Prävention von Hitzestress Unerwünschte Wirkungen bei Ratten durch Bacillus subtilis Dehnungs

Wir haben ein Protokoll zur Vorbeugung von Hitzestresseffekten bei Ratten durch orale Vorbehandlung mit nützlichen Bakterien beschrieben. Dieses Protokoll kann modifiziert und für verschiedene Verabreichungswege und für die Analyse verschiedener Verbindungen verwendet werden.

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die präventive Wirkung des B.subtilis BSB3-Stammes gegen Komplikationen nach Hitzestress zu evaluieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zur Vermeidung von nachteiligen Auswirkungen von Hitzestress zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie verwendet werden kann, um verschiedene Ansätze zur Milderung der Komplikationen von Hitzestress zu bewerten.

Verfahren wird von Ludmila Globa vorgeführt. Und Oleg Pusovyy, wissenschaftliche Mitarbeiter aus unserem Labor. Zunächst mit einer einzigen Kolonie von Bacillus subtilis BSB3, die über Nacht auf einer Nähragarplatte gezüchtet wurde.

Zehn Milliliter Nährbrühe in einen Kolben impfen. Lassen Sie die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius wachsen. Bereiten Sie 500 Milliliter Sporulationsmedium nach dem hier gezeigten Rezept vor.

Und 20 Minuten lang bei 121 Grad Celsius autoklavieren. Lassen Sie das Medium auf 50 Grad Celsius abkühlen, bevor Sie die folgenden sterilen Lösungen hinzufügen. In einem Sterilschrank das vorbereitete Medium bei Raumtemperatur 20 Minuten lang auf 40 Grad Celsius abkühlen.

Und gießen Sie je 25 Milliliter in 20 sterile Petrischale. Lassen Sie das Medium über Nacht fest werden. Verteilen Sie anschließend 0,5 Milliliter der Bacillus subtilis BSB3-Kultur über Nacht auf die Oberfläche der Sporulationsmediumplatten.

Inkubieren Sie die Platten fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius, bis 90% Sporulation erreicht sind. Verwenden Sie dann eine hochauflösende Mikroskopie, um nach phasenhellen Sporen zu suchen. Um die Bakterien zu ernten, geben Sie einen Milliliter PBS auf die Platten und verwenden Sie einen sterilen Zellverteiler, um die Bakterien von der Oberfläche zu kratzen.

Lagern Sie die Suspension bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Bestätigen Sie die Lebensfähigkeit der Bakterien, indem Sie 0,1 Milliliter der entsprechenden Verdünnung einer Bakteriensuspension auf Sporulationsmediumplatten plattieren und 18 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Verwenden Sie einen Koloniezähler, um Bakterienkolonien zu zählen und den Titer der Bakterien in der getesteten Suspension zu berechnen.

Bereiten Sie dann eine Bakteriensuspension in PBS in einer Endkonzentration von eins mal zehn bis zum achten KBE pro Milliliter her. Nach zweitägiger Behandlung von Ratten durch orale Sonde mit B.subtilis BSB3 oder PBS, anschließender Unterteilung der Tiere und Messung ihrer Temperatur halten Ratten der Gruppen eins und zwei 25 Minuten lang bei Raumtemperatur. Tiere der Gruppen drei und vier werden 25 Minuten lang bei 45 Grad Celsius und 55 % relativer Luftfeuchtigkeit in eine Klimakammer gebracht.

Nach der erneuten Messung der Rektaltemperatur jeder Ratte werden alle Tiere vier Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten. Nach dem Einschläfern der Tiere, der Entnahme des Rüsselblutes und der Isolierung der Organe gemäß dem Textprotokoll wird jede Organprobe in vorgewogene sterile Röhrchen gegeben und gewogen. Geben Sie steriles PBS in jedes Röhrchen, um eine Verdünnung der Probe von einem bis zehn Gewicht pro Volumen zu erhalten, und verwenden Sie einen sterilen Gewebehomogenisator aus Glas, um homogene Gewebesuspensionen zu erzeugen.

Verwenden Sie anschließend steriles PBS, um serielle Verdünnungen jeder Probe vorzunehmen. Dann 0,1 Milliliter aller Verdünnungen auf die Oberfläche von MacConkeys und 5%-Blutagar auffüllen. Und Brucella-Blutagar mit Hemin und Vitamin K1. Verwenden Sie nach dem Inkubieren der Platten einen Koloniezähler, um die Kolonien auf jeder Plattengruppe zu zählen.

Geben Sie die Ergebnisse als Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Gramm Gewebe an. Nach der Vorbereitung und Färbung von Dünndarmschnitten gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie ein hochauflösendes Mikroskop, um die Darmzotten und die Gesamtwanddicke der Schleimhaut zu messen. Analysieren Sie mindestens vier Proben von jeder Ratte und führen Sie mindestens 20 Messungen in jeder Probe durch.

Um eine hochauflösende Lichtmikroskopie von Blutproben durchzuführen, verwenden Sie die Schwingungsisolationsplattform als Basis für das Mikroskopsystem mit einer Videokamera und einem Computer zur Aufzeichnung von Live-Bildern. Nach der Kalibrierung der Testbilder gemäß dem Textprotokoll werden sieben Mikroliter frisch entnommenes Blut von jeder Ratte auf einen Objektträger gelegt und mit einem Deckglas versehen. Fotografieren und zeichnen Sie dann zehn Bilder von 72 x 53,3 Mikrometern im Quadrat jeder Probe auf.

Schließlich können Sie mit einer Software, die hochauflösende optische Bilder mit direkter Sicht in Echtzeit liefert, die Konzentration von Vesikeln messen. Die mittlere Körpertemperatur der Tiere vor und unmittelbar nach Hitzestress betrug 36,7 plus oder minus 07 Grad Celsius bzw. 40,3 plus oder minus 0,17 Grad Celsius. Die Hitzeeinwirkung von Ratten führte zu einer signifikanten Hemmung der Zottenhöhe und der Gesamtschleimhautdicke.

Die Behandlung mit dem BSB3-Stamm vor Stress schützte den Darm jedoch vor der schädlichen Wirkung der Hitze. Für die Translokation von Bakterien aus dem Darm wurden mesenteriale Lymphknoten, Leber und Milz analysiert. Wie hier dargestellt, wurden Bakterien in einer Konzentration von 1,7 mal zehn zu den drei plus oder minus 4,6 mal zehn zu den zwei KBE pro Gramm Gewebe nur in Proben aus mesenterialen Lymphknoten und Leber von mit PBS behandelten Ratten isoliert, die Hitze ausgesetzt waren.

Auf der anderen Seite waren alle untersuchten Proben von Kontroll- und Hitzegestressten, die den BSB3-Stamm erhielten, steril. Bei hitzegestressten Ratten wurde keine Veränderung der IL 1beta-, IL-6-, TNFalpha- oder Interferon-Gamma-Zytokinspiegel registriert. Die IL-10- und LPS-Spiegel waren jedoch bei PBS-behandelten Tieren vor der Wärmebehandlung erhöht.

Daher verhinderte die Vorbehandlung mit B.subtilis BSB3 den Anstieg von IL-10 und LPS im Serum nach der Wärmebehandlung. Schließlich wurde ein signifikanter Anstieg der Konzentration freier Vesikel im Blut von Ratten gefunden, die PBS vor Hitzestress erhielten, jedoch nicht bei den mit BSB3 behandelten Tieren. Es ist wichtig, daran zu denken, pyrogene Materialien für die Blutentnahme zu verwenden und die Serumflüssigkeiten bei minus 20 Grad Celsius zu halten, die durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen erreicht werden, und bei der Analyse der bakteriellen Translokation ein steriles Verfahren zu befolgen.

Nach diesem Verfahren kann wie die Verabreichung von Bakterien nach Hitzestress durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu Komplikationen von Hitzestress zu beantworten.