Synthese von Wavelength-Verschiebung DNA Hybridisierungssonden durch Verwendung von Photostabile Cyaninfarbstoffe

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, den Energietransfer von einem farbstoffmodifizierten DNA-Strang zu einem anderen zu visualisieren. Diese Methode kann bei den Schlüsselfragen der Molekularbiologie helfen. Wie zum Beispiel RNA-Interferenz durch Überwachung der siRNA-Prozessierung und -Integrität in lebenden Zellen in Echtzeit.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist die einfache Überwachung der Blütenreichweite und der Farbveränderung, was zu einem klaren Ergebnis führt. Falsch positive Ergebnisse werden also eliminiert. Zu Beginn dieses Verfahrens werden die entsprechenden Reagenzien, wie im Textprotokoll angegeben, in einen 20-Milliliter-Rundkolben gegeben, der mit einem magnetischen Rührstab und einem Rückflusskondensator ausgestattet ist.

Fügen Sie dann sechs Milliliter Piperidin hinzu. Und erhitzen Sie das Reaktionsgemisch vier Stunden lang auf 80 Grad Celsius. Nachdem die Reaktion auf Raumtemperatur abgekühlt ist, wird der resultierende Niederschlag durch Filtration aufgefangen.

Und dreimal mit Diethylether waschen. Geben Sie anschließend einhundert Milliliter Diethylether in den Überstand. Und sammeln Sie den entstehenden Niederschlag durch Filtration.

Nach dreimaligem Waschen mit Diethylether wird der Niederschlag mit dem isolierten Feststoff aus der ersten Filtration kombiniert. Geben Sie mit dem Computer, der mit einem DNA-Synthesizer verbunden ist, die gewünschte DNA-Sequenz und die Kopplungsmethode ein. Befolgen Sie die Anweisungen aus dem Protokoll des Herstellers.

Als nächstes montieren Sie die Säule mit dem kontrollierten Gießglas, das mit einem Mikromol der ersten Fläche modifiziert wird, in den Synthesizer. Starten Sie nun die Synthese auf dem DNA-Synthesizer. Nach der Aufarbeitung der DNA-Stränge werden die entsprechenden Regenten, wie im Textprotokoll angegeben, zu der diethylierten, alkinmodifizierten DNA-Probe hinzugefügt.

Inkubieren Sie die Probe bei 60 Grad Celsius für einen Punkt fünf Stunden. Übertragen Sie dann die Probe in ein 10-Milliliter-Röhrchen. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur 150 Mikroliter einer fünfmolaren EDTA-Dinatriumsalzlösung von null Komma null und 450 Mikroliter einer null komma drei molaren Natriumacetatlösung zur DNA-Probe hinzufügen.

Geben Sie anschließend 10 Milliliter Ethanol in die Probe. Und halten Sie es 16 Stunden lang bei minus 32 Grad Celsius. Als nächstes zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei dem Tausendfachen G. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie den Überstand.

Waschen Sie das resultierende DNA-Pellet mit zwei Millilitern kaltem 80%igem Ethanol. Trocknen Sie dann das Pellet unter reduziertem Druck mit einem Gefriertrockner. Reinigen Sie das rohe DNA-Pellet mit HP LC.Überwachen Sie den Lauf, indem Sie 260 Nanometer und 459 Nanometer für Dye One überprüfen.

Oder 542 Nanometer für Dye two. Sammeln Sie die Fraktionen, die in beiden Wellenlängenkanälen eine Absorption aufweisen. Bei Einzelstrangabsorptionsspektroskopie-Messungen ist eine Blindmessung mit nur 200 Millimolar Natriumchlorid und 50 Millimolar Natriumphosphatpuffer zu erfassen.

Übertragen Sie anschließend die zuvor vorbereitete DNA1-Lösung in eine ein Zentimeter große Quarzglasküvette. Notieren Sie die Absorption. Bestimmen Sie dann den maximalen Wert der Farbstoffabsorption.

Für Einzelstrang-Fluoreszenzspektroskopie-Messungen ist eine Blindmessung mit nur 200 Millimolar Natriumchlorid und 50 Millimolar Natriumphosphat unter Verwendung der Anregungswellenlänge von Dye one zu erfassen. Legen Sie anschließend die Küvette mit der DNA1-Lösung in das Spektrometer. Zeichnen Sie das Blütenspektrum auf.

Um die Doppelstrang-Fluoreszenzspektroskopie-Messung durchzuführen, legen Sie die Küvette mit dem Doppelstrang aus DNA1 und DNA2-Lösung in das Spektrometer. Nehmen Sie dann das Fluoreszenzspektrum mit der Anregungswellenlänge von Dye one auf. Um ein besseres Verständnis dafür zu erhalten, was die aufgezeichneten Spektren zeigen, bestrahlen Sie die Küvetten mit tragbaren UV-Lampen.

Beobachten Sie die Veränderung der Blütenfarbe von der einzel- zur doppelsträngigen DNA. Die aufgezeichneten Absorptionsspektren zeigen die Maxima bei 465 Nanometern für einzelsträngige DNA1 und 546 Nanometern für einzelsträngige DNA2. Der geglühte Doppelstrang von DNA1 und DNA2 zeigt Maxima sowohl bei 469 als auch bei 567 Nanometern.

Beide Absorptionsmaxima zeigen eine bathaohromische Verschiebung. Und kleinste spektroskopische Veränderungen sind das Ergebnis exzitonischer Wechselwirkungen zwischen den Farbstoffen innerhalb der doppelhelikalen DNA-Architektur. Die entsprechenden Fluoreszenzspektren weisen für einzelsträngige DNA1 Maxima bei 537 Nanometern auf.

Bei 607 Nanometern für einzelsträngige DNA2. Und bei 615 Nanometern für geglühte Doppelstränge von DNA1 und DNA2. Doppelsträngig von DNA1 und DNA2, zeigt nur das Emissionsmaximum von Farbstoff zwei, obwohl Farbstoff eins selektiv angeregt wird, was beweist, dass der Energietransfer effizient von Farbstoff eins zu Farbstoff zwei erfolgt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man DNA durch eine paarweise katalytische Reaktion eines alkinmarkierten DNA-Strangs mit einer A-Seite nachsynthetisch modifiziert