Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Reinigung, die gezielte Spinmarkierung und die Rekonstitution eines pentameren ligandengesteuerten Kanals für Untersuchungen mittels Elektronenspinresonanz zu demonstrieren. Die Untersuchung der Dynamik von Membranproteinen in einem physiologisch relevanten Umfeld ist entscheidend, um vollständig zu verstehen, wie dieses Membrantransportprotein funktioniert. Und aufgrund dieser Anforderungen halte ich die gezielte Spinmarkierung in Kombination mit der EPR-Technik für besonders geeignet.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nicht durch die Größe des Proteins begrenzt ist. Daher wäre die gezielte Spinmarkierung in Kombination mit der EPR-Spektroskopie die Methode der Wahl, wenn Sie die Dynamik großer Proteine oder in Membranen rekonstituierte Proteine untersuchen möchten. Führen Sie einzelne Cystein-Mutationen im GLIC-Gen mittels gezielter Mutagenese ein.

Stellen Sie eine Übernachtkultur des GLIC-Cystein-Mutanten wie im Textprotokoll beschrieben her. Geben Sie anschließend 100 Milliliter steriles Kaliumphosphatpuffer in das autoklavierte Terrific-Broth-Medium. Fügen Sie dann sterile Glukose, Kanamycin und 10 Milliliter der Übernachtkultur hinzu.

Bei 37 Grad Celsius in einem Schüttler bei 250 U/min inkubieren. 50 Milliliter Glycerin zugeben und die Kultur weiter schütteln, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 1,0 bis 1,2 erreicht. Nach der Induktion der Zellen mit 200 µM IPTG den Schüttler auf 250 U/min zurückstellen und weitere etwa 16 Stunden bei 18 Grad Celsius inkubieren.

Die Zellen in Ein-Liter-Zentrifugenröhrchen durch Zentrifugation bei 8500 × g, 4 °C, für 15 Minuten gewinnen. Den Überstand abgießen und das Röhrchen mit dem Zellpellet wie im Textprotokoll beschrieben wiegen. Das bakterielle Pellet pro Liter Kultur in 150 Milliliter eiskaltem Puffer A resuspendieren.

Homogenisieren Sie die Zellen, indem Sie sie dreimal durch einen Zellzerreißer in einem auf vier Grad Celsius gekühlten Raum leiten, um die meisten Bakterien zu lysieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 14.000 × g für 15 Minuten.

Anschießend den Überstand abpipettieren und in ein sauberes Zentrifugenröhrchen übertragen. Nach der Zentrifugation des Überstands bei 168.000 × g für eine Stunde den Überstand vorsichtig abgießen, ohne das Membran-Pellet zu stören. Das Membran-Pellet aus einem Liter Kultur gewinnen und in Puffer A, ergänzt mit 10 % Glycerin, auf ein Endvolumen von 50 Milliliter resuspendieren.

Fügen Sie 0,5 Gramm DDM der Membransuspension hinzu und mischen Sie zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius im Nutschshüttler. Nach der Membranlösung entfernen Sie Zelltrümmer aus dem Lysat durch Zentrifugation bei 168.000 × g für eine Stunde. Bereiten Sie in der Zwischenzeit Amyloserhar vor.

Übertragen Sie drei Milliliter Harz mithilfe einer Pipette in eine leere Polypropylen-Chromatographiesäule. Waschen Sie das Harz, indem Sie dreimal jeweils 10 Säulenvolumina Wasser durchlaufen lassen, gefolgt von 10 Säulenvolumina Puffer A, der 0,5 Millimolar DDM enthält. Nach der Zentrifugation entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und überführen ihn in ein sauberes kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen.

Für die chargenweise Bindung geben Sie vorgeregeltes Amyloseresin in das kegelförmige Reagenzglas. Lassen Sie das extrahierte Protein durch zweistündiges Nuten der Mischung bei vier Grad Celsius an das Amyloseresin binden. Danach leiten Sie die gesamte Suspension über eine Chromatographiesäule und sammeln den Durchlauf.

Verdünnen Sie das GLIC-Protein mit 10 Milliliter Puffer A, der 40 Millimolar Maltose sowie 0,5 Millimolar DDM und 0,5 Millimolar TCEP enthält. TCEP verhindert die Oxidation von Cystein-Seitenketten. Sammeln Sie das gesamte Eluat.

Konzentrieren Sie das eluierte Protein mithilfe eines Zentrifugal-Konzentrators auf vier bis sechs Milligramm pro Milliliter. Geben Sie HRV 3C-Protease hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Um eine gezielte Spin-Markierung durchzuführen, geben Sie zunächst einen zehnfachen molaren Überschuss des MTSL-Spin-Labels zum proteaseverdauten Probenmaterial hinzu, um ein molares Verhältnis von GLIC-Monomer zu MTSL von 1:10 zu erreichen.

Nach einer einstündigen Inkubation weitere Spin-Markierung im fünffachen molaren Überschuss hinzufügen und eine weitere Stunde inkubieren. Die Probe über eine mit Puffer A und 0,5 Millimolar DDM vorgleichgestellte Größenausschluss-Fast-Protein-Flüssigchromatographie (FPLC)-Säule laufen lassen, um den gespaltenen MBP-Tag und die überschüssige freie Spin-Markierung von den GLIC-Pentameren zu trennen. Die Proteinkonzentration mit einem Zentrifugal-Konzentrator auf eine Endkonzentration von etwa acht bis zehn Milligramm pro Milliliter anreichern und auf Eis stellen.

Die Probe ist nun bereit zur Rekonstitution. Zum Herstellen der Liposomen spülen Sie einen sauberen 25-Milliliter-Rundkolben mit fünf Millilitern Chloroform aus und trocknen Sie den Kolben im Strom von Stickstoffgas im Abzug. Anschließend überführen Sie 10 Milligramm Asolectin in den Kolben und trocknen die Lipide unter kontinuierlichem Stickstoffgasstrom.

Nachdem das Chloroform verdunstet ist, stellen Sie den Kolben eine Stunde lang unter Vakuum, um eine vollständige Trocknung sicherzustellen. Geben Sie dann einen Milliliter Rekonstitutionspuffer A zu dem getrockneten Lipid und wirbeln Sie den Kolben kräftig, um den Lipidpellet in Suspension zu bringen. Um kleine unilamelläre Vesikel herzustellen, beschallen Sie die Lipidsuspension in einem Kältebad-Beschallungsgerät, bis die Vesikellösung mehr oder weniger durchscheinend wird und keine Klumpen mehr zu erkennen sind.

Zugeben von DDM zu dieser Mischung bis zu einer Endkonzentration von vier Millimolar und Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Zum Rekonstituieren des Proteins das gereinigte Protein der Lipidmischung hinzufügen. Nach einer Inkubation der Probe bei vier Grad Celsius für eine Stunde unter sanfter Rotation die Probe mit Puffer A auf 15 Milliliter verdünnen. Den restlichen Detergens in der Suspension mithilfe von Polystyrolkügelchen mit hydrophoben Poren entfernen, die Detergens einfangen.

Fügen Sie 80 Milligramm saubere Perlen hinzu und inkubieren Sie die Liposomen-Suspension über Nacht auf einem Nutor bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie am nächsten Tag die Liposomen mit einem Säulenfilter in ein 25-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen, um die Perlen zu entfernen, und verdünnen Sie die Probe anschließend auf 25 Milliliter. Nach der Zentrifugation der Proben bei 168.000 × g für zwei Stunden gießen Sie das Überstand ab und resuspendieren das Pellet mit 100 Mikrolitern Puffer B. Um die kontinuierliche Wellen-EPR-Spektroskopie durchzuführen, übertragen Sie zunächst die Liposomen-Suspension in ein 200-Mikroliter-Röhrchen und pelletieren die Proben mittels Zentrifugation.

Nach dem Verwerfen des Überstandes ist die Probe bereit für die EPR-Messungen. Entfernen Sie so viel Puffer wie möglich aus der Liposomenprobe. Um einen Pufferaustausch durchzuführen, überführen Sie 20 Mikroliter des Liposomenpellets mit einer Pipette in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Gebe 180 µL Puffer D hinzu und inkubiere fünf Minuten bei 42 °C. Zentrifugiere die Probe, entferne den Überstand mit einer Pipette und wiederhole den Vorgang dreimal, um einen vollständigen Pufferaustausch sicherzustellen. Gasdurchlässige Kunststoffkapillaren eignen sich für die Messung sowohl der Spektrallinienformen als auch der Lösungsmittelzugänglichkeit.

Tippen Sie die Kapillare auf das pelletierte Proteoliposom, um die Probe einzusaugen, und verschließen Sie das Ende mit Knochenwachs. Gezeigt ist die biochemische Charakterisierung von spin-markierten GLIC-Mutanten mittels des Gelfiltrationschromatogramms von spin-markiertem GLIC nach proteolytischem Spalten des MBP-Tags. Die Peaks entsprechen dem GLIC-Pentamer und freiem MBP.

Das SDS-Page-Gel zeigt das nicht gespaltene monomere GLIC-MBP-Fusionsprotein vor der Gelfiltration sowie die aus der Gelfiltration gewonnenen MBP- und GLIC-Fraktionen. Es wurde ein FRET-basierter Assay zur Überwachung des Aggregationszustands von in verschiedene Membranlipide rekonstituiertem GLIC durchgeführt. FRET-Messungen wurden an Proben nach einer Übernacht-Rekonstitution und nach mehreren Zyklen des Einfrierens und Auftauens der Proben durchgeführt.

In einem inside-out-Patch, der aus rekonstituierten Asolecin-Vesikeln präpariert wurde, wird GLIC durch pH-Sprünge mittels eines schnellen Lösungswechslers aktiviert. Die Kanäle aktivieren sich innerhalb von etwa 10 Millisekunden und desensibilisieren mit einer Zeitkonstante von einer bis drei Sekunden. Während der Kanalaktivierung werden strukturelle Umbaumaßnahmen beobachtet.

Hier verschieben sich bei einem Position in der porenbildenden M2-Helix die kontinuierlichen Wellen-Elektronenparamagnetismus-Resonanzspektren in Amplitude und blinde Formen als Reaktion auf pH-Änderungen. Die EPR-Spektroskopie ist ein einzigartiger struktureller Ansatz, um konformationelle Veränderungen von Membranproteinen in unserer nativen Umgebung zu messen, und bietet Einblicke in molekulare Details der Proteindynamik, die in hochauflösenden Röntgenstrukturen oder Kryo-EM-Strukturen verborgen bleiben. Bei der Arbeit mit dieser Technik ist es wichtig, im Hinterkopf zu behalten, dass Mutationen häufig zu einer geringen und schlechten oligomeren Stabilität des Proteins führen.

Daher müssen Sie möglicherweise eine Strategie entwickeln, um diesen Problemen entgegenzuwirken. Die Kombination dieser Ergebnisse aus den EPR-Studien mit funktionellen Messungen kann uns ein vollständigeres Bild für die Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung liefern, und zukünftige technologische Fortschritte zielen darauf ab, diesen leistungsfähigen Ansatz zur Untersuchung komplexerer menschlicher Kanäle unter anspruchsvolleren Lipidbedingungen zu nutzen.