Erkennung von Anastasis In Vivo durch CaspaseTracker Biosensor

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Umkehrung des Zelltodprozesses nach Caspase-Aktivierung bei lebenden Tieren anhand von Drosophila melanogaster als Modell zu erkennen und zu verfolgen. Als Reaktion auf Todesreize durchlaufen Zellen einen programmierten Zelltod, wie z. B. die Apoptose, die traditionell als irreversible Kaskade angesehen wird, die zum Zelltod führt. Interessanterweise können jedoch einige absterbende Zellen nach Wegfall des Todesreizes den Zelltodprozess auch im späten Stadium umkehren.

Durch ein neu entdecktes Phänomen der Zellwiederherstellung, die Anastasis. Die Lebendzellmikroskopie zeigt, dass apoptotische sterbende Zellen einzigartige morphologische Merkmale aufweisen, wie z. B. das Blubben der Plasmidmembran, die Kernkondensation und die Zellschrumpfung. Im Allgemeinen wird davon ausgegangen, dass diese Zellen absterben.

Nach dem Waschen und Inkubieren der absterbenden Zellen mit frischem Medium werden sie jedoch anastasiert, erholen sich und können sich später teilen. Es ist schwierig, Anastasis bei lebenden Tieren zu erkennen und zu verfolgen, da die gewonnenen Zellen morphologisch nicht von den umgebenden gesunden Zellen zu unterscheiden sind. Um dieses Problem zu lösen, wurde das Säugetier-Biosensorsystem CaspaseTracker entwickelt, um die Zellen zu identifizieren und zu verfolgen, die den Zelltodprozess nach der Ausführung oder Caspase-Aktivierung, dem Kennzeichen der Apoptose, umkehren.

Dieses Biosensorsystem besteht aus zwei Komponenten: dem Caspase-aktivierbaren Transaktivator, rtTA, und dem Cre LoxP-basierten rtTA-Aktivitätsreporter. In gesunden Zellen ohne Caspase-Aktivität ist rtTA durch Caspase-spaltbaren DEVD-Linker an einen Plasmamembrananker gebunden. Da angebundenes rtTA nicht vom Zytosol in den Zellkern translozieren kann, bleibt der rtTA-Reporter inaktiv.

Bei der Aktivierung als Reaktion auf die Induktion des Zelltods spalten Caspasen jedoch den DEVID-Linker, wodurch der rtTA in den Zellkern transloziert wird, um den rtTA-Reporter zu aktivieren. Im Zellkern angekommen, bindet das rtTA an das Tet-Response-Element (TRE) und löst die transiente Expression der Cre-Rekombinase aus, was zu einem irreversiblen Rekombinationsereignis führt, das die Stopp-Codon-Kassette zwischen dem CAG-Promotor und den kodierenden Sequenzen für das rot fluoreszierende Protein DsRed entfernt. Dies führt zu einer dauerhaften Expression von DsRed, das als permanenter Fluoreszenzmarker für Zellen dient, die nach der Caspase-Aktivität am Leben bleiben können, sowie für ihre Nachkommen.

Die konfokale Lebendzellmikroskopie zeigt, dass die CaspaseTracker-Biosensorzellen nach transienter Zelltodinduktion während und nach ihrer Genesung DsRed exprimieren und sie daher von den nicht wiedergefundenen Zellen unterscheiden, die durch weiße Pfeile gekennzeichnet sind, sowie von den Kontroll-Biosensorzellen, die nicht dem Zelltodreiz ausgesetzt waren. Der programmierte Zelltod, wie z.B. die Apoptose, wird im Allgemeinen als irreversibel angesehen, da er durch eine zügellose und massive Zellzerstörung ausgeführt wird. Wir stellen jedoch fest, dass sich diese sterbende Zelle auch in einem späten Stadium erholen kann, das als Punkt ohne Wiederkehr angesehen wurde, wie z. B. nach der Freisetzung von Cytochrom c, der Caspase-3-Aktivierung, DNA-Schäden, dem Bläschen der Plasmamembran, der Zellschrumpfung und der Bildung apoptotischer Körper.

Wir nannten diese Umkehrung des Zelltodprozesses Anastasis, was auf Griechisch Auferstehen zum Leben bedeutet. Mit Hilfe der Mikroskopie lebender Zellen können wir die Anastasis in kultivierten Zellen beobachten. Es ist jedoch technisch schwierig, eine Anastase bei lebenden Tieren zu beobachten, da die gewonnene Todeszelle wie normale gesunde Zellen aussehen kann, die überhaupt nicht den Zelltod versucht haben.

Aus diesem Grund haben wir ein CaspaseTracker-Biosensorsystem entwickelt, um Anastasen bei lebenden Tieren zu erkennen und zu verfolgen. Die Drosophila-Version des CaspaseTracker-Systems ist ein dualer Biosensor, der aus zwei Komponenten besteht: dem Caspase-aktivierbaren Transkriptionsfaktor GAL4 und dem GAL4-Aktivitätsreporter, bekannt als G-TRACE. In den Zellen ohne Caspase-Aktivität ist der Hefe-Transkriptionsfaktor GAL4 über einen Caspase-spaltbaren DQVD-Linker an eine Plasmamembran-Ankerdomäne gebunden.

Bei der Caspase-Aktivierung spalten aktivierte Caspasen den DQVD-Linker, um GAL4 freizusetzen, das dann in den Zellkern transloziert, um den G-TRACE-Reporter zu aktivieren. Das nukleäre GAL4 bindet an die spezifischen vorgeschalteten aktivierenden Sequenzen, abgekürzt UAS, um die transiente Expression von RFP auszulösen, das als Reporter der jüngsten oder aktuellen Caspase-Aktivität dient, bis die Caspase- und GAL4-Aktivität stoppt und das RFP-Protein abgebaut wird. GAL4 löst auch die Expression der FLP-Rekombinase aus, was zu einem Rekombinationsereignis führt, das die Stoppkassette zwischen dem Ubiquitin, abgekürzt Ubi, dem Promotor und den Beschichtungssequenzen für das nuklear ausgerichtete GFP entfernt.

Dies führt zu einer dauerhaften Expression von nukleärem GFP, das als permanenter Marker für Zellen dient, die Caspase-Aktivität erfahren haben, aber am Leben bleiben, sowie für ihre Nachkommen. Daher kann dieses System Zellen mit laufender oder kürzlicher Caspase-Aktivität durch das transiente RFP-Signal und vergangene Caspase-Aktivität mit dem permanenten GFP-Signal identifizieren. Ein Kontrollbiosensor weist an der Caspase-Spaltstelle die Mutation DQVA auf, die unempfindlich gegenüber Caspase-Aktivität ist.

Caspase-empfindliche GAL4-Weibchen wurden mit jungen männlichen G-TRACE-Fliegen gekreuzt oder umgekehrt, um die CaspaseTracker-Fliegen zu erzeugen. Um die Reversibilität des Zelltodprozesses nach Caspase-Aktivierung zu testen, werden die Fliegen zunächst vorübergehenden, den Zelltod induzierenden Umweltstressen ausgesetzt, wie z.B. Kälteschock oder Proteinhunger. Dann werden die gestressten Fliegen zur Erholung wieder in normale Kulturbedingungen überführt.

Gewebe wurde aus den Eikammern in den Eierstöcken von den Kontrollfliegen, gestressten oder geborgenen Fliegen gewonnen. Die Proben wurden einer konfokalen Mikroskopie unterzogen, um die Fluoreszenzsignale des CaspaseTracker-Biosensors zu detektieren. Zu Beginn fliegt das betäubte, kürzlich geschlossene Caspase-empfindliche DQVD GAL4 mit Kohlendioxid und setzt mit einem Pinsel 7 bis 10 jungfräuliche Weibchen mit einem kleinen Klecks Hefepaste in ein Fläschchen mit frischem Futter um.

Verpaaren Sie die Weibchen mit 7 bis 10 jungen, G-TRACE GAL4 Reporter-Rüden. Frisch eingeschlossene jungfräuliche Fliegen zeigen das dunkelgrüne Mekonium, das durch Pfeile angedeutet ist und die Überreste von Larvennahrung sind. Die neu eingeschlossenen Fliegen sind in der Regel größer als die ausgewachsenen Fliegen.

Männchen haben einen dunkleren Hinterleib, der durch Kreise gekennzeichnet ist, und sind tendenziell kleiner als Weibchen. Richten Sie die Kreuzung bei 18 Grad Celsius ein, um unspezifische Signale des CaspaseTracker-Biosensors in den Nachkommen zu reduzieren, da die GAL4-Aktivität mit der Temperatur zunimmt. Alle drei bis sieben Tage geben Sie die erwachsenen Tiere in ein neues Fläschchen mit Hefepaste, bis ihre Produktivität abnimmt.

Wenn die Nachkommen eingeschlossen sind, verbinden Sie die Fliegen mit beiden Transgenen von Caspase-empfindlichem GAL4 und G-TRACE, die als CaspaseTracker-Nachkommenfliegen fungieren. Beide Einsätze werden durch Curly-O ausgeglichen. Die nicht-Curly-Flügelfliegen haben also beide Transgene.

Für eine Negativkontrolle entnehmen Sie duale transgene Nachkommen aus einer Kreuzung zwischen Caspase-unempfindlichen DQVA-GAL4-Weibchen und G-TRACE GAL4-Reporter-Männchen oder umgekehrt. Aus den experimentellen Kreuzungen werden Kohorten von 10 bis 20 neu geschlossenen weiblichen Fliegen auf neue Fläschchen mit Hefepaste übertragen. Das Hinzufügen einiger Männchen hilft den Weibchen bei der Eiproduktion.

Bringen Sie die gut genährten Fliegen für einen Tag auf 18 Grad Celsius, damit ihre Eierstöcke durch OO-Genese Eikammern produzieren. Um ihre Eikammern zur Apoptose zu veranlassen, verwenden Sie dann einen Kälteschock. Füllen Sie die Fliegen in ein neues Fläschchen ohne Futter und frieren Sie sie eine Stunde lang bei 7 Grad Celsius ein.

Eine alternative Methode, um die Apoptose der Eikammer zu induzieren, besteht darin, die Fliegen drei Tage lang mit 8 Prozent Saccharose und 1 Prozent Agar bei 18 Grad Celsius zu versorgen. Wechseln Sie die proteinfreien Lebensmittelfläschchen täglich, wenn Sie diese Methode anwenden. Nachdem Sie die Fliegen mit einer der beiden Methoden gestresst haben, bringen Sie sie in den normalen Haltungszustand zurück und füttern Sie sie drei Tage lang mit Hefepaste, damit sie sich erholen können.

Später können Sie diese Fliegen sezieren, um ihre Eikammern und Eierstöcke zu isolieren. Nachdem Sie sie betäubt haben, verwenden Sie zwei Paar Pinzetten, um ihre Köpfe zu entfernen. Ziehen Sie dann an den Fliegen an der Basis des Bauches, um ihre Eierstöcke zu entfernen.

Bereiten Sie die Entnahme der Eierstöcke vor, indem Sie die Pipettenspitzen aus Kunststoff mit 1 Prozent BSA beschichten, das in Wasser oder PBS gelöst ist, damit die Eikammern nicht an den Pipettenspitzen kleben. Nachdem Sie die Eikammern präpariert haben, sammeln Sie sie in vorbereiteten Spitzen mit etwa einem halben Milliliter PBS. Dann in ein Ein-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umfüllen und die Eier absetzen lassen.

Setzen Sie den Vorgang bei schlechten Lichtverhältnissen oder völliger Dunkelheit fort, um ein Ausbleichen der fluoreszierenden Tags zu verhindern. Saugen Sie das PBS ab und laden Sie 500 Mikroliter vier Prozent Paraformaldehyd in PBS in das Zentrifugenröhrchen. Lassen Sie die Eier 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur unter sanfter Drehung fixieren.

Vermeiden Sie eine längere Fixierung, da dadurch das Signal der fluoreszierenden Proteine in den Eikammern erschöpft wird. Sobald es fixiert ist, entfernen Sie das PFA und waschen Sie die Eikammern dreimal mit 500 Mikrolitern PBS-T. Dann inkubieren Sie die Eikammern mit PBS-T über Nacht bei 4 Grad Celsius mit sanfter Rotation, um die Eikammern zu permeabilisieren.

Am nächsten Morgen geben Sie 500 Mikroliter PBS-T mit 5 Mikrogramm blauem Kernfarbstoff, wie z. B. Hoechst, in die Eikammern. Lassen Sie sie bei sanfter Rotation bei Raumtemperatur ein bis zwei Stunden lang inkubieren, aber nicht länger, sonst werden die Signale unspezifisch. Waschen Sie anschließend die Eikammer dreimal 10 Minuten lang pro Waschgang mit PBS-T.

Saugen Sie dann mit einer feinen Pipette das gesamte PBS-T ab und tragen Sie 200 Mikroliter Anti-Bleaching-Eindeckmittel auf. Die Gewebe schwimmen auf der Oberseite, bevor sie das Einbandmittel vollständig aufgenommen haben. Inkubieren Sie die Eikammer im Mittel bei 4 Grad Celsius für drei Stunden bis über Nacht.

Nach vollständiger Aufnahme des Eindeckmittels sinken die Gewebe auf den Boden der Schläuche und sind bereit für die Montage. Tragen Sie zunächst Vaseline auf den Objektträger oder den Deckglas auf, um eine Zerstörung der Eikammern durch Überkompression zu vermeiden. Um die gefärbten Eierkammern zu montieren, übertragen Sie sie mit 200 Mikrolitern Eindeckmittel auf einen Glasobjektträger und decken Sie sie mit einem 20 Quadratmillimeter großen Glasdeckglas ab.

Versiegeln Sie den Deckglas mit Nagellack und fahren Sie mit der konfokalen Mikroskopie fort. In den Eikammern des Eierstocks gab es bei den gesunden CaspaseTracker-Fliegen keine CaspaseTracker-Biosensoraktivität, was durch einen Mangel an grüner und roter Fluoreszenz angezeigt wurde. Nachdem die Fliegen jedoch drei Tage lang zelltodinduzierendem Umweltstress wie Proteinmangel ausgesetzt waren, durchliefen die Eikammern den Zelltodprozess mit Caspase-Aktivierung, der RFP- und GFP-Biosensorsignale induzierte.

Im Gegensatz dazu hob die Mutation der Caspase-Spaltstelle in den Kontroll-Caspase-unempfindlichen DQVA-Fliegen die Biosensor-Sensitivität auf, was darauf hindeutet, dass die Biosensorsignale von der Caspase-Aktivität abhängen. Dann erhielten die ausgehungerten, Caspase-empfindlichen Biosensorfliegen drei Tage lang Proteinnahrung. Die Eikammern der geborgenen Fliegen exprimierten den RFP transienten Caspase-Reporter nicht, was auf keine kürzliche oder anhaltende Caspase-Aktivität hinweist.

Wichtig ist, dass die geborgenen Eikammern nur GFP exprimierten, was darauf hindeutet, dass sie den Zelltodprozess nach der Caspase-Aktivierung umgekehrt hatten. Anastase wird auch in vivo nach vorübergehendem Zelltod induzierendem Temperaturstress beobachtet. Als Reaktion auf einen Kälteschock exprimieren die sterbenden Eikammern die RFP- und GFP-Biosensormarker, die die kürzliche oder anhaltende Caspase-Aktivität, dargestellt durch das RFP-Signal, und die vergangene Caspase-Aktivität, dargestellt durch das GFP-Signal, anzeigen.

Nach dem Stressabbau durch Rückkehr zum normalen Kulturzustand für drei Tage zeigten die Eikammern der geborgenen Fliegen jedoch nur den GFP-Caspase-Reporter, was darauf hindeutet, dass die Zellen in diesen Eikammern zu einem Zeitpunkt nach der Caspase-Aktivierung eine Anastase durchliefen. Bemerkenswert ist, dass das GFP CaspaseTracker-Signal zeigt, dass mehrere Zelltypen innerhalb der Eikammern in der Lage sind, den Zelltodprozess umzukehren und die Schäden durch Caspasen zu reparieren, einschließlich Keimbahnzellen wie Eizellen und Ammenzellen sowie somatische Follikelzellen. Interessanterweise markierte GFP auch Zellen im Germarium, die Stammzellen enthalten, zusammen mit den zugehörigen Eikammern in derselben Eierstockkette.

Daher könnten diese GFP-positiven Eikammern aus Stammzellen gewonnen worden sein, die einer Anastase unterzogen wurden. Hier sind Bilder, die das Gewebe zeigen, das die Aktivität des CaspaseTracker-Biosensors zeigt, ohne Umweltstress ausgesetzt zu sein. Dies sind die Mundwerkzeuge, der Vorderdarm, der Kropf, der Mitteldarm, der Hinterdarm, die Malpighischen Tubuli, der Anus, der Eileiter und die Eierstöcke einer präparierten, neu geschlossenen weiblichen Fliege am Tag 0.

Die konfokale Mikroskopie zeigt die rezente Caspase-Aktivität, wie durch RFP angezeigt, und die vergangene Caspase-Aktivität, die durch GFP angezeigt wird. Vergrößerte Bilder zeigen die kürzliche oder anhaltende und vergangene Caspase-Aktivität am Sehlappen, an der Kardia, an den Malpighischen Tubuli, im Hinterdarm und an den Muskelwänden an den Eikammern, die mit der F-Aktin-Färbung kolokalisiert sind. Einige Gewebe, wie z. B. der Eileiter, zeigen nur eine Caspase-Aktivität in der Vergangenheit.

Diese Biosensoraktivitäten deuten auf eine mögliche anästhetische Aktivität während der Embryonalentwicklung oder einer normalen Homöostase hin. Es könnte auch auf eine aktuelle oder vergangene nicht-apoptotische Caspase-Aktivität hinweisen. Weitere Informationen finden Sie im Manuskript.

Der in vivo CaspaseTracker Biosensor meldet spezifisch Caspase-Aktivität, da der unempfindliche CaspaseTracker mit der nicht-Caspase-spaltbaren Sequenz DQVA keine Biosensoraktivität aufweist. Das einzige Signal hier ist das unspezifische Signal der Autofluoreszenz von Pigmenten, Nagelhaut und Fettkörpern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein allgemeines Verständnis dafür haben, wie wir das CaspaseTracker-Biosensorsystem zur Erkennung und Verfolgung von Anastasen bei lebenden Tieren einsetzen können.

Diese Biosensoren können die Untersuchung der Währung und der bekannten Funktion der Anastase erleichtern. Ihre Identifizierung der Reichweite hat ein breites Spektrum an physiologischen, pathologischen und therapeutischen Anwendungen. Während diese Biosensoren die Umkehrung der Apoptose nach Caspase-Aktivierung erkennen können, können sie auch die Erholung der Zellen nach dem Versuch anderer Formen des Zelltods erkennen, die direkt oder indirekt Caspase-Aktivitäten beinhalten.

Bei der Planung eines Experiments ist es sehr wichtig, reziproke Kontrollen einzubeziehen, um das fluoreszierende Biosensorsignal, das Anästhesiezellen verfolgt, von den sterbenden Zellen mit anhaltenden Caspase-Aktivitäten zu unterscheiden. Die gesunden Zellen mit den aktuellen oder früheren bekannten apoptotischen Caspase-Aktivitäten und dem unspezifischen Autofluoreszenzsignal vom Pigment, Fett und kritisch. Die ausführliche Diskussion finden Sie in der PDF-Version dieses Manuskripts.