Name: Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Erfahren Sie die Reinigung, Spin-Labeling und Rekonstitution pentamerer ligandengesteuerter Ionenkanäle für EPR-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Membranproteindynamik in physiologischen Umgebungen.

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Wir sind sehr dankbar, dass die aktuellen und ehemaligen Mitglieder des Chakrapani Labor für das kritische Lesen und Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grant (1R01GM108921) und der American Heart Association (NCRP Scientist Entwicklungszuschuss 12SDG12070069) und SC unterstützt.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

EPR-Spektroskopie hat sich als beispiellos strukturellen Ansatz zu sein, bei der Quantifizierung von Konformationsänderungen in Membranproteinen in einer nahezu nativen Umgebung. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, einen Blick in die molekularen Details der Proteindynamik, die in der hochauflösenden Strukturen von Röntgenkristallographie und Kryo-Elektronenmikroskopie verdeckt sind. Allerdings ist es wichtig, die technischen Grenzen dieses Ansatzes zu berücksichtigen, die die allgemeine Anwendbarkeit auf andere Systeme bee...

durch Scharen von hochaufgelösten Strukturen von mehreren Mitgliedern der Familie im Laufe der letzten zehn Jahre, das strukturelle Verständnis von pentamerem ligandengesteuerten Ionenkanäle (pLGIC) hat sprunghaft gewachsen. Wichtige Faktoren, die zu den aktuellen Entwicklungen auf dem Gebiet geführt sind, die Entdeckung von prokaryotischen pLGIC Kanäle, 1-3 großen Fortschritte in der Expression eukaryotischen Membranprotein, 4-6 und enorme Durchbrüche in der Strukturbestimmung Ansätze. 7 Diese Strukturen auf einen klaren Konsens schaffen die Gesamt Erhaltung der dreidimensionalen Architektur pLGIC. Allerdings sind zwei wichtige Bereiche, die sich hinter nachlaufen scheinen, sind die funktionelle Charakterisierung dieser Kanal Vorbereitungen und die mechanistische Beschreibung der Kanalfunktion. Gating Konformationsänderungen sind komplex und treten über eine 60 Å Abstand entlang der Länge des Kanals und diese Übergänge werden in großem Umfang moduliert durchMembranlipiden. Insbesondere negativen Lipiden, Cholesterin und Phospholipide wurden , um die Funktion der pLGIC 8-11 zu modulieren gezeigt. Während die genaue Rolle dieser Lipidbestand in Kanalfunktion unbekannt bleibt, würde eine vollständige molekulare Verständnis der Gating diese Kanäle in ihrer natürlichen Umgebung zu studieren. Site-ESR-Spektroskopie (SDSL) und Elektronenspinresonanz (EPR) -Spektroskopie sind die Techniken der Wahl für die Proteindynamik in rekonstituierten Systemen zu studieren. EPR-Spektroskopie wird durch die Molekülgröße (wie NMR) oder die optische Eigenschaft der Probe (wie Fluoreszenzspektroskopie) und dadurch ermöglicht Messungen von Volllängen-Konstrukten rekonstituiert in nativen Lipid Bedingungen beschränkt. Die Technik ist extrem empfindlich und relativ geringen Probenanforderungen (im pico-Mol-Bereich). Beide Aspekte machen die Technik gut geeignet für die Untersuchung großer Membranproteine, die schwer über Milligramm auszudrücken inMengen. Die Verwendung von EPR - Spektroskopie in Kombination mit ortsgerichtete Spinmarkierung wurde von Wayne Hubbell und Kollegen entwickelt und wurde für die Untersuchung einer Reihe von Proteinarten angepasst. 12-24 EPR - Daten verwendet wurden , Sekundärstrukturen, Veränderungen in dem Protein zu untersuchen , Konformation, membran Einstecktiefen und Protein-Protein / Protein-Ligand-Wechselwirkungen. Das Verfahren beinhaltet das an den Positionen von Interesse durch ortsgerichtete Mutagenese Cystein-Substitution. Um die ortsspezifische Markierung zu gewährleisten, ist es notwendig , nativen Cysteinen mit einer anderen Aminosäure zu ersetzen (z. B. Serin) ein Cystein-weniger Vorlage zu erstellen. Bei weitem ist die beliebteste Spin-Label eine Thiol-spezifische MTSL: (1-oxyl-2,2,5,5-Tetramethyl-Δ3-pyrrolin-3-methyl) Methanthiosulfonat, die durch eine Disulfidbrücke Brücke an das Protein misst. Aufgrund seiner hohen Spezifität, relativ geringe Größe (etwas größer als Tryptophan) und flexikeit des Linkers Region hat sich diese Spin-Label mit einer vergrabenen Cystein sogar ausgezeichnete Reaktivität haben gezeigt worden. Weiterhin Reaktivität zu maximieren, die Markierungsreaktion des Proteins in Detergens-solubilisierten Form. Nach der Abtrennung des überschüssigen Chromatographie Gratis-Spin-Label durch Größenausschluss wird das Protein in Liposomen oder Doppelschicht-ähnlichen Systeme von definierten Lipidzusammensetzung rekonstituiert. Im allgemeinen wird Cystein Mutagenese auch in den meisten Teilen des Proteins toleriert, und die verhältnismäßig geringe Größe der Spin-Sonde verursacht minimale Störung der Sekundär- und Tertiärstrukturen. Um sicherzustellen, dass die Modifikation Wildtyp Funktionen beibehalten, die markierten und rekonstituiert Kanäle können durch Patch-Clamp-Messungen untersucht werden. Das markierte funktionellen Protein wird dann zu spektroskopischen Messungen unterzogen, die drei Arten von Informationen im Wesentlichen liefern: 12,14,15,20,22,23,25-27 Spinsondendynamik durch lineshAffe Analyse; Zugänglichkeit der Sonde an paramagnetischem Entspannungsmittel; und Abstandsverteilung. 27 EPR Abstände werden durch zwei verschiedene Methoden gemessen. Die erste basiert auf dem Continuous Wave (CW) Technik, bei der spektrale Verbreiterung von dipolaren Wechselwirkungen zwischen Spin-Labels (in der von 8 - 20 Å Entfernungsbereich) entstehen. Verwendet wird Entfernung zu bestimmen 28,29 Die zweite ist eine gepulste EPR Verfahren , bei dem Abstandsmessungen bis 70 Å verlängert werden kann. 30-34 im Doppel Electron Electron Resonanz (DEER), Schwingungen in der Spin-Echo - Amplitude analysiert Abstände und Abstandsverteilungen zu bestimmen. Hier wird das Spin-Echo bei der Frequenz der dipolaren Wechselwirkung moduliert. Gemeinsam werden diese Parameter verwendet, um Protein-Topologie, Sekundärstrukturelemente und Protein-Konformationsänderungen zu bestimmen.

<table><tbody><tr><td>Lokalgerichtete Mutagenese und Cys-Mutationen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PfuUltra HF-Reaktionspuffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-52</td><td></td></tr><tr><td>dNTPS</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>N0447L</td><td>10 mM pro dNTP</td></tr><tr><td>pfu Ultra DNA-Polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-51</td><td>2,5 U/ul</td></tr><tr><td>DPNI</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>R0176S</td><td>20.000 U/ml</td></tr><tr><td>XL10 GOLD</td><td>Agilent Technologies</td><td>200314 SOC-Medien</td><td></td></tr><tr><td></td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP905</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium</td><td>Invitrogen</td><td>127957084</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>C43 kompetente Zellen</td><td>Lucigen</td><td>60446</td><td></td></tr><tr><td>Expression und Reinigung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Fisher Scientfic</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Amresco</td><td>J850</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0705</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0781</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl-Thio-&Beta;-Galactosid)</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Life Science</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Life Science</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Amresco</td><td>M145</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptine</td><td>Amresco</td><td>J580</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Amresco</td><td>J583</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-&beta;-D-Maltopyranosid)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Amylose-Harz</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Amresco</td><td>K831</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Acros Organics</td><td>329915000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr><tr><td>Leere Polypropylen-Chromatographiesäule</td><td>BioRad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>Ortsgerichtete Spin-Markierung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrrolin-3-methyl) Methanethiosulfonat</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-& Delta; 3-Pyrrolin-3-methyl)methanethiosulfonat</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>A167900</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>Rekonstitution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asolectin-Lipid</td><td>Avanti polare Lipide Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads (Polystyrin-Kügelchen)</td><td>Bio Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemikalien</td><td>A413</td><td></td></tr><tr><td>FRET</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-maleimid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin-maleimid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T-6027</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti polare Lipide Inc</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti polare Lipide Inc</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td> E.coli polarer Lipidextrakt</td><td>Avanti polare Lipide Inc</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EPR-Messung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPX Kunststoffkapillaren</td><td>Bruker</td><td>ER221</td><td></td></tr><tr><td>EDDA (Ethylendiamin-N, N'-Diessigsäure)</td><td>Aldrich</td><td>158186</td><td></td></tr><tr><td>Ni(OH)2</td><td>Aldrich</td><td>283622</td><td></td></tr></tbody></table>

site-directed spin labeling und epr-spektroskopischen untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten ionenkanäle

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ionenkanal-Gating ist eine stimulusgesteuerte Orchestrierung von Proteinbewegungen, die zu Übergängen zwischen geschlossenen, offenen und desensibilisierten Zuständen führt. Grundlegend für diese Übergänge ist die intrinsische Flexibilität des Proteins, die entscheidend durch die Lipidzusammensetzung der Membran moduliert wird. Um die strukturellen Grundlagen der Kanalfunktion besser zu verstehen, ist es notwendig, die Proteindynamik in einer physiologischen Membranumgebung zu untersuchen. Die Spektroskopie der Elektronenparamagnetischen Resonanz (EPR) ist ein wichtiges Werkzeug zur Charakterisierung von Konformationsübergängen zwischen funktionellen Zuständen. Im Vergleich zur NMR und Röntgenkristallographie sind die aus dem EPR gewonnenen Informationen von Natur aus von geringerer Auflösung. Im Gegensatz zu anderen Techniken gibt es bei der EPR jedoch keine Obergrenze für das Molekulargewicht des Proteins, der Probenbedarf ist deutlich geringer und vor allem ist das Protein nicht durch die Kristallgitterkräfte eingeschränkt. Daher eignet sich EPR hervorragend für die Untersuchung großer Proteinkomplexe und Proteine in rekonstituierten Systemen. In diesem Artikel werden wir allgemeine Protokolle für die ortsgerichtete Spinmarkierung und Membranrekonstitution am Beispiel eines prokaryotischen protonengesteuerten pentamerischen Liganden-gesteuerten Ionenkanals (pLGIC) aus Gloeobacter violaceus (GLIC) diskutieren. Es wird eine Kombination aus stationären kontinuierlichen (CW) und gepulsten (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR-Ansätzen beschrieben, die eine vollständige quantitative Charakterisierung der Kanaldynamik ermöglicht.

Biochemische Charakterisierung von Spin-markierten GLIC Mutants Nach dem oben beschriebenen Protokoll würde typischerweise GLIC-MBP-Fusionsprotein in dem Bereich von 10 ergeben - 12 mg / l Kultur. Obwohl dieser Wert in den verschiedenen Mutanten unterscheiden können, besonders für innerhalb des Proteins verborgen Positionen kann die Ausbeute erheblich beeinträchtigt werden. In diesen Fällen kann es erforderlic...

Dieser Artikel beschreibt Methoden zur ortsgerichteten Spinmarkierung und Rekonstitution von pentameren ligandengesteuerten Kanälen für Elektronen-Paramagnetische Resonanzstudien. Dieses Protokoll kann für jedes Membranprotein angepasst werden. Die hier beschriebene Rekonstitutionsmethode kann auch für Patch-Clamp-Messungen von makroskopischen und einkanaligen Strömen in einem definierten Lipidsystem verwendet werden.

Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Reinigung, die gezielte Spinmarkierung und die Rekonstitution eines pentameren ligandengesteuerten Kanals für Untersuchungen mittels Elektronenspinresonanz zu demonstrieren. Die Untersuchung der Dynamik von Membranproteinen in einem physiologisch relevanten Umfeld ist entscheidend, um vollständig zu verstehen, wie dieses Membrantransportprotein funktioniert. Und aufgrund dieser Anforderungen halte ich die gezielte Spinmarkierung in Kombination mit der EPR-Technik für besonders geeignet.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nicht durch die Größe des Proteins begrenzt ist. Daher wäre die gezielte Spinmarkierung in Kombination mit der EPR-Spektroskopie die Methode der Wahl, wenn Sie die Dynamik großer Proteine oder in Membranen rekonstituierte Proteine untersuchen möchten. Führen Sie einzelne Cystein-Mutationen im GLIC-Gen mittels gezielter Mutagenese ein.Stellen Sie eine Übernachtkultur des GLIC-Cystein-Mutanten wie im Textprotokoll beschrieben her. Geben Sie anschließend 100 Milliliter steriles Kaliumphosphatpuffer in das autoklavierte Terrific-Broth-Medium. Fügen Sie dann sterile Glukose, Kanamycin und 10

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Forschung

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Chemie

Wir beschreiben ein einfaches Protokoll zum Gehirn Proteine, die auf die volle Länge C-Terminus von ATP-gated P2X2-Rezeptoren binden zu identifizieren. Der Ausbau und die systematische Anwendung dieses Ansatzes auf alle P2X-Rezeptoren wird voraussichtlich zu einem besseren Verständnis der P2X-Rezeptor Signalgebung führen.

Proteomics, um Proteine ​​interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren

Wir beschreiben eine Methode, die die Kinetik von Ionen-Transport von Membranproteinen Maßnahmen neben site-spezifische Analyse von Konformationsänderungen mittels Fluoreszenz an einzelnen Zellen. Diese Technik ist anpassungsfähig an Ionenkanälen, Transportern und Ionenpumpen und kann genutzt werden, um Einschränkungen bei den Protein-Untereinheiten zu bestimmen.

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Wir genetisch kodieren die unnatürliche Aminosäure, p-Azido-L-Phenylalanin in verschiedenen gezielten Positionen in GPCRs und zeigen die Vielseitigkeit der Azidogruppe in verschiedenen Anwendungen. Dazu gehören eine gezielte Photo Technologie, um Rückstände in der Ligandenbindungstasche eines GPCR identifizieren und ortsspezifische Modifikation von GPCRs bioorthogonale mit einem Peptid-Epitop-Tag oder fluoreszierende Sonde.

Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

Ein Protokoll für hochpräzise FRET-Experimente auf der Ebene der einzelnen Moleküle wird hier vorgestellt. Zusätzlich kann diese Methodik verwendet werden, um drei Konformationszustände in der Ligandenbindungsdomäne des N-Methyl-D-aspartat (NMDA) -Rezeptors zu identifizieren. Die Bestimmung von präzisen Abständen ist der erste Schritt zum Aufbau von Strukturmodellen auf der Basis von FRET-Experimenten.

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

Dieser Artikel beschreibt bestimmte Methoden um biochemische Menge Waschmittel solubilisiert TRPV1 für spektroskopische Analyse zu erhalten. Die kombinierte Protokolle bieten Biochemische und biophysikalische Werkzeuge, die angepasst werden können, um die strukturelle und funktionelle Studien für Säugetier-Ionenkanäle in einer Membran-kontrollierten Umgebung zu erleichtern.

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Messung der Adenin-Nukleotid-Bindung an Rezeptoren in Echtzeit in einer zellulären Umgebung vor. Die Bindung wird als Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen Trinitrophenylnukleotidderivaten und Proteinen, die mit einer nicht-kanonischen, fluoreszierenden Aminosäure markiert sind, gemessen.

Messung der Nukleotidbindung an intakte, funktionelle Membranproteine in Echtzeit

Es wird ein Protokoll für die Anwendung der NMR-Spektroskopie zur Verstärkung der paramagnetischen Relaxation vorgestellt, um schwache und transiente inter- und intramolekulare Wechselwirkungen in intrinsisch ungeordneten Proteinen zu detektieren.

Paramagnetische Relaxationsverstärkung zur Detektion und Charakterisierung von Selbstassoziationen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Diese Studie stellt ein detailliertes Verfahren zur Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-Experimenten (smFRET) an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) unter Verwendung ortsspezifischer Markierung durch unnatürliche Aminosäureinkorporation (UAA) vor. Das Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Vorbereitung von smFRET-Proben, Experimente und Datenanalysen.

Visualisierung der Konformationsdynamik von Membranrezeptoren mit Einzelmolekül-FRET

Dieses Protokoll stellt die Werkzeuge vor, die für die Modellierung von niedermolekularen Liganden in KryoEM-Karten von Makromolekülen zur Verfügung stehen.

Modellierung von Liganden in Karten aus der Elektronenkryomikroskopie

Die Elektrophysiologie ist der Goldstandard für die Untersuchung der Aktivität von Ionenkanälen. Es gibt jedoch viele alternative Ansätze, einschließlich optischer Methoden. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Überwachung der Aktivität des leucinreichen Repeats mit 8 Kanälen (LRRC8)-gebildeten Anionenkanälen unter Verwendung einer auf Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basierenden Methode zwischen den Untereinheiten.

Überwachung der Leucin-reichen Repeat-haltigen 8-Kanal-Aktivität (LRRC8/VRAC) mittels sensibilisiertem Emissions-Förster-Resonanz-Energietransfer (SE-FRET)

Erfahren Sie die Reinigung, Spin-Labeling und Rekonstitution pentamerer ligandengesteuerter Ionenkanäle für EPR-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Membranproteindynamik in physiologischen Umgebungen.

Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

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