Name: Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Erfahren Sie die Reinigung, Spin-Labeling und Rekonstitution pentamerer ligandengesteuerter Ionenkanäle für EPR-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Membranproteindynamik in physiologischen Umgebungen.

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Wir sind sehr dankbar, dass die aktuellen und ehemaligen Mitglieder des Chakrapani Labor für das kritische Lesen und Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grant (1R01GM108921) und der American Heart Association (NCRP Scientist Entwicklungszuschuss 12SDG12070069) und SC unterstützt.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

EPR-Spektroskopie hat sich als beispiellos strukturellen Ansatz zu sein, bei der Quantifizierung von Konformationsänderungen in Membranproteinen in einer nahezu nativen Umgebung. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, einen Blick in die molekularen Details der Proteindynamik, die in der hochauflösenden Strukturen von Röntgenkristallographie und Kryo-Elektronenmikroskopie verdeckt sind. Allerdings ist es wichtig, die technischen Grenzen dieses Ansatzes zu berücksichtigen, die die allgemeine Anwendbarkeit auf andere Systeme bee...

durch Scharen von hochaufgelösten Strukturen von mehreren Mitgliedern der Familie im Laufe der letzten zehn Jahre, das strukturelle Verständnis von pentamerem ligandengesteuerten Ionenkanäle (pLGIC) hat sprunghaft gewachsen. Wichtige Faktoren, die zu den aktuellen Entwicklungen auf dem Gebiet geführt sind, die Entdeckung von prokaryotischen pLGIC Kanäle, 1-3 großen Fortschritte in der Expression eukaryotischen Membranprotein, 4-6 und enorme Durchbrüche in der Strukturbestimmung Ansätze. 7 Diese Strukturen auf einen klaren Konsens schaffen die Gesamt Erhaltung der dreidimensionalen Architektur pLGIC. Allerdings sind zwei wichtige Bereiche, die sich hinter nachlaufen scheinen, sind die funktionelle Charakterisierung dieser Kanal Vorbereitungen und die mechanistische Beschreibung der Kanalfunktion. Gating Konformationsänderungen sind komplex und treten über eine 60 Å Abstand entlang der Länge des Kanals und diese Übergänge werden in großem Umfang moduliert durchMembranlipiden. Insbesondere negativen Lipiden, Cholesterin und Phospholipide wurden , um die Funktion der pLGIC 8-11 zu modulieren gezeigt. Während die genaue Rolle dieser Lipidbestand in Kanalfunktion unbekannt bleibt, würde eine vollständige molekulare Verständnis der Gating diese Kanäle in ihrer natürlichen Umgebung zu studieren. Site-ESR-Spektroskopie (SDSL) und Elektronenspinresonanz (EPR) -Spektroskopie sind die Techniken der Wahl für die Proteindynamik in rekonstituierten Systemen zu studieren. EPR-Spektroskopie wird durch die Molekülgröße (wie NMR) oder die optische Eigenschaft der Probe (wie Fluoreszenzspektroskopie) und dadurch ermöglicht Messungen von Volllängen-Konstrukten rekonstituiert in nativen Lipid Bedingungen beschränkt. Die Technik ist extrem empfindlich und relativ geringen Probenanforderungen (im pico-Mol-Bereich). Beide Aspekte machen die Technik gut geeignet für die Untersuchung großer Membranproteine, die schwer über Milligramm auszudrücken inMengen. Die Verwendung von EPR - Spektroskopie in Kombination mit ortsgerichtete Spinmarkierung wurde von Wayne Hubbell und Kollegen entwickelt und wurde für die Untersuchung einer Reihe von Proteinarten angepasst. 12-24 EPR - Daten verwendet wurden , Sekundärstrukturen, Veränderungen in dem Protein zu untersuchen , Konformation, membran Einstecktiefen und Protein-Protein / Protein-Ligand-Wechselwirkungen. Das Verfahren beinhaltet das an den Positionen von Interesse durch ortsgerichtete Mutagenese Cystein-Substitution. Um die ortsspezifische Markierung zu gewährleisten, ist es notwendig , nativen Cysteinen mit einer anderen Aminosäure zu ersetzen (z. B. Serin) ein Cystein-weniger Vorlage zu erstellen. Bei weitem ist die beliebteste Spin-Label eine Thiol-spezifische MTSL: (1-oxyl-2,2,5,5-Tetramethyl-Δ3-pyrrolin-3-methyl) Methanthiosulfonat, die durch eine Disulfidbrücke Brücke an das Protein misst. Aufgrund seiner hohen Spezifität, relativ geringe Größe (etwas größer als Tryptophan) und flexikeit des Linkers Region hat sich diese Spin-Label mit einer vergrabenen Cystein sogar ausgezeichnete Reaktivität haben gezeigt worden. Weiterhin Reaktivität zu maximieren, die Markierungsreaktion des Proteins in Detergens-solubilisierten Form. Nach der Abtrennung des überschüssigen Chromatographie Gratis-Spin-Label durch Größenausschluss wird das Protein in Liposomen oder Doppelschicht-ähnlichen Systeme von definierten Lipidzusammensetzung rekonstituiert. Im allgemeinen wird Cystein Mutagenese auch in den meisten Teilen des Proteins toleriert, und die verhältnismäßig geringe Größe der Spin-Sonde verursacht minimale Störung der Sekundär- und Tertiärstrukturen. Um sicherzustellen, dass die Modifikation Wildtyp Funktionen beibehalten, die markierten und rekonstituiert Kanäle können durch Patch-Clamp-Messungen untersucht werden. Das markierte funktionellen Protein wird dann zu spektroskopischen Messungen unterzogen, die drei Arten von Informationen im Wesentlichen liefern: 12,14,15,20,22,23,25-27 Spinsondendynamik durch lineshAffe Analyse; Zugänglichkeit der Sonde an paramagnetischem Entspannungsmittel; und Abstandsverteilung. 27 EPR Abstände werden durch zwei verschiedene Methoden gemessen. Die erste basiert auf dem Continuous Wave (CW) Technik, bei der spektrale Verbreiterung von dipolaren Wechselwirkungen zwischen Spin-Labels (in der von 8 - 20 Å Entfernungsbereich) entstehen. Verwendet wird Entfernung zu bestimmen 28,29 Die zweite ist eine gepulste EPR Verfahren , bei dem Abstandsmessungen bis 70 Å verlängert werden kann. 30-34 im Doppel Electron Electron Resonanz (DEER), Schwingungen in der Spin-Echo - Amplitude analysiert Abstände und Abstandsverteilungen zu bestimmen. Hier wird das Spin-Echo bei der Frequenz der dipolaren Wechselwirkung moduliert. Gemeinsam werden diese Parameter verwendet, um Protein-Topologie, Sekundärstrukturelemente und Protein-Konformationsänderungen zu bestimmen.

<table><tbody><tr><td>Lokalgerichtete Mutagenese und Cys-Mutationen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PfuUltra HF-Reaktionspuffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-52</td><td></td></tr><tr><td>dNTPS</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>N0447L</td><td>10 mM pro dNTP</td></tr><tr><td>pfu Ultra DNA-Polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-51</td><td>2,5 U/ul</td></tr><tr><td>DPNI</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>R0176S</td><td>20.000 U/ml</td></tr><tr><td>XL10 GOLD</td><td>Agilent Technologies</td><td>200314 SOC-Medien</td><td></td></tr><tr><td></td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP905</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium</td><td>Invitrogen</td><td>127957084</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>C43 kompetente Zellen</td><td>Lucigen</td><td>60446</td><td></td></tr><tr><td>Expression und Reinigung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Fisher Scientfic</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Amresco</td><td>J850</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0705</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0781</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl-Thio-&Beta;-Galactosid)</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Life Science</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Life Science</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Amresco</td><td>M145</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptine</td><td>Amresco</td><td>J580</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Amresco</td><td>J583</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-&beta;-D-Maltopyranosid)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Amylose-Harz</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Amresco</td><td>K831</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Acros Organics</td><td>329915000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr><tr><td>Leere Polypropylen-Chromatographiesäule</td><td>BioRad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>Ortsgerichtete Spin-Markierung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrrolin-3-methyl) Methanethiosulfonat</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-& Delta; 3-Pyrrolin-3-methyl)methanethiosulfonat</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>A167900</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>Rekonstitution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asolectin-Lipid</td><td>Avanti polare Lipide Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads (Polystyrin-Kügelchen)</td><td>Bio Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemikalien</td><td>A413</td><td></td></tr><tr><td>FRET</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-maleimid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin-maleimid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T-6027</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti polare Lipide Inc</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti polare Lipide Inc</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td> E.coli polarer Lipidextrakt</td><td>Avanti polare Lipide Inc</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EPR-Messung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPX Kunststoffkapillaren</td><td>Bruker</td><td>ER221</td><td></td></tr><tr><td>EDDA (Ethylendiamin-N, N'-Diessigsäure)</td><td>Aldrich</td><td>158186</td><td></td></tr><tr><td>Ni(OH)2</td><td>Aldrich</td><td>283622</td><td></td></tr></tbody></table>

site-directed spin labeling und epr-spektroskopischen untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten ionenkanäle

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ionenkanal-Gating ist eine stimulusgesteuerte Orchestrierung von Proteinbewegungen, die zu Übergängen zwischen geschlossenen, offenen und desensibilisierten Zuständen führt. Grundlegend für diese Übergänge ist die intrinsische Flexibilität des Proteins, die entscheidend durch die Lipidzusammensetzung der Membran moduliert wird. Um die strukturellen Grundlagen der Kanalfunktion besser zu verstehen, ist es notwendig, die Proteindynamik in einer physiologischen Membranumgebung zu untersuchen. Die Spektroskopie der Elektronenparamagnetischen Resonanz (EPR) ist ein wichtiges Werkzeug zur Charakterisierung von Konformationsübergängen zwischen funktionellen Zuständen. Im Vergleich zur NMR und Röntgenkristallographie sind die aus dem EPR gewonnenen Informationen von Natur aus von geringerer Auflösung. Im Gegensatz zu anderen Techniken gibt es bei der EPR jedoch keine Obergrenze für das Molekulargewicht des Proteins, der Probenbedarf ist deutlich geringer und vor allem ist das Protein nicht durch die Kristallgitterkräfte eingeschränkt. Daher eignet sich EPR hervorragend für die Untersuchung großer Proteinkomplexe und Proteine in rekonstituierten Systemen. In diesem Artikel werden wir allgemeine Protokolle für die ortsgerichtete Spinmarkierung und Membranrekonstitution am Beispiel eines prokaryotischen protonengesteuerten pentamerischen Liganden-gesteuerten Ionenkanals (pLGIC) aus Gloeobacter violaceus (GLIC) diskutieren. Es wird eine Kombination aus stationären kontinuierlichen (CW) und gepulsten (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR-Ansätzen beschrieben, die eine vollständige quantitative Charakterisierung der Kanaldynamik ermöglicht.

Biochemische Charakterisierung von Spin-markierten GLIC Mutants Nach dem oben beschriebenen Protokoll würde typischerweise GLIC-MBP-Fusionsprotein in dem Bereich von 10 ergeben - 12 mg / l Kultur. Obwohl dieser Wert in den verschiedenen Mutanten unterscheiden können, besonders für innerhalb des Proteins verborgen Positionen kann die Ausbeute erheblich beeinträchtigt werden. In diesen Fällen kann es erforderlic...

Dieser Artikel beschreibt Methoden zur ortsgerichteten Spinmarkierung und Rekonstitution von pentameren ligandengesteuerten Kanälen für Elektronen-Paramagnetische Resonanzstudien. Dieses Protokoll kann für jedes Membranprotein angepasst werden. Die hier beschriebene Rekonstitutionsmethode kann auch für Patch-Clamp-Messungen von makroskopischen und einkanaligen Strömen in einem definierten Lipidsystem verwendet werden.

Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Reinigung, die gezielte Spinmarkierung und die Rekonstitution eines pentameren ligandengesteuerten Kanals für Untersuchungen mittels Elektronenspinresonanz zu demonstrieren. Die Untersuchung der Dynamik von Membranproteinen in einem physiologisch relevanten Umfeld ist entscheidend, um vollständig zu verstehen, wie dieses Membrantransportprotein funktioniert. Und aufgrund dieser Anforderungen halte ich die gezielte Spinmarkierung in Kombination mit der EPR-Technik für besonders geeignet.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nicht durch die Größe des Proteins begrenzt ist. Daher wäre die gezielte Spinmarkierung in Kombination mit der EPR-Spektroskopie die Methode der Wahl, wenn Sie die Dynamik großer Proteine oder in Membranen rekonstituierte Proteine untersuchen möchten. Führen Sie einzelne Cystein-Mutationen im GLIC-Gen mittels gezielter Mutagenese ein.Stellen Sie eine Übernachtkultur des GLIC-Cystein-Mutanten wie im Textprotokoll beschrieben her. Geben Sie anschließend 100 Milliliter steriles Kaliumphosphatpuffer in das autoklavierte Terrific-Broth-Medium. Fügen Sie dann sterile Glukose, Kanamycin und 10 Milliliter der Übernachtkultur hinzu.Bei 37 Grad Celsius in einem Schüttler bei 250 U/min inkubieren. 50 Milliliter Glycerin zugeben und die Kultur weiter schütteln, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 1,0 bis 1,2 erreicht. Nach der Induktion der Zellen mit 200 µM IPTG den Schüttler auf 250 U/min zurückstellen und weitere etwa 16 Stunden bei 18 Grad Celsius inkubieren.Die Zellen in Ein-Liter-Zentrifugenröhrchen durch Zentrifugation bei 8500 × g, 4 °C, für 15 Minuten gewinnen. Den Überstand abgießen und das Röhrchen mit dem Zellpellet wie im Textprotokoll beschrieben wiegen. Das bakterielle Pellet pro Liter Kultur in 150 Milliliter eiskaltem Puffer A resuspendieren.Homogenisieren Sie die Zellen, indem Sie sie dreimal durch einen Zellzerreißer in einem auf vier Grad Celsius gekühlten Raum leiten, um die meisten Bakterien zu lysieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 14.000 × g für 15 Minuten.Anschießend den Überstand abpipettieren und in ein sauberes Zentrifugenröhrchen übertragen. Nach der Zentrifugation des Überstands bei 168.000 × g für eine Stunde den Überstand vorsichtig abgießen, ohne das Membran-Pellet zu stören. Das Membran-Pellet aus einem Liter Kultur gewinnen und in Puffer A, ergänzt mit 10 % Glycerin, auf ein Endvolumen von 50 Milliliter resuspendieren.Fügen Sie 0,5 Gramm DDM der Membransuspension hinzu und mischen Sie zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius im Nutschshüttler. Nach der Membranlösung entfernen Sie Zelltrümmer aus dem Lysat durch Zentrifugation bei 168.000 × g für eine Stunde. Bereiten Sie in der Zwischenzeit Amyloserhar vor.Übertragen Sie drei Milliliter Harz mithilfe einer Pipette in eine leere Polypropylen-Chromatographiesäule. Waschen Sie das Harz, indem Sie dreimal jeweils 10 Säulenvolumina Wasser durchlaufen lassen, gefolgt von 10 Säulenvolumina Puffer A, der 0,5 Millimolar DDM enthält. Nach der Zentrifugation entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und überführen ihn in ein sauberes kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen.Für die chargenweise Bindung geben Sie vorgeregeltes Amyloseresin in das kegelförmige Reagenzglas. Lassen Sie das extrahierte Protein durch zweistündiges Nuten der Mischung bei vier Grad Celsius an das Amyloseresin binden. Danach leiten Sie die gesamte Suspension über eine Chromatographiesäule und sammeln den Durchlauf.Verdünnen Sie das GLIC-Protein mit 10 Milliliter Puffer A, der 40 Millimolar Maltose sowie 0,5 Millimolar DDM und 0,5 Millimolar TCEP enthält. TCEP verhindert die Oxidation von Cystein-Seitenketten. Sammeln Sie das gesamte Eluat.Konzentrieren Sie das eluierte Protein mithilfe eines Zentrifugal-Konzentrators auf vier bis sechs Milligramm pro Milliliter. Geben Sie HRV 3C-Protease hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Um eine gezielte Spin-Markierung durchzuführen, geben Sie zunächst einen zehnfachen molaren Überschuss des MTSL-Spin-Labels zum proteaseverdauten Probenmaterial hinzu, um ein molares Verhältnis von GLIC-Monomer zu MTSL von 1:10 zu erreichen.Nach einer einstündigen Inkubation weitere Spin-Markierung im fünffachen molaren Überschuss hinzufügen und eine weitere Stunde inkubieren. Die Probe über eine mit Puffer A und 0,5 Millimolar DDM vorgleichgestellte Größenausschluss-Fast-Protein-Flüssigchromatographie (FPLC)-Säule laufen lassen, um den gespaltenen MBP-Tag und die überschüssige freie Spin-Markierung von den GLIC-Pentameren zu trennen. Die Proteinkonzentration mit einem Zentrifugal-Konzentrator auf eine Endkonzentration von etwa acht bis zehn Milligramm pro Milliliter anreichern und auf Eis stellen.Die Probe ist nun bereit zur Rekonstitution. Zum Herstellen der Liposomen spülen Sie einen sauberen 25-Milliliter-Rundkolben mit fünf Millilitern Chloroform aus und trocknen Sie den Kolben im Strom von Stickstoffgas im Abzug. Anschließend überführen Sie 10 Milligramm Asolectin in den Kolben und trocknen die Lipide unter kontinuierlichem Stickstoffgasstrom.Nachdem das Chloroform verdunstet ist, stellen Sie den Kolben eine Stunde lang unter Vakuum, um eine vollständige Trocknung sicherzustellen. Geben Sie dann einen Milliliter Rekonstitutionspuffer A zu dem getrockneten Lipid und wirbeln Sie den Kolben kräftig, um den Lipidpellet in Suspension zu bringen. Um kleine unilamelläre Vesikel herzustellen, beschallen Sie die Lipidsuspension in einem Kältebad-Beschallungsgerät, bis die Vesikellösung mehr oder weniger durchscheinend wird und keine Klumpen mehr zu erkennen sind.Zugeben von DDM zu dieser Mischung bis zu einer Endkonzentration von vier Millimolar und Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Zum Rekonstituieren des Proteins das gereinigte Protein der Lipidmischung hinzufügen. Nach einer Inkubation der Probe bei vier Grad Celsius für eine Stunde unter sanfter Rotation die Probe mit Puffer A auf 15 Milliliter verdünnen. Den restlichen Detergens in der Suspension mithilfe von Polystyrolkügelchen mit hydrophoben Poren entfernen, die Detergens einfangen.Fügen Sie 80 Milligramm saubere Perlen hinzu und inkubieren Sie die Liposomen-Suspension über Nacht auf einem Nutor bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie am nächsten Tag die Liposomen mit einem Säulenfilter in ein 25-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen, um die Perlen zu entfernen, und verdünnen Sie die Probe anschließend auf 25 Milliliter. Nach der Zentrifugation der Proben bei 168.000 × g für zwei Stunden gießen Sie das Überstand ab und resuspendieren das Pellet mit 100 Mikrolitern Puffer B. Um die kontinuierliche Wellen-EPR-Spektroskopie durchzuführen, übertragen Sie zunächst die Liposomen-Suspension in ein 200-Mikroliter-Röhrchen und pelletieren die Proben mittels Zentrifugation.Nach dem Verwerfen des Überstandes ist die Probe bereit für die EPR-Messungen. Entfernen Sie so viel Puffer wie möglich aus der Liposomenprobe. Um einen Pufferaustausch durchzuführen, überführen Sie 20 Mikroliter des Liposomenpellets mit einer Pipette in ein Mikrozentrifugenröhrchen.Gebe 180 µL Puffer D hinzu und inkubiere fünf Minuten bei 42 °C. Zentrifugiere die Probe, entferne den Überstand mit einer Pipette und wiederhole den Vorgang dreimal, um einen vollständigen Pufferaustausch sicherzustellen. Gasdurchlässige Kunststoffkapillaren eignen sich für die Messung sowohl der Spektrallinienformen als auch der Lösungsmittelzugänglichkeit. Tippen Sie die Kapillare auf das pelletierte Proteoliposom, um die Probe einzusaugen, und verschließen Sie das Ende mit Knochenwachs. Gezeigt ist die biochemische Charakterisierung von spin-markierten GLIC-Mutanten mittels des Gelfiltrationschromatogramms von spin-markiertem GLIC nach proteolytischem Spalten des MBP-Tags. Die Peaks entsprechen dem GLIC-Pentamer und freiem MBP.Das SDS-Page-Gel zeigt das nicht gespaltene monomere GLIC-MBP-Fusionsprotein vor der Gelfiltration sowie die aus der Gelfiltration gewonnenen MBP- und GLIC-Fraktionen. Es wurde ein FRET-basierter Assay zur Überwachung des Aggregationszustands von in verschiedene Membranlipide rekonstituiertem GLIC durchgeführt. FRET-Messungen wurden an Proben nach einer Übernacht-Rekonstitution und nach mehreren Zyklen des Einfrierens und Auftauens der Proben durchgeführt.In einem inside-out-Patch, der aus rekonstituierten Asolecin-Vesikeln präpariert wurde, wird GLIC durch pH-Sprünge mittels eines schnellen Lösungswechslers aktiviert. Die Kanäle aktivieren sich innerhalb von etwa 10 Millisekunden und desensibilisieren mit einer Zeitkonstante von einer bis drei Sekunden. Während der Kanalaktivierung werden strukturelle Umbaumaßnahmen beobachtet.Hier verschieben sich bei einem Position in der porenbildenden M2-Helix die kontinuierlichen Wellen-Elektronenparamagnetismus-Resonanzspektren in Amplitude und blinde Formen als Reaktion auf pH-Änderungen. Die EPR-Spektroskopie ist ein einzigartiger struktureller Ansatz, um konformationelle Veränderungen von Membranproteinen in unserer nativen Umgebung zu messen, und bietet Einblicke in molekulare Details der Proteindynamik, die in hochauflösenden Röntgenstrukturen oder Kryo-EM-Strukturen verborgen bleiben. Bei der Arbeit mit dieser Technik ist es wichtig, im Hinterkopf zu behalten, dass Mutationen häufig zu einer geringen und schlechten oligomeren Stabilität des Proteins führen.Daher müssen Sie möglicherweise eine Strategie entwickeln, um diesen Problemen entgegenzuwirken. Die Kombination dieser Ergebnisse aus den EPR-Studien mit funktionellen Messungen kann uns ein vollständigeres Bild für die Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehung liefern, und zukünftige technologische Fortschritte zielen darauf ab, diesen leistungsfähigen Ansatz zur Untersuchung komplexerer menschlicher Kanäle unter anspruchsvolleren Lipidbedingungen zu nutzen.

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Erfahren Sie die Reinigung, Spin-Labeling und Rekonstitution pentamerer ligandengesteuerter Ionenkanäle für EPR-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Membranproteindynamik in physiologischen Umgebungen.

Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

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