Eine schnelle Strategie für die Isolierung neuer Faustoviruses von Umweltproben unter Verwendung von

Das übergeordnete Ziel dieser neuen Isolationsstrategie besteht darin, die Anzahl neu gewonnener Virusisolate zu erhöhen, um das Pan-Genom dieser neuen Virusfamilie zu untersuchen und ihre Ökosysteme sowie ihre potenzielle Pathogenität für den Menschen besser zu verstehen. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der Virologie beantworten und Virologen weltweit unterstützen, die an der Erforschung von Riesenviren und insbesondere von Faustoviren interessiert sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in den Neuerungen, die einzelne Schritte verbessern, wie beispielsweise die Antibiotika- und Antimykotika-Mischung, das neu entwickelte Nährmedium unter Nährstoffentzug, das speziell für Amöben geeignet ist, sowie der Einsatz der Durchflusszytometrie zur schnelleren und empfindlicheren Detektion von Zelllysen. Nach der Sammlung von verschmutzten Wasserproben gemäß dem schriftlichen Protokoll bereiten Sie die Wirtszellen, V. vermiformis, vor, indem Sie die Amöben einer 75 Quadratzentimeter großen Zellkulturschale mit 30 Milliliter Protease-Pepton-Hefe-Extrakt-Glukose-Medium, kurz PYG-Medium, hinzufügen und 48 Stunden bei 28 Grad Celsius inkubieren. Zählen Sie die Amöben mithilfe von Zählkammern und ernten Sie die Zellen nach Erreichen einer Konzentration von fünf mal 10 hoch 5 bis 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter durch Zentrifugation bei 720 mal g für 10 Minuten.

Den Überstand abpipettieren und das Amöben-Pellet mit 30 Milliliter steriler Page's Amöben-Salzlösung (PAS) resuspendieren. Nach einer erneuten Spülung des Pellets das Zellpräparat mit 30 Milliliter Hungermedium, das ein Antibiotikum und ein Antimykotikum enthält, auf eine Konzentration von etwa 106 Amöben pro Milliliter einstellen. Das Hungermedium ermöglicht es den Amöben, lebensfähig zu bleiben, ohne zu zystieren oder sich zu vermehren.

Als Nächstes 200 µL Amöben in die Vertiefungen einer 96-Loch-Flachbodenplatte aussäen und 30 Minuten bei 30 °C inkubieren. Danach die Wasserproben 1 Minute bei Raumtemperatur vortexen und jeweils 25 µL jeder Probe auf die Amöbenzellen impfen, wobei zwei Vertiefungen ohne Probe als negative Kontrollen belassen werden. Um Verdunstung zu vermeiden, die Platte mit der Erstkultur in einen Beutel mit feuchtem Tuch legen und die befeuchtete Kammer mit der Platte in einen Inkubator bei 30 °C stellen.

Drei Tage nach der ersten Inokulation die Primärkultur ohne mikroskopische Untersuchung wie eben gezeigt auf eine neue 96-Loch-Platte mit Amöben unterkultivieren. Bei 30 Grad Celsius drei Tage lang inkubieren. Anschließend mit der Unterstreichung eine dritte Platte wie beschrieben beimpfen und zwei Tage lang inkubieren.

Um eine Lyse in der finalen Co-Kultur-Platte nachzuweisen, schalten Sie das Cytometer ein und führen Sie gemäß Herstellerprotokoll eine Reinigung und Spülung durch, um die Hintergrundgeräusche zu reduzieren. Um eine 40-minütige vollautomatische Datenaufnahme durchzuführen, starten Sie den Hochdurchsatz-Sampler (HTS), um Proben automatisch aus der 96-Well-Platte gemäß Herstellerprotokoll zu laden. Programmieren Sie die HTS-Einstellungen wie hier aufgeführt: Probenvolumen von 150 µL, Mischvolumen von 50 µL, Mischgeschwindigkeit von 180, Anzahl der Mischvorgänge: 5, Spülvolumen zwischen den Proben: 400 µL, Flussrate: 2,5 µL pro Sekunde und Anzahl der aufgezeichneten Ereignisse: 10.000. Klicken Sie auf „Home“, damit der HTS die Platte erkennen oder lokalisieren kann. Bewerten Sie anschließend zuerst die Negativkontroll-Wells, die die Wirtsamöbenzellen enthalten, um die Amöbenpopulation zu erfassen und den Zellanteil anhand ihrer physikalischen Eigenschaften zu bestimmen. Achten Sie darauf, eine homogene Amöbenpopulation sowie eine zweite Population mit geringeren Ereignissen zu haben, die Ablagerungen und Rauschen entspricht. Beginnen Sie danach mit der Gating-Prozedur, indem Sie auf „Probe erfassen“ klicken.

Danach mithilfe des Pfeils, der die Gates definiert, die gewünschte Amöbenpopulation lokalisieren. Nachdem mindestens 10.000 Ereignisse eingegrenzt wurden, auf „Run“ klicken, damit das HTS automatisch die gesamte Platte durchführt. Die Datenaufnahme und -analyse entsprechend dem Größenparameter Vorwärtsstreuung und dem Strukturparameter Seitwärtsstreuung durchführen. Weitere Einzelheiten siehe im Text.

Nach dem Nachweis der Lyse mittels Durchflusszytometrie die lysierten Kokulturen vorsichtig auf- und abpipettieren, um die verbleibenden Amöben in Suspension zu bringen. Nachdem 50 Mikroliter jeder Probe auf Objektträger pipettiert wurden, die Suspension direkt 10 Minuten lang bei 800 × g zentrifugieren.

Als Nächstes fixieren Sie die Objektträger mit reinem Methanol und lassen Sie die Objektträger anschließend bei Raumtemperatur trocknen. Nach der Fixierung tauchen Sie die Objektträger dreimal für jeweils vier Sekunden in ESN-Lösung ein, bevor Sie sie für sechs Sekunden in Blau-Azur geben. Zum Schluss tauchen Sie die Objektträger für 45 Sekunden in PBS ein.

Lassen Sie die Objektträger vor der weiteren Beobachtung bei Raumtemperatur trocknen. Um neue fixierte Objektträger mit DAPI anzufärben, pipettieren Sie 15 Mikroliter DAPI auf die trockenen Objektträger. Untersuchen Sie die Objektträger unter einem Lichtmikroskop mit 1000facher Vergrößerung, um das Vorhandensein von Virusfabriken zu überprüfen.

Um die Elektronenmikroskopie durchzuführen, geben Sie fünf Mikroliter der positiven Probe auf ein plasmabehandeltes Raster und inkubieren Sie etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur. Trocknen Sie das Raster vorsichtig ab, geben Sie anschließend eine kleine Menge 1 % Molybdätsäure-Ammoniumlösung hinzu und inkubieren Sie 10 Sekunden lang. Nach dem vorsichtigen Entfernen des Tropfens lassen Sie das Raster fünf Minuten lang trocknen. Stellen Sie danach das Elektronenmikroskop auf 200 Kiloelektronenvolt ein. Setzen Sie das Raster auf den Halter und führen Sie den Halter in das Mikroskop ein. Klicken Sie auf das Vakuum-Übersichtssymbol und überprüfen Sie das Vakuum. Schließen Sie daraufhin die Ventile, stellen Sie eine Spotgröße von fünf und eine Vergrößerung von 25.000 ein, bevor Sie mit der Beobachtung beginnen. Nachdem Sie ein Riesenvirus auf dem Erfassungsbildschirm lokalisiert haben, verwenden Sie das Messwerkzeug, um das Virus zu vermessen.

Führen Sie die Molekularbiologie und die Sequenzierung des viralen Genoms gemäß dem Textprotokoll durch.

Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse der Detektion von zwei Faustoviren im Vergleich zu zuverlässigen negativen Kontrollen. Die negative Kontrolle für die Lyse enthielt eine 86 % Amöbenpopulation. Im Gegensatz dazu wurden mehr als 60 % der Amöben mit dem höchsten Anteil an Zelltrümmern in den positiven Proben lysiert.

Wie hier zu sehen ist, färben ESN und Blau-Azur die Kerne von nicht infizierten und infizierten Amöbenzellen sowie die Anwesenheit von Virusfabriken innerhalb der infizierten Zellen. Die DAPI-Färbung bestätigt ebenfalls das Vorhandensein von Virusfabriken in den Amöben. In diesen Aufnahmen zeigt die Elektronenmikroskopie die Anwesenheit von Faustovirus mit dem typischen Erscheinungsbild eines Megavirus, das aus einer ikosaedrischen Kapsid ohne Fibrillen und einer Größe von 200 Nanometern besteht.

Nach Beherrschung der Technik und nach der Kokultur kann diese Methode zur Lyseerkennung und Viruscharakterisierung innerhalb einer Stunde durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Amöben-Vitalität zu kontrollieren und mögliche Kontaminationen zu überprüfen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die molekularbiologische Untersuchung von Riesenviren angewendet werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich der Virusfamilie und/oder des Genotyps zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Virologie den Weg, um diese Virusfamilie, ihre spezifischen Wirte und ihre potenzielle Pathogenität zu erforschen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Riesenviren leicht isolieren kann, indem man die Anzahl und Arten der Proben erhöht und die besten Wirtszellen sowie Kulturbedingungen auswählt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Viren, die potenziell pathogen für den Menschen sind, äußerst gefährlich sein kann, insbesondere bei Abwasserproben.

Daher sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in SB2-Laboren unter gesicherten Bedingungen getroffen werden.