Name: Prävention von Hitzestress Unerwünschte Wirkungen bei Ratten durch Bacillus subtilis Dehnungs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Erfahren Sie, wie Bacillus subtilis BSB3 Hitzestress-Komplikationen bei Ratten verhindert. Diese Methode ermöglicht die Bewertung verschiedener Ansätze zur Minderung von Hitzestress-Schäden im Darm.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Auburn University Fonds FOP 101002-139294-2050.

Alle experimentellen Verfahren wurden von IACUC der Auburn University, Auburn, Alabama genehmigt. 1. Herstellung von Kulturmedien, Geschirr und Bakterienkultur <ol><li> Impfen 10 ml Nährlösung in einem Kolben mit einer einzelnen Kolonie von Bacillus subtilis BSB3 Kultur, über Nacht auf einem Nährstoff - Agar - Platte gewachsen. </li><li> Machen 500 ml Sporulationsmedium 19 (pro Liter: Bacto Nutrient Broth, 8 g; 10% (w / v) KCl, 10 ml; 1,2% (w / v) MgSO4 x 7 H 2 O, 10 ml, Agar, 15 g) und Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. Lassen Sie auf 50 o C abkühlen und fügen Sie die folgenden sterilen Lösungen: 1 M Ca (NO 3) 2, 1 ml; 0,01 M MnCl 2, 1 ml; 1 mM FeSO 4, 1 ml. </li><li> Kühlen hergestellte Medium bis 40 o C für 20 min bei Raumtemperatur und gießt 25 ml in jede von 20 sterilen Petrischalen im Sterilschrank. Lassen Sie das Medium über Nacht erstarren. </li><li> Verteilt 0,5 ml Übernachtkultur von Bacillus subtilis BSB3 auf die Oberfläche des Mediums in den Petrischalen. Inkubiere Kultur bei 37 ° C für 5 Tage , bis 90% der Sporulation. Reveal Phase helle Sporen durch die hochauflösende Mikroskopie. </li><li> Ernte Bakterien durch Zugabe von 1 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf die Platte und Abkratzen Bakterien von einer Oberfläche eines sterilen Zell Spreizer verwendet wird. Bewahren Sie die Suspension in den Kühlschrank stellen, bis sie benötigt. </li><li> Bestätigen Lebensfähigkeit der Bakterien durch 0,1 ml der geeigneten Verdünnung Plattierung (10 -5 bis 10 -6) einer Bakteriensuspension auf Sporulationsmedium Platten gefolgt von einer Inkubation für 18-24 Stunden bei 37 o C. </li><li> Graf Bakterienkolonien auf den Platten eine Kolonie Zähler mit und berechnen den Titer von Bakterien in der getesteten Suspension. Vorbereitung Bakteriensuspension mit der Endkonzentration 1 x 10 8 CFU / ml in PBS. </li></ol> 2. Tiere <ol><li> Verwenden Sie 32 männliche Sprague-Dawley-Ratten (250 - 300 g,). Pflegen Tiere unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen mit freiem Zugang zu Standard-Pelletfutter und Wasser. Stellen Sie eine mittlere Temperatur (21 ± 1 ° C), Feuchtigkeit (50 ± 5%) und eine 12 - Stunden Licht-Dunkel - Zyklus. </li></ol> 3. Experimentelles Design <ol><li> Starten Sie Behandlung von Tieren durch orale Gabe 11, nach 2 Tagen der Akklimatisierung. Verwenden Sie Spritze mit der Schlundsonde Nadel. Behandeln Sie 16 Ratten , die mit B. subtilis BSB3 Suspension (1 ml pro Ratte) zweimal täglich für zwei Tage (B. subtilis - Gruppe). Behandeln Sie 16 Ratten , die mit PBS (1 ml pro Ratte) zweimal täglich für zwei Tage (PBS - Gruppe) (Abbildung 1). </li><li> Nach der Behandlung unterteilen jede Gruppe (8 Ratten pro Gruppe): Gruppe 1- Kontrolle (PBS / kein Stress), Gruppe 2 - B subtilis (B. subtilis / kein Stress), Gruppe 3 - Stress (PBS / Hitzestress) und Gruppe 4- B. subtilis + Spannung (B. subtilis / Hitzestress). </li><li> Messen Sie die Temperatur rektal jeder Ratte unter Verwendung eines elektronic digitales Thermometer. Halten Ratten der Gruppen 1 und 2 bei Raumtemperatur für 25 min. Ort Tiere der Gruppen 3 und 4 in einer Klimakammer bei 45 o C und die relative Luftfeuchtigkeit 55% für 25 min. </li><li> Anschließend messen die rektale Temperatur jeder Ratte in allen Gruppen eine elektronische Digitalthermometer verwenden. Legen Sie alle Tiere bei Raumtemperatur für 4 Stunden. </li><li> Anesthetize Ratten mit Isofluran (2-4%) in ein verschließbares Gefäß Anästhesie und beobachten, bis die Ratten tief anästhesiert (keine Antwort auf Zehe Prise). Euthanize Ratten durch schnelle Enthauptung mit einer Guillotine. </li><li> Sammeln Stamm Blut von jeder Ratte 20 (15 - 16 ml) mit den apyrogene Pipetten in apyrogene Röhren Serum zu erhalten und sofort nehmen Proben von Blut (7 ul von jeder Ratte) mit einer Pipette für die mikroskopische Untersuchung. </li><li> Setzen Sie Röhrchen mit dem Blut in einem Kühlschrank für mindestens 30 min Gerinnen zu ermöglichen. Zentrifugenröhrchen bei 20 ° C, 7000 × g für 10 min und schnellentfernen Serum mit einer Pipette. Aliquot Serum von jeder Ratte in 50 ul - Volumina und bei -20 ° C bis zum Test erhalten. </li></ol> 4. Chirurgische Verfahren <ol><li> Cut / trimmen alle Fell aus dem Bauch und Brustkorb der Unterseite der Karkasse mit elektrischen Scheren. Legen Sie die Karkasse in einem sterilen Schrank und behandeln die rasierte Fläche der Karkasse mit 70% Alkohol. </li><li> Verwenden Sie eine sterile Skalpell einen Mittelschnitt des Bauches zu schaffen. Entfernen Leber, mesenterischen Lymphknoten, Milz und Dünndarm von jeder Ratte unter Verwendung von sterilen Pinzetten. </li></ol> 5. Analyse der bakteriellen Translokation <ol><li> Platzieren Sie jede Probe von Leber, mesenterischen Lymphknoten und Milz in vorher gewogene sterilen Röhrchen und wiegen. Berechnen des Gewichts der Probe als eine Differenz zwischen dem Gewicht eines Röhrchens mit einer Probe und das Gewicht eines leeren Rohrs. </li><li> Hinzufügen sterile PBS auf das Rohr eine 1:10 Verdünnung zu erhalten (w / v) der Probe und homogerieren jede Probe mit einem sterilen Homogenisator Glasgewebe eine homogene Suspension 21 zu erhalten. </li><li> Stellen Reihenverdünnungen (10 -1 bis 10 -4) jeder Probe in sterilem PBS. Platte 0,1 ml aller Verdünnungen jedes Gewebes auf die Oberfläche von MacConkey des und 5% Blutagar und Brucella Blutagar mit Hämin (0,005 g / l) und Vitamin K1 (0,01 g / L) Platten. </li><li> Inkubieren MacConkey des und 5% Blutagarplatten aerob und Brucella Blutagarplatten unter anaeroben Bedingungen bei 37 o C 22. </li><li> Graf Kolonien von aeroben Bakterien nach 24 Stunden, und Kolonien von anaeroben Bakterien nach 48 h Inkubation eine Kolonie Zähler verwendet wird. Die Ergebnisse sind als die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (CFU) in einem Gramm Gewebe. </li></ol> 6. Die histologische Analyse <ol><li> Entfernen Dünndarm Proben aus jeder Ratte durch die chirurgische Prozedur (Schritte von 4,1 bis 4,2). Fix Proben in Bouin-Fixiermittel, einbetten in Paraffin,Vorbereitung 6 um Abschnitte und Fleckenabschnitte mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardverfahren 23. </li><li> Verwenden , um eine hochauflösende Mikroskopsystem für die Höhe der Darmzotten Messung und Gesamtschleimhautdicke in jeder Probe (Vergrßerung 100X) 24. Analysieren 4 Proben von jeder Ratte und machen mindestens zwanzig Messungen in jeder Probe. Express-Ergebnisse in Mikrometer. </li></ol> 7. Zytokin-Assay <ol><li> Verwenden Sie kommerzielle Ratte ELISA-Kits für IL-1β; IL-6; TNF-α; INF-γ und IL-10-Niveaus von Zytokinen in Serum zu messen, gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Generieren von Standardkurven für jeden Probensatz unter Verwendung von Standards für den entsprechenden Kit getestet. Definieren Sie die Ebene von Zytokinen in jeder Probe durch Vergleich der experimentellen Daten mit der entsprechenden Standardkurve. </li></ol> 8. Lipopolysaccharide Assay <ol><li> Analysieren Niveau von LPS in Serum eine Ratte LPS ELISA-Kit nachProtokoll des Herstellers. Schätzung Konzentration von LPS in den Proben durch Vergleich der erhaltenen Werte mit den Werten der Standardkurve. </li></ol> 9. Hohe Auflösung Lichtmikroskopie des Blutes <ol><li> Verwenden Sie das Mikroskopsystem vorher 25,26 beschrieben. Verwenden Sie eine Schwingungsisolationsplattform als Basis für das Mikroskopsystem und Videokamera und Computer 25 , um die Live - Bilder aufzunehmen. Kalibrieren Sie Testbilder einen Richardson Schlitten unter Verwendung von wie zuvor 27 beschrieben. </li><li> Legen 7 ul frisch entnommenem Blut von jeder Ratte auf einem Glasobjektträger, Deckglas, Fotografie und aufzeichnen zehn Bildrahmen von 72 × 53,3 &amp; mgr; m 2 in jeder Probe (Vergrößerung 1,700X). </li><li> Messen Sie die Konzentration von Vesikeln mit einer Software, die Direktsicht optische Bilder in Echtzeit mit hoher Auflösung liefert. Untersuchen mindestens 20 Bildrahmen für jeden experimentellen Zustand 28. </li></ol> 10. StatisTics <ol><li> Express alle Werte als Mittelwert und Standardabweichung. Führen Sie eine statistische Analyse und Grafik Plotten. Analysieren Sie die Ergebnisse mit den beiden Probe t-Test, stellen Sie das Signifikanzniveau bei 0,05 statistische Signifikanz zu definieren. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die Exposition gegenüber hohen Temperaturen führt zu schweren gesundheitlichen Bedingungen 29. Prävention und Früherkennung von Komplikationen zu Hitzestress im Zusammenhang von entscheidender Bedeutung sind 30. Das dargestellte Protokoll kann die Wirksamkeit verschiedener Ansätze zur Verhinderung von Hitzestress nachteiligen Wirkungen zu bewerten, verwendet werden. Kritische Schritte in diesem Protokoll sind: die Wärmebehandlungsverfahren (45 °<...

Unterschiedliche Stressoren beeinflussen die Gesundheit von Mensch und Tier. Die Temperatur ist einer der stressigsten Faktoren und führt zu chronischen, akuten und sogar tödlichen Erkrankungen1. In vielen Fällen wurden Veränderungen in der Darmmorphologie und ein Verlust der Integrität der Darmbarriere nach Hitzestress dokumentiert2,3. Diese Schutzbarriere ist für die Abwehr der Translokation von Darmbakterien und ihren Toxinen, insbesondere Lipopolysacchariden (LPS), aus dem Lumen in den inneren Kreislauf verantwortlich4,5. Die Stabilität der Darmmikrobiota beeinflusst maßgeblich die Funktion der Darmbarriere, die Immunantwort des Wirts und die Toleranz gegenüber Stressbedingungen6. Somit kann die Modulation der Darmmikrobiota einen neuartigen Ansatz zur Prävention von stressbedingten Nebenwirkungen bieten. 
Nützliche Bakterien wurden als vielversprechende Strategie verwendet, um die Darmmikrobiota für eine erfolgreiche Behandlung verschiedener klinischer Zustände wie Durchfall, entzündliche Darmerkrankungen, atopische Dermatitis, Stoffwechselstörungen7-10 zu modifizieren. Zu den probiotischen Wirkungen nützlicher Bakterien gehören die Produktion von essentiellen Metaboliten zur Unterstützung der Darmgesundheit, die Stimulation des Immunsystems, die Förderung der Laktosetoleranz und die Wiederherstellung der epithelialen Dysfunktion. Probiotika erwiesen sich wirksam bei der Vorbeugung der stressbedingten Komplikationen in vitro und in Tiermodellen11,12. 
Forscher haben Bacillus-Bakterien als Probiotika mehr Aufmerksamkeit geschenkt, weil diese Bakterien die Darmhomöostase unterstützen13 und positive Auswirkungen auf den Wirthaben 14. Unsere bisherigen Daten zeigten eine hohe Wirksamkeit von Bacillus-Probiotika gegen Krankheitserreger in vitro15,16 und in klinischen Studien17,18. Hier wollen wir die präventive Wirkung von B. subtilis BSB3 Stamm gegen Komplikationen nach Hitzestress untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich,&nbsp;St. Louis, MO</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol&nbsp;</td><td>Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA&nbsp;</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>97064-334</td><td></td></tr><tr><td>MacConkey Agar Platten</td><td>VWR</td><td>470180-742</td><td></td></tr><tr><td>5% Blut Agar Platten</td><td>VWR</td><td>89405-024</td><td></td></tr><tr><td>Brucella Blut Agar Platte mit Hemin und Vitamin K</td><td>VWR</td><td>89405-032</td><td></td></tr><tr><td>Bouin' s Fixative</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>15990</td><td></td></tr><tr><td>IL-10 Ratten-ELISA-Kit</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td>KRC0101</td><td></td></tr><tr><td>IL-1beta Ratten-ELISA-Kit</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td>KRC0011</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 Ratten-ELISA-Kit</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td>KRC0061</td><td></td></tr><tr><td>INF-gamma Ratten-ELISA-Kit</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td></td><td></td>KRC4021</tr><tr><td>TNF-alpha Ratten-ELISA-Kit</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td>KRC3011</td><td></td></tr><tr><td>Ratten-LPS-ELISA-Kit</td><td>NeoBioLab, MA, USA</td><td>RL0275</td><td></td></tr><tr><td>Klimakammer 6020-1</td><td>Caron, Marietta, OH, USA</td><td>6020-1</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA</td><td>Optima L-90K</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Zentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop optisches System</td><td>CitoViva Technology Inc., Auburn, AL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koloniezähler</td><td>Fisher Scientific , Pittsburgh, PA, USA</td><td>RE-3325</td><td></td></tr><tr><td>Gefrierschrank</td><td>Haier, Brooklyn, NY, USA</td><td>HCMO50LA</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Mikroplatte Lesegerät</td><td>Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA</td><td>ELx 808</td><td></td></tr><tr><td>Auto Strip Washer</td><td>Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA</td><td>ELx50</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Gilson, Pipetman, Frankreich</td><td>P100, P200, P1000</td><td></td></tr><tr><td>C24 Inkubator Shaker</td><td>New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA</td><td>Classic C24</td><td></td></tr><tr><td>Schaukelschüttler &nbsp;</td><td>Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA</td><td>55</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>875713</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>SterilGard III Advance</td><td>The Baker Company, Sanford, ME, USA</td><td>SG403</td><td></td></tr><tr><td>Kultur-Anbaukolben</td><td>Corning Incorporated, Corning, NY, USA</td><td>4995</td><td>PYREX 250 ml Erlenmeyerkolben</td></tr><tr><td>Optisches Spektrometer Genesys 20</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td>4001</td><td></td></tr><tr><td>Sony DXC-33 Videokamera</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Richardson Testobjektträger</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft, Hatfield, PA, USA</td><td>80303</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Wasseraufbereitungssystem</td><td>Millipore</td><td>Direct-Q</td><td></td></tr><tr><td>Image-Pro Plus Software</td><td>Medien Kybernetik, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triple Beam Balance</td><td>OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gewebe-Homogenisator, Dounce</td><td>VWR</td><td>71000-518</td><td></td></tr></tbody></table>

prävention von hitzestress unerwünschte wirkungen bei ratten durch<em&gt; bacillus subtilis</em&gt; dehnungs

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Diese Studie wurde entworfen , um die Schutzwirkung des Bacillus subtilis Stamms gegen Komplikationen Stress aufzuheizen Bezug zu bewerten. Zweiunddreißig Sprague-Dawley-Ratten wurden in dieser Studie verwendet. Die Tiere wurden oral zweimal täglich für zwei Tage mit B behandelt subtilis - Stamm BSB3 oder PBS. Am nächsten Tag nach der letzten Behandlung wurde jede Gruppe eingeteilt und zwei experimentelle Gruppen (eine mit PBS behandelt und eine mit B. subtilis - behandelt) wurden für 25 min bei 45 o C gebracht. Zwei Kontrollgruppen waren für 25 Minuten bei Raumtemperatur. Alle Ratten wurden eingeschläfert und verschiedene Parameter wurden in allen Gruppen analysiert. Unerwünschte Wirkungen von Hitzestress werden durch die Abnahme der Zotten Höhe und Gesamt Mukosadicke im Darmepithel registriert; Translokation von Bakterien aus dem Lumen; Vesikulation von Erythrozyten und Erhebung der Lipopolysaccharide (LPS) im Blut erhöht. Die schützende Wirksamkeit der Behandlung wird durch pre ausgewertetErfindung dieser Nebenwirkungen. Das Protokoll wurde für die orale Behandlung von Ratten, die mit Bakterien zur Verhinderung von Hitzestress Komplikationen eingerichtet, aber dieses Protokoll kann auch für andere Verabreichungswege und für die Analyse verschiedener Verbindungen modifiziert und verwendet werden.

Die mittlere Körpertemperatur der Tiere vor und unmittelbar nach der Hitzestress war 36,7 ± 0,07 ° C und 40,3 ± 0,17 ° C, bzw. (P &lt;0,05). Exposition von Ratten gegenüber Wärme (Gruppe 3) führte zu einer signifikanten Hemmung der Zotten Höhe und Gesamtschleimhautdicke (2, 3). Die orale Verabreichung von BSB3 Stamm vor Stress geschützt Darm vor der schädlichen Wirkung von Wärme. Translok...

Wir haben ein Protokoll zur Vorbeugung von Hitzestresseffekten bei Ratten durch orale Vorbehandlung mit nützlichen Bakterien beschrieben. Dieses Protokoll kann modifiziert und für verschiedene Verabreichungswege und für die Analyse verschiedener Verbindungen verwendet werden.

Prävention von Hitzestress Unerwünschte Wirkungen bei Ratten durch<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Dehnungs

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die vorbeugende Wirkung des B.subtilis-BSB3-Stamms gegen Komplikationen nach Hitzestress zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Verhinderung von schädlichen Auswirkungen des Hitzestresses zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zur Bewertung verschiedener Ansätze zur Minderung der Komplikationen durch Hitzestress eingesetzt werden kann.Die Demonstration dieses Verfahrens erfolgt durch Ludmila Globa und Oleg Pusovyy, wissenschaftliche Mitarbeiter aus unserem Labor. Beginnen Sie mit einer einzelnen Kolonie von Bacillus subtilis BSB3, die über Nacht auf einer Nähragarplatte gezüchtet wurde.Inokulieren Sie zehn Milliliter Nährbouillon in einem Kolben. Kultivieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie 500 Milliliter Sporulationsmedium gemäß dem hier gezeigten Rezept vor.Und autoklavieren bei 121 Grad Celsius für 20 Minuten. Lassen Sie das Medium auf 50 Grad Celsius abkühlen, bevor Sie die folgenden sterilen Lösungen hinzufügen. Kühlen Sie das hergestellte Medium in einem sterilen Schrank bei Raumtemperatur auf 40 Grad Celsius für 20 Minuten ab.Und geben Sie 25 Milliliter in jeweils 20 sterile Petrischalen. Lassen Sie das Medium über Nacht gerinnen. Anschließend verteilen Sie 0,5 Milliliter der über Nacht gezüchteten Bacillus subtilis BSB3-Kultur auf der Oberfläche der Sporulationsmedium-Platten.Die Platten fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, bis eine Sporulation von 90 % erreicht ist. Anschließend mithilfe einer hochauflösenden Mikroskopie nach phasenhellen Sporen prüfen. Zum Ernten der Bakterien ein Milliliter PBS zu den Platten geben und einen sterilen Zellverteiler verwenden, um die Bakterien von der Oberfläche abzukratzen.Bewahren Sie die Suspension bei vier Grad Celsius auf, bis sie verwendet wird. Bestätigen Sie die Lebensfähigkeit der Bakterien, indem Sie 0,1 Milliliter der geeigneten Verdünnung einer bakteriellen Suspension auf Sporulationsmedium-Platten ausplattieren und 18 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Zählen Sie mithilfe eines Koloniezählers die bakteriellen Kolonien und berechnen Sie die Titer der Bakterien in der getesteten Suspension.Dann bereiten Sie eine bakterielle Suspension in PBS mit einer Endkonzentration von 1 × 10⁸ KBE pro Milliliter vor. Nach der Behandlung von Ratten mittels oraler Gavage mit B.subtilis BSB3 oder PBS für zwei Tage unterteilen Sie die Tiere und messen deren Temperatur; anschließend halten Sie die Ratten der Gruppen eins und zwei 25 Minuten lang bei Raumtemperatur. Stellen Sie die Tiere der Gruppen drei und vier 25 Minuten lang in eine Klimakammer bei 45 Grad Celsius und 55 % relativer Luftfeuchtigkeit.Nach erneuter Messung der rektalen Temperatur jedes Rattentieres alle Tiere vier Stunden lang bei Raumtemperatur aufbewahren. Danach, nach der Tötung der Tiere, der Gewinnung des Stammblutes und der Isolierung der Organe gemäß dem Textprotokoll, jede Organprobe in vorgewogene sterile Röhrchen geben und wiegen. Steriles PBS zu jedem Röhrchen hinzufügen, um eine Gewichts-zu-Volumen-Verdünnung von 1 zu 10 der Probe zu erhalten, und einen sterilen Glasgewehomogenisator verwenden, um homogene Geweissuspensionen herzustellen.Verdünnen Sie anschließend jede Probe in steriler PBS seriell. Tragen Sie dann 0,1 Milliliter jeder Verdünnung auf die Oberfläche von MacConkey-Agar und 5 % Blutagar auf. Und Brucella-Blutagar mit Hemin und Vitamin K1. Zählen Sie nach der Inkubation der Platten mithilfe eines Koloniezählers die Kolonien auf jeder Gruppe von Platten.Geben Sie die Ergebnisse als Anzahl koloniebildender Einheiten, oder CFUs, pro Gramm Gewebe an. Nachdem Sie Schnitte des Dünndarms gemäß dem Textprotokoll vorbereitet und angefärbt haben, messen Sie mit einem hochauflösenden Mikroskop die Darmzotten und die gesamte Mukosaschichtdicke. Analysieren Sie mindestens vier Proben pro Ratte und führen Sie in jeder Probe mindestens 20 Messungen durch.Um eine Lichtmikroskopie mit hoher Auflösung von Blutproben durchzuführen, verwenden Sie die Schwingungsisolationsplattform als Untergrund für das Mikroskopsystem mit einer Videokamera und einem Computer zur Aufzeichnung von Live-Bildern. Nachdem Sie Testbilder gemäß dem Textprotokoll kalibriert haben, geben Sie sieben Mikroliter frisch entnommenes Blut von jeder Ratte auf einen Objektträger und setzen eine Deckglasplatte auf. Danach fotografieren und zeichnen Sie zehn Bildfelder von 72 mal 53,3 Quadratmikrometern in jeder Probe auf.Schließlich die Konzentration der Vesikel mithilfe einer Software messen, die hochauflösende, direkte optische Bilder in Echtzeit bereitstellt. Die mittlere Körpertemperatur der Tiere vor und unmittelbar nach der Hitzebelastung betrug jeweils 36,7 ± 0,7 °C und 40,3 ± 0,17 °C. Die Exposition von Ratten gegenüber Hitze führte zu einer signifikanten Hemmung der Zottenhöhe und der gesamten Schleimhautdicke.Jedoch schützte die Behandlung mit dem BSB3-Stamm vor der Belastung den Darm vor den schädlichen Auswirkungen von Hitze. Zur Untersuchung der Translokation von Bakterien aus dem Darm wurden mesenteriale Lymphknoten, Leber und Milz analysiert. Wie hier dargestellt, wurden Bakterien nur in Proben mesenterialer Lymphknoten und Leber von mit PBS behandelten Ratten, die Hitze ausgesetzt waren, in einer Konzentration von 1,7 × 10³ ± 4,6 × 10² CFU pro Gramm Gewebe isoliert.Andererseits waren alle getesteten Proben von Kontroll- und durch Hitze belasteten Tieren, die den BSB3-Stamm erhielten, steril. Bei hitzebelasteten Ratten wurden keine Veränderungen der Zytokinspiegel von IL-1beta, IL-6, TNFalpha oder Interferon gamma registriert. Hingegen waren die Spiegel von IL-10 und LPS in PBS-behandelten Tieren vor der Hitzebelastung erhöht.Daher verhinderte die Vorbehandlung mit B. subtilis BSB3 den Anstieg von IL-10 und LPS im Serum nach der Hitzebelastung. Schließlich wurde eine signifikante Zunahme der Konzentration freier Vesikel im Blut von Ratten festgestellt, die vor der Hitzestressbelastung PBS erhalten hatten, nicht jedoch bei den mit BSB3 behandelten Tieren. Es ist wichtig, pyrogene Materialien für die Blutentnahme zu verwenden, darauf zu achten, dass die Serumproben bei minus 20 Grad Celsius gehalten werden, wobei wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermieden werden sollte, und während der Analyse der bakteriellen Translokation ein steriles Vorgehen einzuhalten.Mit dieser Methode können beispielsweise die Verabreichung von Bakterien nach Hitzestress und weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu Komplikationen des Hitzestresses zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt die Induktion und klinischen Scoring von einem Tiermodell der Multiplen Sklerose: chronisch-rezidivierende experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in DA-Ratten. Die Krankheit, durch die Immunisierung von Ratten mit einer Emulsion, die ganze Ratte Rückenmark und komplettem Freund-Adjuvans induziert, weist klinische Symptome ähnlich der menschlichen Erkrankung.

Induction and Clinical Scoring von chronisch-rezidivierende experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Quelle: Sorokulova, I., et al. Prävention von nachteiligen Auswirkungen von Hitzestress bei Ratten durch den Stamm Bacillus subtilis . J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt Ratten, die mit nützlichen Bakterien oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vorbehandelt und Hitzestress ausgesetzt wurden, um die Integrität der Darmbarriere zu bewerten. Im Gegensatz zu zahlreichen Kolonien bei Kontrollratten deuten weniger aus dem Darm stammende Bakterienkolonien aus der Leber der behandelten...

Bewertung der Wirkung nützlicher Bakterien auf die mikrobielle Translokation des Darms bei hitzegestressten Ratten

Quelle: Sorokulova, I., et al. Verhinderung von Hitzestress-Nebenwirkungen bei Ratten durch den Bacillus-subtilis-Stamm. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video präsentiert histologische und blutmikroskopische Analysen, die zur Bewertung der schützenden Wirkung von Bacillus subtilis bei Ratten mit Hitzestress eingesetzt werden.

Histologische und hämatologische Analysen zur Bewertung der Auswirkungen von Bacillus subtilis bei hitzebelasteten Ratten

In diesem Video beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Untersuchung von Belastungs-Hitzschlag (EHS) in einem Mausmodell.

Belastungs-Hitzschlag-Mausmodell: Ein Protokoll zur Untersuchung der Mechanismen, die dem Belastungs-Hitzschlag zugrunde liegen

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zu induzieren und erkennen, dass CMHs verursacht durch LPS Injektion in Sprague-Dawley Ratten, die möglicherweise in Zukunft Forschung Untersuchungen über die Pathogenese der CMHs genutzt.

Sub-akute zerebrale Punktblutungen induziert durch Lipopolysaccharid-Injektion bei Ratten

Hier beschreiben wir das Protokoll und die Umsetzung von Methyl-Seq, eine epigenomischen-Plattform mit einem Rattenmodell epigenetische Veränderungen im Zusammenhang mit chronischem Stress ausgesetzt zu identifizieren. Ergebnisse zeigen, dass die Ratte-Methyl-Seq-Plattform ist in der Lage, die Methylierung Unterschiede, die durch Stress Exposition bei Ratten entstehen.

Eine Ratte Methyl-Seq-Plattform um epigenetische Veränderungen im Zusammenhang mit Stress Exposition zu identifizieren

Hier charakterisieren wir zelluläre proteotoxische Stressreaktionen in der Nematode C. elegans, indem wir die Aktivierung fluoreszierender Transkriptionsreporter messen und die Empfindlichkeit gegenüber physiologischem Stress beobachten.

Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans

Das Protokoll beschreibt die Entwicklung eines standardisierten, wiederholbaren, präklinischen Modells des Belastungshitzschlags (EHS) bei Mäusen, die frei von nachteiligen äußeren Reizen wie Elektroschocks sind. Das Modell bietet eine Plattform für mechanistische, präventive und therapeutische Studien.

Ein präklinisches Modell des Belastungshitzeinschlags bei Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung des Antibiotika-induzierten pseudo-keimfreien Dextransulfat-Natrium-induzierten Colitis-Mausmodells vor, um die Rolle der Darmmikrobiota bei der Regulierung der positiven Auswirkungen von Bacillus cereus auf Colitis zu untersuchen.

Untersuchung der lindernden Wirkung der Verabreichung von Bacillus cereus auf Colitis durch Modulation der Darmmikrobiota

Darmmikroben können die Gesundheit ihres Wirts über spezifische oder konservierte Mechanismen positiv oder negativ beeinflussen. Caenorhabditis elegans ist eine bequeme Plattform, um nach solchen Mikroben zu suchen. Das vorliegende Protokoll beschreibt das Hochdurchsatz-Screening von 48 Bakterienisolaten auf Auswirkungen auf die Nematoden-Stressresistenz, die als Proxy für die Gesundheit von Würmern verwendet werden.

Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Isolate mit Auswirkungen auf die Gesundheit von Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll skizziert ein CUMS-Modell (Chronic Unpredictable Mild Stress) für Depressionen, das auf der mongolischen medizinischen Theorie basiert, zusammen mit Methoden zur Validierung von Verhaltenstests.

Chronisch unvorhersehbarer milder Stress bei Ratten basierend auf der mongolischen Medizin

Erfahren Sie, wie Bacillus subtilis BSB3 Hitzestress-Komplikationen bei Ratten verhindert. Diese Methode ermöglicht die Bewertung verschiedener Ansätze zur Minderung von Hitzestress-Schäden im Darm.

Prävention von Hitzestress Unerwünschte Wirkungen bei Ratten durch

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