Name: Eine schnelle Strategie für die Isolierung neuer Faustoviruses von Umweltproben unter Verwendung von Vermamoeba vermiformis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Isolierungsstrategie für neue Faustovirus-Genotypen aus Umweltproben unter Verwendung von Vermamoeba vermiformis. Diese Methode ermöglicht Virologen die effiziente Erforschung riesiger Viren.

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Die Autoren haben keine Danksagungen zu machen.

1. Probenentnahme <ol><li> Sammeln Sie 70 Proben aus verschiedenen Umgebungen und Regionen. In diesem Fall verwenden Sie die folgenden: 5 schmutzige Wasserproben aus dem Dorf Saint Pierre de Meyzoargues (Frankreich), 15 Proben aus dem See im Parc Borély in Marseille (Frankreich); 15 Meerwasserproben mit Sediment aus den Felsbuchten an Samena in Marseille (Frankreich), 25 Flusswasserproben aus den Alpen (Frankreich), und schließlich, 10 Proben von Abwasser in La Ciotat (Frankreich). </li><li> Vortex Proben zur Homogenisierung vor dem Beimpfen, für eine Minute bei Raumtemperatur ohne jede Behandlung. </li></ol> 2. Isolierung Procedure <ol><li> Host-Vorbereitung für Blinde Kulturverfahren und Proben Inokulation <ol><li> Verwenden V. vermiformis (Stamm CDC19) als Zell Unterstützung für die Co-Kultur. </li><li> Aufrechterhaltung der Amöben bei 28 ° C, in einem 75 cm 2 Zellkulturflasche mit 30 ml Protease-Pepton-Hefeextrakt-Glucose - Medium (PYG). Bitte überprüfen Sie PYG Zusammensetzung in Tabelle 1. Hinweis: Nach 48 Stunden Amöben durch eine normale Zählung mit Zählen Dias quantifiziert werden (zB Kovaslides). </li><li> Ernte Zellen bei einer Konzentration von 5 × 10 5 zu 10 6 Zellen / ml und Pellet Amöben durch Zentrifugation bei 720 xg für 10 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen, und erneut zu suspendieren die Amöben Pellet in 30 ml sterile Seite der Amöbensalzlösung (PAS) Tabelle 1. Wiederholen Sie diesen Spülvorgang. </li><li> Re-suspendieren Amöben in 30 ml Hungermedium mit einem Antibiotikum und antimykotische Mischung in einer Konzentration von etwa 10 6 amoeba / ml. Das Hungermedium ist ein Überlebensmedium für die Amöbe, es ermöglicht, ohne Encystirung oder Multiplikation am Leben zu bleiben. Überprüfen Zusammensetzung in Tabelle 1. Hinweis: Das antimikrobielle Mittel Gemisch enthielt 10 ug / ml Vancomycin, 10 &amp; mgr; g / ml Imipenem, 20 ug / ml Ciprofloxacin, 20 μg / ml Doxycyclin und 20 &amp; mgr; g / ml Voriconazol. Diese Mischung diente dazu, die Bakterien und Pilzbefall zu reduzieren, die Virusvermehrung zu verringern oder verändern kann. </li><li> impfen Direkt 25 ul jeder Probe auf die 200 ul Amöbe Monoschicht in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden, die Amöbe Einhaltung begünstigen und bei 30 ° C in einer feuchten Umgebung brüten (feuchter Umgebung besteht in der Tasche eine nasse Kompresse des Vergebens enthält, die Platte, um Verdampfung zu vermeiden). Dies ist die primo-Kultur. Lassen Sie zwei Brunnen von Amöben ohne Probe Impfung; Dies dient als Negativkontrolle. Inkubieren dieses primo-Kultur für drei Tage. </li><li> Drei Tage nach der ersten Inokulation Subkultur der primo-Kulturplatte auf frischem Amöben als ohne mikroskopische Beobachtung oben beschrieben. Inkubieren Sie die neue Platte für drei Tage unter den gleichen Bedingungen wie die primo-Kultur. </li><li> Führen der endgültigen Kultur nach diesen drei Tagen Inkubation die gleiche Weise wie für the primo- und Subkultur. Inkubieren Sie die letzte Kultur für zwei Tage. Dann auf die Erkennung fortzufahren. </li></ol></li><li> Der Nachweis von Lysis durch automatisierte Flow Cytometry Hinweis: Blind Kultur gepaart mit Durchflusszytometrie unterscheidet sich vom bisherigen Standard der Isolation. Es ist empfindlicher, präzise und automatisiert. Für Nachweiszwecke, wandten wir eine neue Technik der Lyse mit der höchsten Geschwindigkeit zu erfassen, entwickelt und ohne mikroskopische Beobachtung. Diese Technik ist von Vorteil für das Screening Proben und hat eine bessere Empfindlichkeit als ältere Techniken. 7-9 <ol><li> Verwenden, um die 96-Well-Platte der endgültigen Kokultur Lyse zu detektieren. </li><li> Schalten Sie das Zytometer und führen Sie einen sauberen und Spülgang, um nach niedrigeren Hintergrundrauschen zu Protokoll des Herstellers zu erhalten. </li><li> Starten Sie den High Throughput Sampler (HTS) in Kombination mit Durchflusszytometer automatisch Proben laden von der 96-Well-Platte und führen Sie eine vollständig automatisierten Erfassung innerhalb von 40 min according dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Richten Sie die HTS wie folgt: Probenvolumen 150 &amp; mgr; l, Volumen 50 ul Mischen, Mischgeschwindigkeit 180, die Anzahl der Mixe 5, Waschvolumen zwischen jeder Probe 400 &amp; mgr; l, Flussrate 2,5 l / s ab, die Anzahl der aufgezeichneten Ereignisse 10.000. </li><li> Bewertung der negativen Kontrollvertiefungen des endgültigen Kokultur Mikroplatte zuerst um die amöben Bevölkerung Gate und der Anteil dieser Zellwirten gemäß ihrer physikalischen Eigenschaften zu bestimmen. Achten Sie darauf, eine homogene Amöbe Bevölkerung und eine zweite Population einer unteren Ereignisse zu haben, um Schmutz und Lärm entspricht. Hinweis: Dieses Gating-Verfahren unterscheidet subzellulärer Schutt und Klumpen aus einzelnen Zellen durch Größe, durch Vorwärtsstreuung geschätzt. mit der bestmöglichen Gating-Verfahren ist es deshalb wichtig, genau den Prozentsatz jeder Population bestimmen. Diese Prozentsätze können variieren, insbesondere wenn viele Arten von Protozoen verwendet werden, so ist es wichtig, stets einen negativ zu haben,e Steuerung, die als die Referenzpopulation für den Rest der Proben verwendet werden kann. </li><li> Starten Sie die Gating acquire Probe durch einen Klick. </li><li> Notieren Sie die Anzahl der Ereignisse, die nicht weniger als 10.000 Veranstaltungen. </li><li> Localize die Amöbe Population von Interesse mit dem Pfeil. Dies ist, wie die Tore zu definieren. </li><li> Nach Gating, lassen Sie den HTS-Spot oder die Platte finden, indem Sie &quot;Start&quot; klicken, dann die gesamte Platte automatisch ausgeführt. Führen Sie die Datenerfassung und Analyse nach der Größe und Strukturparameter (bzw. FSC (Vorwärtsstreuung) und SSC (side scatter)). Hinweis: Die Erkennung des Verlust der Amöbe-gated Bevölkerung signalisiert das Vorhandensein eines Krankheitserregers verantwortlich für Amöbe Lyse. Protozoen Lyse mit Virusinfektion assoziiert ist mit einer beliebig gestaltet Schwelle von 50% Lyse der Amöbe Population durch den Analysator und im Vergleich zu dem gleichen nicht-infizierten Population verwendet als zuverlässige negative Kontrolle gated detektiert. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Charakterisierung des neuen Isolaten nach der Lyse-Erkennung <ol><li> Vorläufige Färbung zu offenbaren die Anwesenheit von Riesenviren <ol><li> Nach der Lyse Detektion mittels Durchflusszytometrie, pipettieren lysiert Kokulturen die verbleibenden Amöben zu suspendieren. Zytozentrifuge dann direkt 50 ul der Suspension bei 800 xg für 10 min. </li><li> Nach dem Zentrifugieren fixieren Sie die Folien mit einer reinen Methanollösung. Stain die Folien eine kommerzielle Schnellfärbung von Eosin / blau Azur und DAPI-Färbung mit und beobachten unter einem Lichtmikroskop bei 1,000x Vergrößerung, um das Vorhandensein von Viren Fabriken zu überprüfen. <ol><li> Für eine schnelle Färbung, die Folien in die erste Eosinlösung stürzen (4 sec dreimal wiederholt) dann direkt gleitet in die zweite Befestigungslösung, die blauen Azur für 6 sec tauchen passieren, und spülen Sie schließlich die Folien für 45 sec mit einer Phosphatpufferlösung pH-Wert 7,2. Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur trocknen, dann gehen Sie zu observatiauf. </li><li> Für DAPI-Färbung, Ablagerung 15 ul der DAPI kommerziellen Stammlösung auf dem festen trockenen Objektträger. Vor Licht gehen dann auf die Beobachtung. </li></ol></li></ol></li><li> Elektronenmikroskopie <ol><li> Nach der ersten Identifizierung auf den Folien, um die Anwesenheit des Virus durch giant Elektronenmikroskopie Beobachtung der Überstand Kulturen beurteilen. </li><li> Kaution 5 ul der positiven Probe auf die glow-entladen Gitter. Warten für etwa 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Trocknen Sie das Gitter vorsichtig und sich auf sie einen kleinen Tropfen von 1% Ammoniummolybdat für 10 Sekunden. Lassen Sie das Raster für 5 Minuten trocknen lassen. </li><li> Gehen Mikroskopie bei 200 keV bis Elektron. </li><li> Legen Sie das Gitter auf den Halter; den Halter in das Mikroskop einzuführen. Schauen Sie sich die Vakuum-Übersicht, indem Sie auf das entsprechende Symbol klicken. Ventile schließen und beginnen Beobachtung bei einer Punktgröße 5 und Vergrößerung von x 25.000. </li><li> Messen Sie die Riesen-Virus mit ImageJ oder direktly am Mikroskop das Messwerkzeug des Mikroskops auf den Erwerb Bildschirms verwenden. Hinweis: Klassifizieren Sie die Probe in die Faustovirus Gruppe mit einem Kapsid Größe von etwa 200 nm. </li></ol></li><li> Molekularbiologie Anmerkung: Nach dieser Identifizierung, Molekularbiologie Untersuchungen zur Bestätigung, um entscheidend waren Faustovirus von Marseillevirus zu unterscheiden, die die gleiche Kapsid Größe und Aussehen unter Elektronenmikroskopie hat, obwohl sie die gleiche Wirtsspezifität nicht haben. Die Marseillevirus nicht auf Vermamoeba wachsen kann, ist die Faustovirus ist spezifisch für Vermamoeba und alle Versuche , es wie Acanthamoeba auf andere Amöbe zu wachsen sind bisher gescheitert. Das Design und die Anwendung der spezifischen Primer / Sonde - Systeme aufgeführt in den Werken von Reteno et al. ermöglichte eine genauere vorläufige Klassifizierung der neu-Amplifikation und Sequenzierung der viralen Gene isoliert Viren durch. <ol><li> ExTrakts DNA aus den positiven Kulturproben eines automatisierten Extraktionssystems nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Eine Echtzeit - PCR - Thermocycler unter Verwendung der in Reteno et al. 19 </li><li> Sequenz unter Verwendung der gleichen Primer, die für die Amplifikation verwendet wurden. Verwenden Sie die Primer DNA-RNA-Polymerase-Untereinheit 1 Gen-Targeting: Fstv_S2F 5&#39;-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 &#39;(vorwärts) und Fstv_S2R 5&#39;-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3&#39; (rückwärts) mit die Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA-Sonde. </li></ol></li></ol> 4. Virus Produktion, Reinigung und Genomsequenzierung <ol><li> Subkultur das einzige Virus Amöbe Kultur für Endpunktverdünnung Klonen. </li><li> Zur Herstellung: Es werden 20 - Kolben , die 30 ml PYG, 10 ml Vermamoeba vermiformis und 5 ml des isolierten Virus bereits aus Brunnen zu kleinen Kolben übertragen. </li><li> Inkubieren bei 30 ° C bis zur vollständigenLyse der Amöbe. Beachten Sie jeden Tag durch invertierte Lichtmikroskopie, bis alle Amöben lysiert werden. </li><li> Nach der vollständigen Lyse, bündeln alle Flaschen in einen Empfänger. Filter mit einem 0,45 um-Filter zur Beseitigung Schutt. </li><li> Starten Sie die Reinigung durch Ultrazentrifugation bei 89.800 × g für 75 min. Achten Sie darauf, das Gewicht der Rohre zu kalibrieren, bevor Zentrifugation starten. </li><li> Nach Zentrifugation entfernen Sie den Überstand aus jedem Röhrchen durch Absaugen und das Pellet in PAS mit dem gleichen Volumen für die Kalibrierung verwendet resuspendieren, vor der Zentrifugation wiederholt. </li><li> Wie oben, entfernen Sie den Überstand und resuspendiere alle Pellets in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Man reinige das Virus, das hergestellt wird, unter Verwendung von 25% Sucrose (27,5 g Saccharose in 100 ml PBS, filtriert auf einem 0,22 um Filter). <ol><li> Verwenden 8 ml Saccharose und 2 ml der viralen Suspension. Zentrifuge bei 89.800 · g für 1 h 15 min. Resuspendieren des Pellets in 1 ml PBS. Bei -80 ° C. </li&gt; </ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die Möglichkeit , dass Faustovirus schließen das erste Mitglied einer neuen Megavirales Familie ASFV zuerst von Reteno et al vorgeschlagen wurde sein könnte., 19 , aber einige Unterschiede noch unterschieden werden können. Es scheint unklar, ob Faustovirus die Asfarviridae Familie beitreten sollte oder ob es stattdessen eine neue vermeintliche Virusfamilie bilden. Dieses Problem wird weiter untersucht werden müssen, insbesondere eine umfassende Charakterisierung seiner Morphologie, Wirtsbere...

Die Entdeckung des Riesen Viren, vor allem die Angehörigen der Megavirales Ordnung, völlig verändert die Welt der Viren in Bezug auf die Partikelgröße und Genom Komplexität. Die Viren wurden bisher angenommen , kleine Einheiten zu sein, und die Mimivirus erschienen , alle Regeln zu brechen. 1 metagenomische Daten , die die Allgegenwart von Riesen Viren nicht nur in der Umgebung vermuten lässt, 2-5 , sondern auch beim Menschen. 6 Daher besteht weiterhin ein Bedarf ist für diese Viren in großem Maßstab zu suchen. Die Vielfalt dieser riesigen Viren durch Abtasten nicht nur eine Vielzahl von Gewässern und die damit verbundenen Ablagerungen weltweit beurteilt wurde, 7-11 , sondern auch durch eine Vielzahl von humanen Proben 12,13 Screening und Umweltproben. 7,9 Die Acanthamoeba polyphaga Mimivirus war isoliert durch Co-Kultur phagozytischen Protisten verwenden, in erster Linie spp Acanthamoeba. 14-16 waren eine ganze Sammlung von Riesenviren dann auchisoliert von dieser angegebenen Protisten Host, die die wissenschaftliche Gemeinschaft ihre Forschungs- und Isolierungsverfahren für Acanthamoeba spp beschränken gemacht. Offensichtlich diese Abhängigkeit von einem einzigen Host-Spezies hat dazu geführt, ein großer Teil der Viren übersehen. Die Tatsache , dass der Riese Virus, CroV, mit dem hoch motile marine Einzeller Cafeteria Roenbergensis isoliert wurde, zeigt , 17,18 die Notwendigkeit , eine breitere Palette von Protozoen zu verwenden , um neue Linien oder Familien von Riesen-Viren zu entdecken. Reteno et al. Gelang andere Protozoen als Zellwirte auszuwählen , die nie benutzt worden war, und isoliert die neue Asfar bezogenen Linie von Riesenviren (die neu benannte Faustovirus). 19 In einem Versuch, neue Faustovirus Genotypen zu isolieren, um die Mitglieder dieser viralen Linie zu erweitern, modifizierten wir unsere Isolierungsverfahren und verwendet sie Umweltproben zum Screening der Lage, neue Faustoviruses Ernte. Wir danndas gesamte Protokoll beschrieben, um die neuen Isolate zu charakterisieren. Wir untersuchten Vermamoeba vermiformis, die am häufigsten Protisten freilebende in menschlichen Umgebungen gefunden, 20-22 , die bereits in der Isolierung des ersten Faustovirus Prototyp E12 verwendet wird. 19 Diese Protisten ist derzeit noch wirtsspezifisch für Faustovirus. Wir wussten, dass keines der bekannten Riesen Viren für diese Amöbe pathogen war, weil keine Versuche anderen Riesen Viren wachsen in unserem Labor Amöbe Lyse oder das virale Wachstum zeigte. Aus diesem Grund glauben wir , dass V. vermiformis ist die beste und einzigartige Zell Unterstützung bekannt zu neuen Faustoviruses isolieren.

<table><tbody><tr><td>LSR FORTESSA Zytometer&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Frankreich&nbsp;</td><td>Artikel-Nr.: 649225B4</td></tr><tr><td>TECNAI G2 F20</td><td>FEI</td><td>Deutschland&nbsp;</td><td>Nr. 5027/11</td></tr><tr><td>Optisches inverses Mikroskop</td><td>leica&nbsp;</td><td>Frankreich</td><td>72643</td></tr><tr><td>DNA-Extraktion</td><td>Qiagen EZ1 Advanced XL Extraktionsroboter</td><td>Frankreich</td><td>L106A0452</td></tr><tr><td>PCR Cycler CFX96</td><td>Bio rad</td><td>France</td><td>785BR06298</td></tr><tr><td>PYG Medium, PAS, Hungermedium</td><td>Eigene Laborproduktion</td><td>Marseille URMITE</td><td>x</td></tr><tr><td>Amöbenstamm CDC-19</td><td>ATCC</td><td>Frankreich</td><td>50237</td></tr><tr><td>Platten</td><td>Cellstar</td><td>Frankreich</td><td>655180</td></tr><tr><td>PCR-Materialien, Primer.&nbsp;</td><td>eurogentec</td><td>France</td><td>Fibeln, zitiert im Manuskript</td></tr><tr><td>Glasdia 10 mit Gittern</td><td>Kova&nbsp;</td><td>USA</td><td>H899871441F</td></tr><tr><td>Eosin/blau Azur-Hemacolor Beize</td><td>Merck milipore&nbsp;</td><td>Frankreich</td><td>111955,6,57,109468</td></tr><tr><td>Vakuumfilter</td><td>Thermo scientific</td><td>France</td><td>BPV4550 / 20170115</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>Frankreich&nbsp;</td><td>Nr. 10010-023</td></tr><tr><td>DAPI-Fleck</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>Frankreich&nbsp;</td><td>Nr. D1306</td></tr><tr><td>cytospin 4 Zytozentrifuge</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>France</td><td>10522013JT184-31</td></tr><tr><td>Einzelzytologietunnel</td><td>Biomedical polymers inc.</td><td>Frankreich</td><td>BMP-cyto-S50</td></tr><tr><td>Kohlenstoffgitter&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>Frankreich&nbsp;</td><td>FCF400NI</td></tr><tr><td>Ammoniummolibdat</td><td>VWR international</td><td>Frankreich&nbsp;</td><td>21276185</td></tr><tr><td>Kolben&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td></td><td>Deutschland 833911</td></tr><tr><td>0,22 &mu; m Filter&nbsp;</td><td>Milex millipor&nbsp;</td><td>Frankreich</td><td>SE2M229104</td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge Sorval WX 80</td><td>Thermo scientific</td><td>Frankreich</td><td>9102448</td></tr><tr><td>Schnellstromfilter</td><td>Nalgene</td><td>France</td><td>450-0020</td></tr></tbody></table>

eine schnelle strategie für die isolierung neuer faustoviruses von umweltproben unter verwendung von<em&gt; vermamoeba vermiformis</em

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

Die Isolierung von Riesen-Viren ist von großem Interesse in dieser neuen Ära der Virologie, vor allem, da diese riesigen Viren sind Protisten verwandt. Riesen Viren können potentiell pathogen sein für viele Arten von Protisten. Sie gehören zu den kürzlich beschriebenen Reihenfolge von Megavirales. Die neue Linie Faustovirus, die von Abwasserproben isoliert wurde, ist weitläufig verwandt mit dem Säuger-Erreger der Afrikanischen Schweinepest-Virus. Dieses Virus ist auch spezifisch für seine Amöben Wirt, Vermamoeba vermiformis, einem Protisten gemeinsam in Wassersystemen Gesundheitswesen. Es ist wichtig, neue Faustovirus Genotypen fortzusetzen, um die Isolierung ihres Genotyps Sammlung zu vergrößern und seine pan-Genom untersuchen. Wir entwickelten neue Strategien für die Isolierung von zusätzlichen Belastungen durch die Verwendung von Antibiotika und Antimykotika Kombinationen, um die Verbesserung der Bakterien- und Pilzkontaminationen der Amöbe Kokultur und begünstigen die Virusvermehrung zu vermeiden. Wir führten auch eine neue starvation Medium zu halten V. vermiformis unter optimalen Bedingungen für Viren Co-Kultur. Schließlich verwendeten wir Durchflusszytometrie statt mikroskopischen Beobachtung, die zeitaufwendig ist, den cytopathogenen Effekt zu erkennen. Wir erhielten zwei Isolate von Abwasserproben, die Effizienz dieses Verfahrens zu beweisen und damit die Verbreiterung der Sammlung von Faustoviruses, besser an ihre Umgebung zu verstehen, Wirtsspezifität und genetische Inhalt.

Das System in diesem Manuskript studiert validiert seine Proof of Concept durch zwei neue Faustoviruses zu isolieren. Von den 70 getesteten Proben wurden zwei Episoden der Lyse nachgewiesen, im Gegensatz zu unseren zuverlässigen negativen Kontrollen. Die negative Kontrolle für die Lyse enthielt eine 86% Amöbe Bevölkerung. Dagegen sind die positiven Proben (ST1 für Saint Pierre de Meyzoargues) und (LC9 für das La Ciotat Probe 9) zeigte einen dramatischen Rückgang der gated Amöben; mehr al...

Wir beschreiben hier die neuesten Fortschritte in der Virusisolierung zur Charakterisierung neuer Genotypen des Faustovirus, einer neuen Asfarvirus-verwandten Linie von Riesenviren. Dieses Protokoll kann auf die Hochdurchsatzisolierung von Viren angewendet werden, insbesondere von Riesenviren, die Amöben infizieren.

Eine schnelle Strategie für die Isolierung neuer Faustoviruses von Umweltproben unter Verwendung von<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Das übergeordnete Ziel dieser neuen Isolationsstrategie besteht darin, die Anzahl neu gewonnener Virusisolate zu erhöhen, um das Pan-Genom dieser neuen Virusfamilie zu untersuchen und ihre Ökosysteme sowie ihre potenzielle Pathogenität für den Menschen besser zu verstehen. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der Virologie beantworten und Virologen weltweit unterstützen, die an der Erforschung von Riesenviren und insbesondere von Faustoviren interessiert sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in den Neuerungen, die einzelne Schritte verbessern, wie beispielsweise die Antibiotika- und Antimykotika-Mischung, das neu entwickelte Nährmedium unter Nährstoffentzug, das speziell für Amöben geeignet ist, sowie der Einsatz der Durchflusszytometrie zur schnelleren und empfindlicheren Detektion von Zelllysen. Nach der Sammlung von verschmutzten Wasserproben gemäß dem schriftlichen Protokoll bereiten Sie die Wirtszellen, V. vermiformis, vor, indem Sie die Amöben einer 75 Quadratzentimeter großen Zellkulturschale mit 30 Milliliter Protease-Pepton-Hefe-Extrakt-Glukose-Medium, kurz PYG-Medium, hinzufügen und 48 Stunden bei 28 Grad Celsius inkubieren. Zählen Sie die Amöben mithilfe v

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die Studie beschreibt eine kostengünstige Methode für die Identifizierung der Quelle der fäkale / Urin Kontamination oder Verunreinigung durch Nitrat in Wasser mittels qPCR für die spezifische Quantifizierung von Mensch / Schwein / Rind DNA-Viren, Adenoviren und Polyomaviren als MST-Tools vorgeschlagen.

Kostengünstige Methode für Mikrobielle Source Tracking mit spezifischen menschlichen und tierischen Viren

Quelle: Bou Khalil, J. Y., et al. Eine schnelle Strategie zur Isolierung neuer Faustoviren aus Umweltproben unter Verwendung von Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016).Dieses Video zeigt die Abbildung von Faustovirus-Partikeln aus einer infizierten Amöbenkultur mittels Transmissionselektronenmikroskopie. Es behandelt die Probenvorbereitung auf dem Gitter, die negative Färbung mit Ammoniummolybdat zur Kontrastverbesserung und die Visualisierung des Virus im Mikroskop. Der Protokollabschnitt...

Visualisierung und Größenbestimmung von Faustoviren mittels Elektronenmikroskopie

Quelle: Sahmi-Bounsiar, D. et al. Einzelzell-Mikroaspiration als alternative Strategie zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung zur Trennung von Gemischen riesiger Viren. J. Vis. Exp. (2019)In diesem Video wird die Einzelzell-Mikroaspiration zur Isolierung und Anzucht einer einzelnen Riesenviruspopulation aus einer gemischten Viruspopulation unter Verwendung von Amöben als Wirtszellen demonstriert.

Isolierung eines einzelnen Riesenvirus aus einer gemischten Viruspopulation unter Verwendung von Amöben

Quelle: Bou Khalil, J. Y.,et al. Eine schnelle Strategie zur Isolierung neuer Faustoviren aus Umweltproben unter Verwendung von Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Anreicherung von Riesenviren aus einer Umwasserprobe mithilfe einer amöbenbasierten Kultur zur anschließenden Detektion und Analyse.

Amöbenbasierte Anreicherung von Riesenviren aus einer Umweltwasserprobe

EPA-Methode 1615 verwendet einen elektropositiven Filter, um Enteroviren und Noroviren in Umwelt- und Trinkwasser zu konzentrieren. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren zur Entnahme von Proben für Analysen nach Methode 1615.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser von Kultur und RT-qPCR. I. Sammlung von Virenproben

Hier stellen wir ein Verfahren zur Quantifizierung von Enteroviren und Noroviren in Umwelt- und Trinkwassern mittels reverser Transkriptions-quantitativer PCR vor. Die mittlere Virusrückgewinnung aus dem Grundwasser mit diesem standardisierten Verfahren der EPA-Methode 1615 betrug 20 % für Polioviren und 30 % für murine Noroviren.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser, Kultur und RT-qPCR. Teil III. Virenerkennung durch RT-qPCR

Hier stellen wir VirWaTest vor, eine einfache, erschwingliche und tragbare Methode zur Konzentration und Detektion von Viren aus Wasserproben am Einsatzort.

VirWaTest, eine Point-of-Use-Methode zum Nachweis von Viren in Wasserproben

Hier beschreiben wir eine einzellige Mikro-Aspirationsmethode zur Trennung infizierter Amöben. Um virale Subpopulationen in Vermamoeba vermiformis zu trennen, die mit Faustoviren und unbekannten Riesenviren infiziert sind, haben wir das unten beschriebene Protokoll entwickelt und seine Fähigkeit demonstriert, zwei neuartige Riesenviren mit geringem Überfluss zu trennen.

Single Cell Micro-Aspiration als Alternative zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung für die Trennung von Riesenviren

Dieses Protokoll skizziert eine Methode zur effizienten Extraktion lebender Nematoden aus natürlichen Substraten im Feld.

Schnelle Isolierung wilder Nematoden durch Baermann Funnel

Die Viruskonzentration aus Wasser- und Abwasserproben aus der Umwelt ist eine anspruchsvolle Aufgabe, die vor allem zur Identifizierung und Quantifizierung von Viren durchgeführt wird. Während mehrere Methoden zur Viruskonzentration entwickelt und getestet wurden, demonstrieren wir hier die Wirksamkeit der Ultrafiltration und der Magermilchflockung für RNA-Viren mit verschiedenen Probentypen.

Konzentration von Viruspartikeln aus Wasser- und Abwasserproben aus der Umwelt mittels Magermilchflockung und Ultrafiltration

Hier beschreiben wir Methoden der Probenahme aus den euphotischen Zonen von Meeres- und Süßwasserökosystemen zur Isolierung von Cyanophagen (und ihren Wirten) und Post-Sampling-Prozesse, die einzelne Genotypen anreichern und die Dynamik der Virus-Wirt-Interaktion charakterisieren.

Umweltproben von photosynthetischen Mikroben und ihren Viren: Vom Feld ins Labor

Erfahren Sie eine schnelle Isolierungsstrategie für neue Faustovirus-Genotypen aus Umweltproben unter Verwendung von Vermamoeba vermiformis. Diese Methode ermöglicht Virologen die effiziente Erforschung riesiger Viren.

Eine schnelle Strategie für die Isolierung neuer Faustoviruses von Umweltproben unter Verwendung von

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