Name: Unvoreingenommene Tiefe Sequenzierung von RNA-Viren aus klinischen Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Lernen Sie eine unvoreingenommene RNA-Sequenzierungsmethode für virale Genomik aus klinischen Proben. Dieses Protokoll ermöglicht die de novo Assemblierung von Lassa- und Ebolaviren ohne Vorwissen über Sequenzen.

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Diese Arbeit wurde teilweise mit Bundesmitteln von den National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) und vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, im Rahmen von Verträgen (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C und U19AI110818) finanziert.

Ethik-Anweisung: Lassa-Fieber-Patienten wurden für diese Studie rekrutiert unter Verwendung von Protokollen von menschlichen Probanden Ausschüsse an der Tulane Universität genehmigt, Harvard University, Broad Institute, Irrua Fach Teaching Hospital (ISTH), Kenema Regierungskrankenhaus (KGH), Oyo Staatsministerium für Gesundheit, Ibadan , Nigeria und Sierra Leone Ministerium für Gesundheit. Alle Patienten wurden mit einem ähnlichen Standard der Behandlung behandelt und das Medikament Ribavirin angeboten, auch nicht entschieden, sie in der Studie teilzunehmen. Für Lassa-Fieber (LF) der Patienten, die Behandlung mit Ribavirin folgte den derzeit empfohlenen Richtlinien und wurde in der Regel so schnell wie LF angeboten wurde stark vermutet. Aufgrund der schweren Ausbruch für Ebola-Virus-Krankheit (EVD), Patienten, die nicht durch unsere Standardprotokolle zugestimmt werden konnte. Verwendung von klinischen überschüssigen Proben von EVD Patienten Stattdessen wurde von Institutional Review Boards in Sierra Leone und an der Harvard University bewertet und genehmigt. Die Office des Sierra Leone Ethik und Scientific Review Committee, die Sierra Leone Ministerium für Gesundheit und Hygiene, und der Harvard Ausschuss für die Verwendung von menschlichen Probanden haben einen Verzicht auf Zustimmung erteilt zu sequenzieren und öffentlich verfügbaren viralen Sequenzen von Patienten und Kontaktproben erhalten machen während des Ebola-Ausbruch in Sierra Leone gesammelt. Diese Stellen auch die Verwendung von klinischen und epidemiologischen Daten für de-identifizierte Proben aus allen Verdacht EVD Patienten während des Ausbruchs Antwort zu erhalten Pflege gesammelt gewährt. Die Sierra Leone Ministerium für Gesundheit und Hygiene auch die Verbringung von nicht-infektiösen, nicht-biologische Proben von Sierra Leone auf dem Broad Institute und der Harvard University für genomischen Untersuchungen bei Ausbruch Proben genehmigt. 1. DNase-Behandlung der Proben-RNA (bis zu 55 &amp; mgr; l Extrahierte Gesamt-RNA, ~ 4 h) <ol><li> Stellen Sie die DNase - Reaktion in einer 96-Well PCR - Platte auf Eis in einem Bio - Sicherheitsschrank nach oben , wie in Tabelle 1 beschrieben , </strong&gt;, Schritt 1.1 (Gesamtvolumen 70 ul / Vertiefung). Hinweis: Ein Master-Mix hergestellt werden können. </li><li> Vortex sanft und gründlich, dann bei 280 × g bei RT Zentrifuge für 1 min. </li><li> für 30 min bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Cleanup unter Verwendung von RNA Solid Phase Reversible Immobilisation (SPRI) Perlen. <ol><li> Warm RNA Perlen für 30 min auf RT. </li><li> Sanft RNA Perlen Flasche schütteln alle magnetischen Partikel zu suspendieren, die bereits gelöst haben. In 1.8x Volumen (126 ul) von RNA-Perlen zu DNase behandelten RNA (70 &amp; mgr; l), mischen Sie mit einer Pipette 10-mal und Inkubation für 5 min bei RT (Gesamtvolumen in gut 196 ul). </li><li> Setzen Sie Mischung auf dem Magnetstation. Warten, bis die Lösung klar (5 - 10 min). </li><li> Entfernen gelöscht Lösung, während auf der Station mit einer Pipette und entsorgen. Während auf der Station, waschen Perlen durch Pellet mit 70% Ethanol bedeckt und für 1 min inkubiert. Entfernen Ethanol mit Pipette und entsorgen. Wiederholen für insgesamt zwei Waschungen. Hinweis: Die Verwendung genau 70% frisch zubereitet etHANOL ist kritisch, da ein höherer Prozentsatz in ineffizienten Waschen von kleineren Molekülen führen, während &lt;70% Ethanolverlust der Probe 7 führen könnte. </li><li> Halten Sie Platte auf der Station und offen lassen, an der Luft trocknen. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Kügelchen vollständig trocknen lassen, bis Perlen zu knacken beginnen. </li><li> In 55 ul Nuklease-freies Wasser auf die Platte RNA zu eluieren. Entfernen Platte von der Station die Perlen zu mischen und Wasser durch sorgfältiges Pipettieren. Hinweis: Alternativ können Sie auch weniger Wasser (≤ 10 &amp; mgr; l), um die Gesamt-RNA zu konzentrieren. </li><li> Legen Sie die Platte wieder auf die Station. Warten Sie, bis die Lösung mit einer Pipette auf neue Schraubverschluss Rohr für die Langzeitlagerung (-80 ° C) zu übertragen löscht. Platz 5 ul RNA in neue 96-Well-PCR-Platte zur Abreicherung (Schritt. 2.4). </li><li> Optional:. Speichern und verdünnen 1 ul in 19 &amp; mgr; l Wasser (1:20) für qRT-PCR von rRNA (zB 18S, 28S rRNA) (Tabelle 2) und Virusmarker 5 &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 2. Selektive Depletion von ribosomalen und Carrier-RNA aus Viral RNA-Probe (ca. 4 h) <ol><li> Machen Sie 5x Hybridisierung und 10x RNase H Reaktionspuffer und nukleasefreiem Wasser mit linearen Acrylamid Träger , wie in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Set up Hybridisierungsreaktion von RNA mit rRNA Verarmungs Oligos (Tabelle 3) und Oligo (dT) auf Eis in einem 96-Well - PCR - Platte kombiniert , wie in Tabelle 1 beschrieben. Hinweis: Ein Master-Mix hergestellt werden können. 50 Femtogramm (fg) einer einzigartigen synthetischen RNA (ERCCs 8) für die Verfolgung sowohl der viralen Sequenzierung und potenziellen Index gelesen Kreuzkontamination hinzugefügt werden. <ol><li> Vortex sanft und gründlich, dann bei 280 × g bei RT Zentrifuge für 1 min. bei 95 ° C inkubieren für 2 min, langsam erhöhende bis 45 ° C bei -0,1 ° C pro sec. Halten Sie den Thermocycler bei 45 ° C. </li></ol></li><li> Richten Sie RNase H-Reaktionsmischung auf Eis, wie beschreibenVorwärmen d in Tabelle 1, dann bei 45 ° C für 2 min. Hinweis: Ein Master-Mix hergestellt werden können. <ol><li> Fügen Sie die vorgewärmte RNase H-Mix in die Hybridisierungsreaktion in der Platte, während die Platte bei 45 ° C in den Thermocycler zu halten. </li><li> Gut mischen durch vorsichtiges Pipettieren 6 - 8 mal. für weitere 30 min bei 45 ° C inkubieren. Legen Sie auf dem Eis. </li></ol></li><li> Stellen Sie die DNase - Reaktionsmischung auf Eis, wie in Tabelle 1 beschrieben . Hinweis: Ein Master - Mix hergestellt werden können. <ol><li> In der RNase H-Reaktion in der Platte, Wirbel sanft und gründlich, dann bei 280 × g bei RT Zentrifuge für 1 min. für 30 min bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Stopp DNase Reaktion durch Zugabe von 5 ul 0,5 M EDTA. Vortex sanft und gründlich, dann bei 280 × g bei RT Zentrifuge für 1 min. </li></ol></li><li> Cleanup unter Verwendung von RNA-Kügelchen (siehe Schritt 1.3) mit einem 1,8x Volumen (144 ul) Perlen. Eluieren in 11 ul Nuklease-freies Wasser. Hinweis: Für einen sicheren Kaltlagerung, Lager abgereichertem RNA-Proben bei -80 ° C O / N. </li></ol> 3. cDNA Synthesis (~ 6 h) <ol><li> Mix rRNA / Träger-verarmten RNA mit zufälligen Primern auf Eis in einer 96-Well PCR - Platte , wie in Tabelle 1 beschrieben, Wirbel sanft und gründlich, dann bei 280 × g bei RT Zentrifuge für 1 min. <ol><li> Das Gemisch wird auf 70 ° C für 10 min in einem Thermocycler. Unmittelbar nach Hitzedenaturierung, legen Sie die RNA auf Eis für 1 - 5 min. Nicht in die RNA (auch auf Eis) stehen für länger als 5 Minuten vor dem ersten Strang Reaktion. </li></ol></li><li> Erstes Strangsynthese - Reaktionsmischung auf Eis, wie in Tabelle 1 beschrieben. Hinweis: Ein Master-Mix hergestellt werden können. <ol><li> In den RNA / Random-Primer-Mix in der Platte, Wirbel sanft und gründlich, dann bei 280 × g bei RT Zentrifuge für 1 min. Inkubieren bei 22 - 25 ° C für 10 min. </li><li> bei 55 ° C inkubieren für 60 min in einem Luft Inkubator. Legen Sie die Platte auf Eis, um die Reaktion zu beenden. Nichte: Die Verwendung eines Luft-Inkubator wird empfohlen die Glühung Primern während dessen allmähliche Erwärmung der Erststrang-Reaktion zu erzeugen, und der erste Strang zu dehnen beginnt. </li></ol></li><li> Set Zweitstrangsynthese - Reaktionsmischung auf Eis, wie in Tabelle 1 beschrieben. Hinweis: Ein Master-Mix hergestellt werden können. <ol><li> In den ersten Strangsynthesereaktion in der Platte, Wirbel sanft und gründlich, dann bei 280 × g bei RT Zentrifuge für 1 min. Inkubieren für 2 Stunden bei 16 ° C (halten Deckel bei 25 ° C). Lassen Sie nicht die Temperatur über 16 ° C steigen. </li><li> Legen Sie die Platte auf Eis, dann inaktivieren Reaktion durch Zugabe von 5 ul 0,5 M EDTA, vorsichtig mischen und gründlich, dann Zentrifuge bei 280 × g bei RT für 1 min. </li></ol></li><li> Cleanup mit DNA-Kügelchen (Schritt 1.3 für Protokoll sehen) unter Verwendung von 1,8x Volumen (153 ul) von Perlen. Eluieren in 9 &amp; mgr; l Elutionspuffer (EB). Speichern 1 ul für die Quantifizierung. Verwenden Sie 1 ng cDNA für subsequent Schritte. Wenn cDNA-Konzentration zu niedrig ist, zu erfassen, verwenden 4 ul cDNA für tagmentation (siehe Schritt 4.1). </li><li> Für einen sicheren Kaltlagerung, zu speichern doppelsträngige cDNA bei 4 ° CO / N oder -20 ° C zur Langzeitlagerung. </li></ol> 4. Bibliothek Vorbereitung - DNA Library Construction (~ 4 h) <ol><li> Transfer 4 ul cDNA in eine 96-Well-Platte und die verbleibende cDNA für einen zweiten Versuch zu speichern, wenn nötig. </li><li> Stellen Sie die tagmentation Reaktion auf Eis, wie in Tabelle 1 beschrieben. Hinweis: Ein Master-Mix hergestellt werden können. Um Hintergrund und die Gesamtkosten, das Gesamtvolumen der tagmentation Reaktion reduzieren wird von 20 auf 10 &amp; mgr; l reduziert. Wie cDNA der begrenzende Faktor ist, wird die Menge von ATM verwendet (dh transposome) in der Reaktion ebenfalls verringert die Zahl der Integrationsstellen zu verringern. <ol><li> Hinzufügen tagmentation Mischung cDNA in der Platte, vortex sanft und gründlich und Zentrifuge bei 280 xg (bei RT) für 1 min.Inkubieren bei 55 ° C für 5 min Halten bei 10 ° C. </li><li> Nachdem bei 10 ° C, fügen Sie sofort 2,5 ul Neutralize Tagment Buffer (NT), um die Reaktion zu beenden. Mischen durch Pipettieren von oben und unten, dann Zentrifuge bei 280 xg (bei RT) für 1 min. </li><li> 5 min bei RT inkubiert. </li></ol></li><li> Set up PCR Amplifikationsreaktion auf Eis , wie in Tabelle 1 beschrieben. <ol><li> Vortex sanft und gründlich, dann bei 280 × g bei RT Zentrifuge für 1 min. </li><li> Führen PCR auf Thermocycler unter Verwendung der Bedingungen , die in Tabelle 1. Hinweis: 12 PCR-Zyklen werden für 1 ng cDNA tagmented vorgeschlagen; jedoch virale klinischen Proben haben oft nicht nachweisbar Mengen an cDNA. Für geringe Mengen an cDNA (&lt;1 ng), verwenden Sie bis 18 PCR-Zyklen bis genug Bibliothek für die Sequenzierung erstellen. </li></ol></li><li> Bibliothek Vorbereitung - Bereinigung und Bündelung für die Sequenzierung <ol><li> Bringen Probe bis zu 50 &amp; mgr; l mit EB. </li><li> Cleanup mitDNA-Kügelchen (Schritt 1.3 für Protokoll sehen) unter Verwendung von 0,6x Volumen (30 ul) Perlen. Eluieren in 15 ul EB. </li><li> Die Konzentration der Bibliothek (Abbildung 3) durch die Durchführung Bereichsanalyse (150 bis 1.000 bp) mit Bioanalyzer Software 9, ohne Primer - Dimere (~ 120 bp) aus der Region Analyse. Hinweis: Alternativ können qPCR verwendet werden , um Bibliotheken zu quantifizieren 10. </li><li> Pool-Bibliotheken auf der niedrigsten molaren Konzentration von 1 nM oder mehr beträgt. Wenn Bibliothek unter 1 nM ist, fügen Sie ein kleines Volumen von Bibliothek Pool (~ 1x Volumen von anderen Bibliotheken) Sequenzinformationen aus diesen Bibliotheken zu erfassen. </li><li> Cleanup-Pool mit 0,7x DNA Perlen wie oben beschrieben (siehe Schritt 2). Eluieren in 15 ul EB. Hinweis: Volumen der Perlen auf dem endgültigen Volumen des Beckens ab. </li><li> Analysieren Pool 9. Bestimmen Sie molare Konzentration nach Regionen Analyse der Durchführung (150 bis 1.000 bp) 9. Hinweis: Alternativ können qPCR verwendet werden Bibliothek Pool zu quantifizieren 10 &lt;/ Sup&gt;. </li><li> Last - Sequenzer auf 10.00 Uhr Bibliothek Konzentration 101 bp zu erzeugen, gepaart-End liest mit Dual - Barcode 11 liest. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig3.jpg" /> Abbildung 3. Bibliotheken Hergestellt aus Ebola Virus klinischen Proben. Gel - Bild von 4 repräsentativen Ebola - Virus (EBOV) Bibliotheken. Regionen der Bibliothek und der Primer - Dimere werden angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Das skizzierte Ansatz ermöglicht robuste, universelle, schnelle Sequenzierung und wurde zur Sequenzierung von Ebola - Virus während der 2014 Ausbruch 2,4 verwendet. Durch die Kopplung selektive Depletion und cDNA-Synthese mit tagmentation Bibliothekskonstruktion wurde die Gesamtprozesszeit um ~ 2 Tage reduziert von früheren Methoden Adaptorligation. In jüngerer Zeit wurde dieses Protokoll , das von internationalen Mitarbeiter und andere mit großem Erfolg 15,16 und wird eingesetzt , um Labors in Westafrika zu unterstützen lokale Genomik-basierte Studien und Diagnostik 17 eingesetzt. Das hier beschriebene Protokoll verwendet Zufallsprimer cDNA-RNA-seq-Bibliotheken für die virale vorzubereiten. Im Gegensatz zu früheren viralen RNA-seq Ansätze, es erfordert keine a priori Kenntnis von Sequenzdaten oder aufwendige und zeitraubende Primerdesign für einen bestimmten Virus oder Klade. Das Verfahren kann auf jede viral RNA Probe angewendet werden. Beispielsweise wurde es verwendet, viralen Gehalt von sowohl Ebola zu erzeugenund Lassa Proben 6. Das Protokoll kann auch Projekte für Host transkriptomischen, Metagenom und Erreger Entdeckung Sequenzierung 1 verwendet werden. Ein kritischer Schritt des Protokolls wird RNase H Verdau gezielte, ein Hochdurchsatz, kostengünstiges Verfahren zum Entfernen von unerwünschten Träger- und Host-RNA aus viralen Proben. Die selektive Depletion Schritt des Protokolls verwendet viele Komponenten und erfordert Geschicklichkeit und Genauigkeit. Extra-Zeit und Sorgfalt sollte bei der Ersteinrichtung genommen werden. Da die meisten klinischen Serum- und Plasmaproben oft sehr wenig Nukleinsäurematerial aufweisen, sind Verunreinigungen und Probenverlust gemeinsam. Um diese Probleme zu vermeiden, sollten Sie besonders vorsichtig sein, wenn dieses Protokoll verwenden. Zunächst wird RNA sehr anfällig für Degradation; Daher sollten alle Bereiche sauber und frei von Nukleasen sein. Zweitens, um Proben zu identifizieren geeignet für den Einsatz in diesem Protokoll qRT-PCR - Assays für sowohl Wirts - RNA und Virus sollte zur Quantifizierung 5,6 verwendet werden </sup&gt;. Wenn der Eingang Vergleich beträgt mit Sequenzierung ergibt sich aus dem Protokoll, Sequenzierung Erfolg (dh die Erzeugung von genügend Daten für die vollständige virale Montage) korreliert mit Proben , die mindestens 100 pg Gesamt - RNA und 1.000 Kopien des Virus enthalten. Drittens Einwirkung von Umweltquellen von Nukleinsäuren sollten vermieden werden. Das Protokoll hier skizzierte in einem Biosicherheitsschrank für Sicherheitsvorkehrungen durchgeführt und zur Begrenzung der Umweltschadstoffe. Darüber hinaus haben unsere Gruppe und anderen bemerkt , dass kommerzielle Enzyme bakterielle Nukleinsäuren in niedrigen Eingangsproben von verunreinigenden 6,18 eine andere Quelle sein kann. Die Verwendung eines sauberen Arbeitsplatz (zB PCR - Haube, biologische Sicherheit Kabinett) und Negativkontrollen (zB Wasser oder Puffer) wird dazu beitragen , lindern und Verschmutzung zu verfolgen sind. Bei Proben mit &lt;100 pg Gesamt-RNA, nur Poly (rA) Carrier-RNA, nicht rRNA, sollte eine hohe Qualität Sequenzierergebnisse erschöpft sein, um sicherzustellen, während Materialverlust zu begrenzen. Für sehrniedrige Eingangsproben cDNA-Amplifikationsverfahren können 19 besser geeignet sein, obwohl Poly (rA) Träger sollte vor der cDNA - Synthese entfernt werden. Die Abreicherung von Wirts rRNA reichert für virale Gehalt in Sequenzierungsbibliotheken und ist anwendbar auf verschiedene Probensammlungen einschließlich Serum oder Plasma, und mehrere Arten von Gewebe von Nagern und nicht-menschlichen Primaten 5,6. In nicht-menschlichen Organismen, liest Ausrichten zu 28S rRNA nach Erschöpfung blieb, was darauf hindeutet 28S rRNA ist weniger konserviert zwischen Menschen und anderen Spezies 6,20. Bei Verwendung dieser Methode mit nicht-humanen Isolate, kann es notwendig sein , mit DNA - Oligos zu ergänzen , die komplementär zu den divergierenden rRNA - Sequenzen der spezifischen Wirts 3,21. Da das Protokoll unvoreingenommen ist, liest virale nur einen kleinen Bruchteil der gesamten Bibliothek Inhalt darstellen. Obwohl rRNA ist die häufigste Art des Wirts RNA und nur ein kleiner Prozentsatz der rRNA liest (0; 1%) werden nach der selektiven Erschöpfung, alle anderen Wirts - RNA (zB mRNA) bleiben nach Erschöpfung und Konto kann für viele Sequenzierung liest aus der Probe gefunden. Daher &quot;Überabtasten&quot; (dh oversequencing) wird einzelne Bibliotheken benötigt , um für Anrufe virale Montage und Variante genügend Deckung zu haben. Für unsere Studien versuchen wir zu Folge ~ 20 Millionen liest pro Probe 2,5 ausreichende Tiefe für die Analyse von viralen genomischen und die damit verbundenen Varianten sowie metagenomic Inhalt zu haben. Für metagenomic und Studien Entdeckung pathogen ist es wichtig, dass kontaminierende Wirts-DNA zu beachten, durch DNase-Verdau entfernt. Daher Viren und andere Pathogene, die DNA-Genome enthalten kann während des Prozesses jedoch RNA Zwischenprodukte können noch sequenzierenden verloren.

Next Generation Sequenzierung von Viren aus klinischen Quellen kann die Übertragung und die Epidemiologie von Infektionen informieren, sowie dazu beitragen, Unterstützung neuer diagnostischer, Impfstoff und therapeutische Entwicklung. cDNA - Synthese unter Verwendung von Zufallsprimer hat den Nachweis und die Montage von Genomen von divergent, Coinfizierung oder auch neuartige Viren 1,2 erlaubt. Wie bei anderen unvoreingenommene Methoden, besetzen unerwünschte Verunreinigungen viele Sequenzierung liest und negativ Sequenzierungsergebnisse auswirken. Host-und Poly (rA) Carrier-RNA sind Verunreinigungen, die in vielen bestehenden viralen Musterkollektionen. Das Protokoll beschreibt eine effiziente und kostengünstige Möglichkeit der tiefen Sequenzierung Genomen RNA Virus basiert auf unvoreingenommene total RNA-seq. Das Verfahren nutzt eine RNase H selektive Depletion Schritt 3 unerwünschte Wirt ribosomalen und Carrier - RNA zu entfernen. Selektive Depletion reichert für virale Gehalt (Abbildung 1) und verbessert die Gesamtqualität der Sequenzierungsdaten(Abbildung 2) aus klinischen Proben. Außerdem wird tagmentation dem Protokoll angewendet, wie es deutlich Bibliothek Bauzeit reduziert. Diese Methoden wurden verwendet , um schnell große Datenmengen von Ebola und Lassa - Virus - Genome 2,4,5 erzeugen und kann verwendet werden , um ein breites Spektrum von RNA - Viren zu untersuchen. Schließlich wird der Ansatz nicht auf menschlichen Proben beschränkt; Die Nützlichkeit der selektive Depletion wurde auf Gewebeproben von Lassa-infizierte Nager und nicht-menschlichen Primaten - Krankheitsmodellen 5,6 gesammelt gezeigt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Gesamt - RNA Inhalt Reflektiert Anreicherung von Lassa - Virus von Inhalt mit Selective Depletion. Beginnend Gesamtinhalt (RNA - Eingang) und Anreicherung von einzigartigen Lassa - Virus (LASV) liest (Library Inhalt) auf rRNA Depletion von neun verschiedenen klinischen Isolaten. Diese Zahl wurde von 6 geändert <em&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig2.jpg" /> Abbildung 2. Höhere Qualität Sequenzierung Nach Carrier - RNA Depletion. Median Basisqualitäten pro Sequenzierzyklus von Poly (rA) -contaminated Bibliotheken Lassa - Virus (rot) und Kontrolle (kein Träger in der Bibliothek beobachtet, schwarz) von QC - Bericht 13. Beide lesen 1 und 2 gelesen gepaarter Ende liest in der Bibliothek BAM-Datei zusammengefügt und die Qualitätswerte werden an jeder Basis gezeigt. Diese Zahl hat sich von 6 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Die virale RNA-seq Protokoll Details Bau von Bibliotheken direkt aus extrahiertenRNA gesammelt aus klinischen und biologischen Proben. Um sicherzustellen, dass die persönliche Sicherheit, alle viralen Serum, Plasma und Gewebeproben sollten in geeigneten Puffern vor der RNA-Extraktion inaktiviert werden. In einigen Inaktivierung und Extraktion-Kits, Träger Poly (rA) RNA ist im Preis inbegriffen; Dies wird während der anfänglichen RNase H selektive Depletion Schritt entfernt werden. Basierend auf vollständige Genesung, ist die erwartete Konzentration von Carrier-RNA 100 ng / ul. In dem Protokoll, 110 ng / &amp; mgr; l Oligo-dT-RNA (1.1x Ladungsträgerkonzentration), zur Abreicherung eingesetzt. Wenn Poly (rA) Träger nicht in der Probe vorhanden ist, dann Oligo (dT) nicht hinzugefügt, um Erschöpfung vor werden. Das folgende Protokoll wird für 24 Reaktionen in PCR-Plattenformat ausgelegt (bis zu 250 &amp; mgr; l Volumen). Eine frühere Version dieses Protokolls wurde in Matranga, et al. 6.

<table><tbody><tr><td>96-Well-PCR-Platten</td><td>VWR</td><td>47743-953</td><td></td></tr><tr><td>Streifen mit acht Kappen</td><td>VWR</td><td>47745-512</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>50-ml-Flasche</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>Post-RNA-Extraktionsschritt, 2 U/&micro; l, Puffer inklusive</td></tr><tr><td>PCR-Cycler</td><td></td><td></td><td>beliebige PCR-Cycler&nbsp;</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP SPRI-Kügelchen&nbsp;</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63987</td><td>Beads für die RNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Echtzeit-qPCR-System</td><td></td><td></td><td>für jedes System</td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>70 % Ethanol</td><td></td><td></td><td>zur Vorbereitung frischer</td></tr><tr><td>qRT-PCR-Primer</td><td>IDT-DNA</td><td></td><td>siehe Tabelle 2</strong</td></tr><tr><td>>5 M NaCl&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7,4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2663-1L</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7,5&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Lineares Acrylamid</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM9520</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Oligos, die die gesamte rRNA-Region</td><td>abdecken IDT-DNA</td><td></td><td>siehe Tabelle 3, bestellen Sie laborbereit bei 100 & micro; M</td></tr><tr><td>Oligo (dT)</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>40 nt lang, entsalzt</td></tr><tr><td>Hybridase Thermostabile RNase H&nbsp;</td><td>Epicentre</td><td>H39100</td><td></td></tr><tr><td>RNase-freies DNase-Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In-RNase-Inhibitor Ambion</td><td></td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>zufällige Primer</td> nach selektivem Depletionsschritt<td>Invitrogen</td><td>48190-011</td><td>hauptsächlich Hexamere</td></tr><tr><td>10 mM dNTP-Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transkriptase&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-093</td><td>mit Erststrangpuffer, DTT-Luftinkubator</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>, <td>beliebiger Luftinkubator, Cycler&nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Zweitstrangsynthese (dNTP-frei) Reaktionspuffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B6117S</td><td>10x</td></tr><tr><td>E. coli DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0205L 10</td><td>U/&mu; l</td></tr><tr><td>E. coli DNA-Polymerase I&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0209L</td><td>10 U/&mu; l</td></tr><tr><td>E. coli RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0297L 2</td><td>U/&mu; l</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP SPRI-Kügelchen</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td>Kügelchen für die DNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Elutionspuffer&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>10 mM Tris HCl, pH 8,5</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS Assay Kit&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA-Probenvorbereitungskit&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA-Index-Kit&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2965AA</td><td></td></tr><tr><td>hohe Empfindlichkeit D1000 Reagenzien</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>hohe Empfindlichkeit D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer 2100&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td> hochempfindliche DNA-Reagenzien <td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Library Quantification Complete Kit (Universal)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>Alternative zur Tapestation, Bioanalysator für die Quantifizierung von Bibliotheken</td></tr></tbody></table>

unvoreingenommene tiefe sequenzierung von rna-viren aus klinischen proben

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Hier beschreiben wir eine Next-Generation - RNA - Sequenzierung Protokoll , das de novo Assemblierung und intra-Host - Variante Anrufe von viralen Genomen von klinischen und biologischen Quellen gesammelt werden können. Die Methode ist unvoreingenommen und universell; es verwendet zufällige Primer für die cDNA-Synthese und erfordert keine vorherige Kenntnis der viralen Sequenz Gehalt. Vor dem Aufbau der Bibliothek, selektive RNase H-basierte Verdauung wird verwendet, um unerwünschte RNA zu führen - einschließlich Poly (rA) Träger und ribosomale RNA - von der viralen RNA-Probe. Selective Depletion verbessert sowohl die Datenqualität und die Anzahl der eindeutigen liest in der viralen RNA-Sequenzierung Bibliotheken. Darüber hinaus ist ein Transposase-basierten &#39;tagmentation&#39; Schritt wird in dem Protokoll verwendet wird, wie es allgemeine Bibliothek Bauzeit reduziert. Das Protokoll hat eine rasante tiefe Sequenzierung von mehr als 600 Lassa und Ebola-Virusproben-Sammlungen einschließlich aktiviert sowohl von Blut und Gewebe isoliert-und ist im Großen und Ganzen auf andere mikrobielle Genomstudien.

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Erzeugung von qualitativ hochwertigen Sequenzierung liest aus Low-Input-Virus-RNA-Proben, während für einzigartige virale Inhalte zu bereichern. Wie in Abbildung 1 gezeigt, angereichert das Protokoll einzigartige Inhalte Lassa - Virus mindestens fünffach in allen Proben ( im Vergleich zu nicht-verarmte Kontrollen) mit mindestens einer Million Kopien von 18S rRNA (~ 100 pg Gesamt - RNA). Ebenso Sequenzierungs Erfolg auch mit der Menge des Virus in einer gegebenen Probe korreliert. Verwendung qRT-PCR als Surrogat für die Virusmenge, die Proben enthielten ~ 1.000 oder mehr viralen Genomkopien meist vollständige Baugruppen erstellt (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus Abreicherung von Poly (rA) Träger reduziert Homopolymer - Sequenzen A und T in Bibliotheken, in sauberer Vorbereitungen resultierende und eine bessere Qualität Sequenzierung sichergestellt liest (Abbildung 2). Endgültige Bibliotheken von extensiven viralen klinischen Proben haben oft ein breites Fragment Länge von 150 bis 1000 bp(Abbildung 3). Nach der Sequenzierung Probe misidentification und Übersprechens zwischen Bibliotheken innerhalb eines Pools 12, nur Index liest mit einer Basisqualitätsfaktor von 25 (q25) und sicherzustellen , Null - Fehlpaarungen gehalten werden während des Demultiplexprozess zu reduzieren. Virale Genome werden mit einer Bioinformatik Pipeline spezifisch für divergent Viren 2,4-6 montiert. Diese Werkzeuge sind in https://github.com/broadinstitute/viral-ngs oder durch kommerzielle Cloud - Plattformen 4. <table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Schritt 1.1: DNase Reaktion </td><td></td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> 10x DNase Puffer </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Heraus viralen RNA </td><td> 55 </td></tr><tr><td> DNase (2 U / &amp; #181; l) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Volle Lautstärke </td><td> 70 </td></tr><tr><td> Schritt 2.1: 5x Hybridisierungspuffer </td><td></td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Volume 1 ml (ul) </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl (pH 7,4) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Volle Lautstärke </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> Schritt 2.1: 10x RNase H - Reaktionspuffer </td><td></td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Volume 1 ml (ul) </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl (pH 7,5) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Volle Lautstärke </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> Schritt 2.1: Wasser wi-ten linearen Acrylamid </td><td></td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Volume 1 ml Puffer (ul) </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 992 </td></tr><tr><td> Lineares Acrylamid (5 mg / ml) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Volle Lautstärke </td><td> 1000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Schritt 2.2: Hybridisierungsreaktion für die selektive Depletion </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> 5x Hybridisierungspuffer </td><td> 2 </td></tr><tr><td> rRNA-Depletion oligo-Mix (100 uM) </td><td> 1,22 </td></tr><tr><td> Oligo (d) T (550 ng / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DNase-behandelte Gesamt-RNA </td><td> bis zu 5 </td></tr><tr><td> Spike-in-RNA (Dies ist optional) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Wasser (mit linearen acrylamid) </td><td> bringen bis zu 10 Gesamt </td></tr><tr><td> insgesamt Volumich </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Schritt 2.3: RNase H - Reaktion für die selektive Depletion </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> 10x RNase H Reaction Buffer </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Wasser (mit linearen acrylamid) </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Thermostabile RNase H (5 U / ul) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Volle Lautstärke </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Schritt 2.4: DNase Reaktion Post selektive Depletion </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> 10x DNase Buffer </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Wasser (mit linearen acrylamid) </td><td> 44.5 </td></tr><tr><td> RNase-Inhibitor (20 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> RNase-freie DNase I (2,72 U / ul) </td><td> 2 </td></tr&gt; <tr><td> Das Gesamtvolumen (mit RNase H-Reaktion) </td><td> 75 </td></tr><tr><td colspan="2"> Schritt 3.1: cDNA - Synthese, Random - Primer - Hybridisierung </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> rRNA / Träger-verarmten RNA </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3 ug Zufallsprimer </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Volle Lautstärke </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Schritt 3.2: Der erste Strang der cDNA - Synthesereaktion </td><td></td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Volumen (ul) </td></tr><tr><td> 5x First Strand Reaction Buffer </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 0,1 M DTT </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP mix </td><td> 1 </td></tr><tr><td> RNase-Inhibitor (20 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Reverse-Transkriptase (hinzufügen letzte) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Das Gesamtvolumen (mit RNA oben) &lt;/ Td&gt; <td> 20 </td></tr><tr><td colspan="2"> Schritt 3.3: Zweiter Strang cDNA - Synthesereaktion </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Volumen (ul) </td></tr><tr><td> RNase-freies Wasser </td><td> 43 </td></tr><tr><td> 10x Second-Strand Reaction Buffer </td><td> 8 </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP mix </td><td> 3 </td></tr><tr><td> E. coli DNA - Ligase (10 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> E. coli DNA Polymerase I (10 U / ul) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> E. coli RNase H (2 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Das Gesamtvolumen (mit 1. Strang - Reaktion) </td><td> 80 </td></tr><tr><td> Schritt 4.2: Tagmentation Reaktion </td><td></td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Volumen (ul) </td></tr><tr><td> Amplicon Tagment Mix (ATM) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tagment DNA-Puffer (TD) </td&gt; <td> 5 </td></tr><tr><td> Das Gesamtvolumen (mit cDNA) </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Schritt 4.3: Bibliothek PCR - Reaktion </td><td></td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Volumen (ul) </td></tr><tr><td> PCR Master Mix (NPM) </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Index 1 Primer (i7) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Index 2 Primer (i5) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Das Gesamtvolumen (mit tagmented cDNA) </td><td> 25 </td></tr><tr><td> Schritt 4.3.2: Bibliothek PCR - Bedingungen </td><td></td></tr><tr><td> 72 ° C, 3 min </td><td></td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 sec </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> bis zu 18 Zyklen-10 sec bei 95 ° C, 30 sec bei 55 ° C, 30 sec bei 72 ° C </td></tr><tr><td> 72 ° C, 5 min </td><td></td></tr><tr><td> 10 ° C, für immer </td><td></td></tr></tbody></table>Tabelle 1:. Reaction Set-up und Puffer Schritt- für -Schritt - Tabellen mit Inhalten aller Puffer und Reaktionsmischungen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Oligo - Name </td><td> Sequenz (5 &#39;bis 3&#39;) </td></tr><tr><td> Ebola KGH FW </td><td> GTCGTTCCAACAATCGAGCG </td></tr><tr><td> Ebola KGH RV </td><td> CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT </td></tr><tr><td> Ebola kulesh FW </td><td> TCTGACATGGATTACCACAAGATC </td></tr><tr><td> Ebola kulesh RV </td><td> GGATGACTCTTTGCCGAACAATC </td></tr><tr><td> Lassa SL FW </td><td> GTA AGC CCA GCD GYA AAB CC </td></tr><tr><td> Lassa SL RV </td><td> AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A </td></tr><tr><td> 18S rRNA FW </td><td> TCCTTTAACGAGGATCCATTGG </td></tr><tr><td> 18S rRNA RV </td><td> CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT </td></tr></tbody></tLage&gt; Tabelle 2: qRT-PCR - Primer - Sequenzen Primer für die Messung Host (18S rRNA) und virale (Ebola und Lassa) Inhalt.. &quot;KGH&quot; ist Kenema Regierungskrankenhaus in Sierra Leone, wo die Ebola - Primer 2 getestet wurden. &#39;Kulesh&#39; ist der Ermittler, der Primer 14 gesetzt entworfen. Tabelle 3: ribosomale RNA (rRNA) Depletion Oligos 195 50 Nukleotide lange Sequenzen , die komplementär zu menschlicher rRNA für die selektive Depletion Schritt 6.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/Table_3.xlsx" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/Table_3.xlsx" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und breit anwendbare Methode zur unvoreingenommenen RNA-Sequenzierung von Virusproben aus menschlichen klinischen Isolaten.

Unvoreingenommene Tiefe Sequenzierung von RNA-Viren aus klinischen Proben

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Sequenzierbibliotheken von RNA-Viren direkt aus klinischen Proben herzustellen, um virale Überwachung und evolutionäre Untersuchungen zu ermöglichen. Diese Methode kann zentrale Fragen in den Bereichen der viralen Genomik und Evolution beantworten, beispielsweise wie sich RNA-Viren innerhalb und zwischen Wirten verändern und wie sie sich in einer Population ausbreiten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie unvoreingenommen ist.Es erfordert keine vorherige Kenntnis der viralen Sequenz für die Bibliotheksherstellung und kann verwendet werden, um jedes Virus zu sequenzieren. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Detektion und Bekämpfung viraler Erkrankungen wie dem Lassafieber, da die Diagnostika und Therapeutika, die wir entwickeln, grundlegend auf der Genomsequenz des Virus beruhen. Die Demonstration der selektiven Anreicherung wird Adrianne Gladden durchführen.Die cDNA-Synthese wird Sarah Winnicki demonstrieren. Die Konstruktion der DNA-Bibliothek wird Dolo Nosamiefan demonstrieren. Bereiten Sie zunächst einen 5× Hybridisierungs- und einen 10× RNase-H-Reaktionspuffer in nukleasefreiem Wasser unter Zugabe von linearem Acrylamid-Träger wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben vor.In einer 96-Loch-PCR-Platte in einem Metallblock auf Eis setzen Sie die Hybridisierungsreaktion zusammen, indem Sie zuvor extrahierte und mit DNase behandelte virale RNA sowie Oligos zur Ausschaltung ribosomaler RNA und Oligo(dT)s miteinander vermischen. Beachten Sie, dass alle Reaktionen in diesem Protokoll vorbereitet und in Streifenröhren verteilt werden, um sie mit einer Mehrkanalpipette zu verwenden. Vorsichtig und gründlich vortexen, anschließend eine Minute bei 280 × g und Raumtemperatur zentrifugieren.Ansäuern bei 95 Grad Celsius für zwei Minuten, dann langsam auf 45 Grad Celsius mit minus 0,1 Grad Celsius pro Sekunde absenken. Anschließend den Thermocycler bei 45 Grad Celsius anhalten. Bereiten Sie eine RNase-H-Reaktionsmischung in einem Metallblock auf Eis vor und erwärmen Sie die Lösung anschließend zwei Minuten lang auf 45 Grad Celsius vor.Während die 96-Loch-Platte sich weiterhin im Thermocycler bei 45 Grad Celsius befindet, die vorgewärmte RNase-H-Mischung zur Hybridisierungsreaktion hinzufügen. Vorsichtig sechs bis acht Mal pipettieren, um gut zu vermischen, dann 30 Minuten bei 45 Grad Celsius inkubieren, bevor die Probe auf Eis gestellt wird. Danach die DNase-Reaktionsmischung in einem Metallblock auf Eis vorbereiten, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben.Geben Sie die Mischung zur RNase-H-Reaktion in der Platte hinzu. Vorsichtig und gründlich wirbeln, dann eine Minute bei 280 × g und Raumtemperatur zentrifugieren. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und geben Sie anschließend fünf Mikroliter 0,5-molarer EDTA zu, um die Reaktion zu stoppen.Nachdem die Platte vorsichtig und gründlich verwirbelt wurde, zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 280 × g und Raumtemperatur. Verwenden Sie laut Herstellerempfehlung ein 1,8-faches Volumen an RNA-Beads, um die Reaktion aufzubereiten, und eluieren Sie in 11 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Lagern Sie die abgereicherten RNA-Proben über Nacht bei minus 80 Grad Celsius.Besondere Vorsicht ist in diesem Schritt erforderlich, da ein Verlust oder eine Zersetzung der Probe auftreten könnte. Für die cDNA-Synthese mischen Sie in einer 96-Loch-PCR-Platte in einer Metallhalterung auf Eis das ribosomale RNA-Träger-depletierte RNA gemäß dem Textprotokoll mit zufälligen Primern. Nach vorsichtigem Vortexen und Zentrifugieren der Platte erhitzen Sie die Mischung im Thermocycler auf 70 Grad Celsius für zehn Minuten.Stellen Sie die RNA unmittelbar nach der Hitzedenaturierung für eine bis fünf Minuten in einen Metallblock auf Eis. Fügen Sie anschließend, nachdem Sie die Reaktionsmischung für die Synthese des ersten Strangs vorbereitet haben, diese zur RNA-Zufallsprimermischung in der Platte hinzu. Danach, nach dem Wirbeln und Zentrifugieren, inkubieren Sie für zehn Minuten bei 22 bis 25 Grad Celsius.Die Platte 60 Minuten lang bei 55 Grad Celsius in einem Luftinkubator inkubieren. Anschließend die Platte zur Beendigung der Reaktion auf einen Metallblock auf Eis stellen. Danach die Mischung für die Synthese des zweiten Strangs herstellen und sie zur Synthese des ersten Strangs in der Platte hinzufügen.Nach dem Vortexen und Zentrifugieren wie zuvor inkubieren Sie die Reaktion zwei Stunden lang bei 16 Grad Celsius. Stellen Sie die Platte in einen Metallblock auf Eis und inaktivieren Sie die Reaktion durch Zugabe von fünf Mikrolitern 0,5 M EDTA, anschließend mischen und wie zuvor zentrifugieren. Reinigen Sie die Reaktion mit einem 1,8fachen Volumen DNA-Beads und eluieren Sie die Proben mit neun Mikrolitern Elutionspuffer oder EB.Ein Mikroliter zur Quantifizierung beiseitelegen. Zum sicheren Kühlen doppelsträngige cDNA über Nacht bei 4 Grad Celsius oder langfristig bei minus 20 Grad Celsius lagern. Um eine DNA-Bibliothek zu erstellen, vier Mikroliter cDNA in eine 96-Loch-Platte überführen und die verbleibende cDNA aufbewahren, um bei Bedarf einen zweiten Nachweisversuch durchführen zu können.Während der Arbeit mit einem Metallblock auf Eis richten Sie die Tagmentierungsreaktion wie in Tabelle eins des Textprotokolls beschrieben ein. Geben Sie dann die Mischung zum cDNA in der 96-Loch-Platte hinzu. Nach dem Vortexen und Zentrifugieren inkubieren Sie die Platte 5 Minuten bei 55 Grad Celsius und lagern Sie anschließend bei 10 Grad Celsius.Wenn die Probe 10 Grad Celsius erreicht hat, sofort 2,5 Mikroliter neutralisiertes Tagmentpuffer hinzufügen, um die Reaktion zu beenden. Nach dem Zentrifugieren der Platte bei 280 × g und Raumtemperatur für eine Minute fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nun die PCR-Amplifikationsreaktion wie im Textprotokoll beschrieben in einem Metallblock auf Eis vorbereiten.Nach dem Vortexen und Zentrifugieren der Platte die PCR durchführen. Um die Bibliothek vorzubereiten, die Proben mit EB auf 50 Mikroliter auffüllen. Mit einem 0,6fachen Volumen DNA-Beads die Reaktion aufreinigen und in 15 Mikroliter EB eluieren. Die Bibliotheken in der niedrigsten molaren Konzentration von mindestens einem Nanomolar zusammenführen.Falls die Bibliothek unter einem Nanomolar liegt, geben Sie ein kleines Volumen der Bibliothek zum Pool hinzu. Reinigen Sie den Pool abschließend mit einem 0,7fachen Volumen DNA-Beheln, wie zuvor im Video beschrieben, und eluieren Sie die Proben mit 15 Mikrolitern EB. Analysieren Sie gemäß dem Textprotokoll.Wie hier gezeigt, bereicherte das in diesem Video beschriebene Protokoll einzigartige Lassa-Virus-Inhalte in allen Proben mit mindestens einer Million Kopien der 18S ribosomalen RNA um mindestens den Faktor fünf. Dieses Diagramm veranschaulicht, dass die Depletion des Poly(rA)-Trägers homopolymere Sequenzen aus A und T in den Bibliotheken reduziert, was zu saubereren Präparationen führt und bessere Sequenzierungsreads von höherer Qualität gewährleistet. Schließlich zeigt diese Abbildung, dass die finalen Bibliotheken aus klinischen Virusproben mit geringer Inputmenge oft ein breites Fragmentmuster von 150 bis 1000 Basenpaaren aufweisen.Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von drei Tagen durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die meisten klinischen Proben nur sehr geringe Mengen an Nukleinsäurematerial enthalten. Daher sind Probenverlust, Kontamination und RNA-Abbau häufig.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie RNA-Seq angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise wie der Wirt auf eine Virusinfektion reagiert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Virusüberwachung den Weg, um Übertragungswege von Viren wie Ebola und Lassa sowie anderer zirkulierender Erreger in Westafrika nachzuvollziehen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Sequenzierbibliotheken von RNA-Viren direkt aus klinischen Proben herstellt, was Virusüberwachung und evolutionäre Studien ermöglicht.Es darf nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit viralen Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung und die Einhaltung der Vorschriften der jeweiligen Sicherheitsstufe im Biosicherheitslabor sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Forschung

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Medizin

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Hier präsentieren wir einen neuen Ansatz zur Identifizierung von Pflanzenviren mit Doppel-Strang DNA Genom. Wir verwenden standard-Methoden zu extrahieren von DNA und RNA aus den infizierten Blättern und Next Generation Sequencing durchzuführen. Bioinformatische Werkzeuge montieren Sequenzen in Contigs, Contigs Vertretung Virus Genome zu identifizieren und Genome taxonomischen Gruppen zuweisen.

Kombination von Analyse von DNA in eine grobe Virion-Extraktion mit der Analyse der RNA aus den infizierten Blättern, entdecken neue Virus-Genom

Die Nanopore-Sequenzierung ist eine neuartige Technologie, die eine kostengünstige Sequenzierung an entfernten Orten und ressourcenarmen Umgebungen ermöglicht. Hier stellen wir ein Protokoll zur Sequenzierung von mRNAs aus Vollblut vor, das mit solchen Bedingungen kompatibel ist.

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Zuvor haben wir ein Protokoll für die Sequenzierung des Amplikon-basierten Ganzgenoms Usutu Virus (USUV) auf einer Nanoporensequenzierungsplattform validiert. Hier beschreiben wir die verwendeten Methoden genauer und bestimmen die Fehlerrate der Nanoporen-R10-Durchflusszelle.

Validierung der Nanoporensequenzierung des gesamten Genoms anhand des Usutu-Virus als Beispiel

Ein Citizen-Science-Projekt wurde entwickelt, um Einwohner von San Diego zu rekrutieren, um Umweltproben für SARS-CoV-2 zu sammeln. Für die Datenübermittlung über eine benutzerfreundliche Oberfläche für mobile Geräte wurde eine mehrsprachige webbasierte Plattform geschaffen. Ein Laborinformationsmanagementsystem erleichterte die Entnahme von Tausenden von geografisch unterschiedlichen Proben mit Echtzeit-Ergebnisverfolgung.

Swabbing the Urban Environment - Eine Pipeline zur Probenahme und zum Nachweis von SARS-CoV-2 aus Umweltreservoirs

Dieses Protokoll zielt darauf ab, SARS-CoV-2-RNA in Abwasser- und Luftproben zu quantifizieren, um sie für abwasserbasierte epidemiologische Studien zu verwenden und das Expositionsrisiko gegenüber SARS-CoV-2 in Aerosolen in Innen- und Außenbereichen zu bewerten. Dieses Protokoll beschreibt auch einen gekachelten Amplikon-Long-Template-Sequenzierungsansatz für die Charakterisierung des gesamten SARS-CoV-2-Genoms.

Quantifizierung und Charakterisierung des gesamten Genoms von SARS-CoV-2-RNA in Abwasser- und Luftproben

Hier stellen wir einen schnellen und kostengünstigen Workflow zur Charakterisierung von Tollwutvirusgenomen (RABV) mit Hilfe der Nanoporentechnologie vor. Der Arbeitsablauf soll die genomikgestützte Überwachung auf lokaler Ebene unterstützen und Informationen über zirkulierende RABV-Linien und deren Einordnung in regionale Phylogenien liefern, um Maßnahmen zur Tollwutbekämpfung zu steuern.

Sequenzierung des gesamten Genoms zur schnellen Charakterisierung des Tollwutvirus mittels Nanoporentechnologie

Die absolute Quantifizierung der RNA-Sequenzierung (AQRNA-seq) ist eine Technologie, die entwickelt wurde, um die Landschaft aller kleinen RNAs in biologischen Gemischen zu quantifizieren. Hier werden sowohl die Bibliotheksvorbereitung als auch die Datenverarbeitungsschritte von AQRNA-seq demonstriert, wobei Veränderungen im Transfer-RNA (tRNA)-Pool in Mycobacterium bovis BCG während der hungerinduzierten Dormanzphase quantifiziert werden.

AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs

Dieses Protokoll demonstriert den Echtzeit-Assay für die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) des Pan-Lyssavirus LN34 von der Gewebeentnahme bis zur Ergebnisinterpretation, einschließlich Aktualisierungen von Primersequenzen und Formulierungen zur Verbesserung der Assay-Leistung für einige Nicht-Tollwut-Lyssaviren und Hasentiere. Wir demonstrieren auch den Assay-Aufbau für ein Single-Well-LN34-Multiplexformat (LN34M).

Postmortale Diagnose von Tollwut bei Tieren mit dem aktualisierten, multiplexierten LN34 Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionsassay

Lernen Sie eine unvoreingenommene RNA-Sequenzierungsmethode für virale Genomik aus klinischen Proben. Dieses Protokoll ermöglicht die de novo Assemblierung von Lassa- und Ebolaviren ohne Vorwissen über Sequenzen.

Unvoreingenommene Tiefe Sequenzierung von RNA-Viren aus klinischen Proben

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