen Organismen, einschließlich des Menschen, in das Keimvesikel von Amphibien injiziert werden.Nachdem die Technik beherrscht ist, kann eine Charge von AGV-Präparaten innerhalb einer Stunde hergestellt, anschließend zentrifugiert und innerhalb von einer bis zwei Stunden fixiert werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie gut verstehen, wie man einen GV isoliert und die Lampenbürstenchromosomen für weitere Untersuchungen mit molekularen Sonden aufspaltet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Die Befruchtung der Xenopus Oozyten Über den Host-Transfer-Methode

Xenopus embryonalen Epithelien sind ein ideales Modellsystem, um die Zelle Verhaltensweisen wie Polarität Entwicklung und Formänderung beim epithelialen Morphogenese zu studieren. Traditionelle Histologie des festen Proben wird zunehmend durch Live-Cell-konfokale Bildgebung ergänzt. Hier zeigen wir Methoden, um Frosch Gewebe zu isolieren und zu visualisieren leben Epithelzellen und deren Zytoskelett mit Live-cell konfokalen Mikroskopie.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Wir beschreiben eine Methode, die die Kinetik von Ionen-Transport von Membranproteinen Maßnahmen neben site-spezifische Analyse von Konformationsänderungen mittels Fluoreszenz an einzelnen Zellen. Diese Technik ist anpassungsfähig an Ionenkanälen, Transportern und Ionenpumpen und kann genutzt werden, um Einschränkungen bei den Protein-Untereinheiten zu bestimmen.

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Dieses Video zeigt die Maßnahmen zur primären Kulturen von embryonalen...

Gleichzeitige Pre-und Post-synaptischen Elektrophysiologische Aufnahme von<em&gt; Xenopus</em&gt; Nerv-Muskel-Co-Kulturen

Produktion von<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrakte Mikrotubuli-assoziierten RNAs identifizieren

Wir beschreiben Methoden zur Manipulation unreifer Eizellen von Xenopus laevis, zur In-vitro-Reifung von Eizellen zu Eizellen und zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion. Dieses Protokoll ermöglicht den Abbau einiger mütterlicher Proteine und die Überexpression von Genen von Interesse während der Befruchtung und ist daher wertvoll, um die Rolle spezifischer Faktoren in der frühen Embryonalentwicklung zu untersuchen.

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Die Kontrolle der Proteinsynthese erfolgt hauptsächlich im Initiationsschritt der Translation, dessen Mängel mit verschiedenen Störungen verbunden sind. Um ihre Ätiologie besser zu verstehen, haben wir hier ein Protokoll mit Xenopus laevis Eizellen beschrieben, das die Translation des mos-Transkripts in Gegenwart einer Mutante des Translationsinitiationsfaktors eIF4G1 bewertet.

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Die molekularen Mechanismen der Dekondensation von hochverdichtetem mitotischem Chromatin sind unklar. Wir präsentieren einen zellfreien Assay, der auf mitotischen Chromatinclustern basiert, die aus HeLa-Zellen und Xenopus laevis-Eiextrakt isoliert wurden und den Dekondensationsprozess in vitro originalgetreu rekonstituieren.

Ein zellfreien Assay zu Chromatindekondensation Studieren am Ende der Mitose

Wir präsentieren eine Methode zur Erzeugung von in-vitro- autarken mitotischen Schwingungen auf der Ebene der einzelnen Zelle durch Verkapselung Ei Extrakte von Xenopus Laevis in Wasser-in-Öl-Mikroemulsionen.

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

Ein hoher Durchsatz, automatisierte, Tabakprotoplasten Produktion und Transformation-Methodik beschrieben. Das Robotersystem ermöglicht massiv parallele Genexpression und Entdeckung im Modell BY-2-System, das auf nicht-Modellpflanzen übersetzbar sein sollte.

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Lernen Sie die Isolierung von Riesen-Lampenbürstenchromosomen aus Amphibienoozyten für Zellbiologie und Genetik. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Transkription und RNA-Dynamik in vivo.

Isolierung von Riesen Lampbrush Chromosome von Living Oozyten von Fröschen und Salamandern

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