Die Erzeugung von Unreife, Ältere und Tolerogene Dendritischen Zellen mit unterschiedlichen Metabolic Phänotypen
22. Juni 2016
Unreife dendritische Zellen können selektiv in tolerogene oder reife dendritische Zellen differenziert werden, um das Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz zu regulieren. Diese Arbeit stellt eine Möglichkeit vor, aus unreifen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (moDCs) in vitro tolerogene und reife moDCs zu generieren, die sich in metabolischen Phänotypen unterscheiden.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, tolerogene und reife dendritische Zellen aus Monozyten für Experimente oder die Impfstoffentwicklung zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, indem sie ein Modell zur Untersuchung der Entwicklung, Reifung und Antigenpräsentation von dendritischen Zellen bereitstellt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Erzeugung einer großen Anzahl von dendritischen Zellen in vitro für Experimente ermöglicht.
Beginnen Sie die Monozytenanreicherung, indem Sie 20 Mikroliter einer zuvor vorbereiteten mononukleären Blutzelle oder PBMC-Zellsuspension mit 20 Mikrolitern Tripanblau mischen, um die Anzahl der lebenden Zellen mit einem Zytometer zu zählen. Zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension. Aspirieren Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie das Zellpellet auf eine Konzentration von 80 Mikrolitern Färbepuffer für 10 bis die siebte Zelle.
Geben Sie 20 Mikroliter CD-4-Mikrokügelchen pro 10 Zellen in die siebten Zellen. Gut mischen und die Zellen 15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter Färbepuffer pro 10 bis siebte Zellen und zentrifugieren Sie die Zellen.
Saugen Sie den Überstand vollständig an und suspendieren Sie das Zellpellet erneut. Man erhält eine mittlere Säule für maximal zwei mal 10 bis zur achten Zelle und stellt die Säule in das Magnetfeld des Separators. Spülen Sie anschließend die Säule mit 500 Mikrolitern Färbepuffer
.Pipettieren Sie die Zellsuspension auf die Säule und sammeln Sie die unmarkierten Zellen, die die Säule passieren, in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Setzen Sie ein neues 15-Milliliter-Röhrchen unter die Säule und waschen Sie die Säule dreimal mit 500 Mikrolitern Färbepuffer. Stellen Sie sicher, dass der Säulenbehälter leer ist, bevor Sie zwischen den Wäschen neuen Färbepuffer hinzufügen.
Nehmen Sie die Säule aus dem Separator und stellen Sie sie auf ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen. Pipettieren Sie einen Milliliter Färbepuffer auf die Säule und spülen Sie die magnetisch markierten Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben fest in die Säule drücken. Wiederholen Sie dann die magnetischen Trennschritte mit der abgebildeten Fraktion in einer neuen Säule, um die Reinheit der CD14 plus-Zellen zu erhöhen.
Vier Sätze CD14 plus Monozyten in einer Konzentration von null Komma drei bis null Komma fünfmal 10 bis zum Sechstel pro Milliliter Zellkulturmedium von IL-4 in sechs Vertiefungsplatten aussäen. Inkubieren Sie die Zellen in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent CO2. Am vierten Tag 850 Mikroliter Medium aus der Kultur nehmen und zentrifugieren.
Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in einem Milliliter Zellkulturmedium. Geben Sie die Zellmischung zurück in die Kultur. Fügen Sie am fünften Tag einen Mikroliter Vitamin-D3-Brühe und einen Mikroliter Dexamethazon-Brühe pro einem Liter Medium zu zwei der Sets hinzu, um tolerogene moDCs zu erzeugen.
Fügen Sie am sechsten Tag 200 Nanogramm pro Milliliter GMCSF und 200 Nanogramm pro Milliliter IL-4 zu allen Sets hinzu. Fügen Sie ein Mikrogramm pro Milliliter LPS zu einem der Sets hinzu, die nur mit GMCSF und IL-4 behandelt wurden, um reife moDC zu erzeugen. Fügen Sie ein Mikrogramm pro Milliliter LPS zu einem Satz der tolerogenen moDCs hinzu, um tolerogene LPS-moDCs zu erzeugen.
Am siebten Tag schließlich werden die verschiedenen Arten von moDCs geerntet, indem Sie die Kulturschale mit PVS EDTA spülen. Die unreifen moDCs wurden durch Zugabe von GMCSF und IL-4 zu gereinigtem CD-14 plus Monozyten an den Tagen null, vier und sechs erzeugt. Die Zugabe von Vitamin D3 und Dexamethazon nach GMCF und IL-4 führte zur Differenzierung von unreifen moDCs in tolerogene moDCs.
LPS wurde hinzugefügt, um die Reifung von unreifen moDCs zu reifen moDCs zu induzieren. Und tolerogene moDCs wurden mit LPS stimuliert, um die Resistenz gegen Reifung zu verifizieren. Eine Analyse von DC-Oberflächenmarkern zeigte, dass reife moDCs die höchsten Konzentrationen an Reifungsmarkern HLA-DR, CD80, CD83 und CD86 exprimieren.
Umgekehrt zeigten tolerogene moDCs eine erhöhte Expression von CD14, BDCA3 und Immunglobulin-ähnlichen Transkripten im Vergleich zu unreifen und reifen moDCs. Unter Verwendung von rotem CMXRos zur Darstellung der mytokondrialen Aktivität wurde beobachtet, dass tolerogene moDCs im Vergleich zu den anderen moDC-differenzierten Subtypen eine höhere mytokondriale Aktivität aufweisen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um metabolische Merkmale in dendritischen Zellen für die Entwicklung von Impfstoffen und Immuntherapien zu erforschen.
Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Erzeugung tolerogener und reifer dendritischer Zellen aus Monozyten vor, das für immunologische Forschung und die Entwicklung von Impfstoffen verwendet werden kann. Die Methode ermöglicht die Differenzierung unreifer, aus Monozyten abgeleiteter dendritischer Zellen (moDCs) in unterschiedliche Phänotypen mit variierenden metabolischen Eigenschaften.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Dendritische Zellbiologie
- Zelluläre Differenzierung
Hintergrund
- Dendritische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Immunität und Toleranz.
- Das Verständnis der Differenzierung von moDCs kann Einblicke in Immunantworten liefern.
- Tolerogene dendritische Zellen können bei der Entwicklung von Therapien gegen Autoimmunerkrankungen von Vorteil sein.
- Reife dendritische Zellen sind für eine effektive Antigenpräsentation unerlässlich.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Generierung hoher Zahlen dendritischer Zellen in vitro.
- Um die Stoffwechseleigenschaften von dendritischen Zellen während der Differenzierung zu untersuchen.
- Um ein Modell zur Untersuchung der Dendritischen Zellreifung und -funktion bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Anreicherung von Monozyten aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs).
- Magnetische Trennung zur Isolierung von CD14+ Monozyten.
- Kultur von Monozyten mit spezifischen Zytokinen und Verbindungen zur Induktion der Differenzierung.
- Analyse von Oberflächenmarkern und metabolischer Aktivität dendritischer Zellen.
Hauptergebnisse
- Tolerogene moDCs wiesen eine höhere mitochondriale Aktivität im Vergleich zu anderen Subtypen auf.
- Reife moDCs exprimierten erhöhte Mengen an Reifungsmarkern wie HLA-DR und CD80.
- Tolerogene moDCs zeigten eine erhöhte Expression von CD14 und immunoglobulinähnlichen Transkripten.
- Das Differenzierungsprotokoll erzeugte erfolgreich unterschiedliche dendritische Zellpopulationen für die Forschung.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode ermöglicht die effektive Erzeugung von dendritischen Zellen für immunologische Untersuchungen.
- Das Verständnis der Stoffwechselprofile dendritischer Zellen kann bei der Entwicklung von Impfstoffen helfen.
- Die Ergebnisse tragen zum Wissen über die Biologie dendritischer Zellen und ihre Rolle in der Immunregulation bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Erzeugung von dendritischen Zellen mit definierten immunogenen oder tolerogenen Phänotypen ermöglicht eine präzise Untersuchung immunologischer Mechanismen, die für die Immuntherapie und die Impfstoffentwicklung relevant sind. Diese Fähigkeit stärkt das Vorhersagevertrauen bei der Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien und verringert die Risiken translationsmedizinischer Programme, indem standardisierte und skalierbare zelluläre Modelle bereitgestellt werden. Der Ansatz ist direkt relevant für Portfolio-Teams, die die entdeckungsorientierte Biologie mit der klinischen Translation im Bereich der Immunmodulation in Einklang bringen möchten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht mechanistische Untersuchungen der Dendritischen Zellreifung und der Antigenpräsentationswege.
- Unterstützt die funktionelle Validierung immunologischer Zielstrukturen durch die Generierung unterschiedlicher DC-Phänotypen in vitro.
- Ermöglicht die biologische Entlastung, indem der Einfluss des Stoffwechselzustands auf die Immunfunktion geklärt wird.
- Bietet ein reproduzierbares System für die hypothesengeleitete Untersuchung von Mechanismen der immunologischen Toleranz.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert validierte, phänotypisch unterschiedliche Dendritische-Zell-Populationen für nachgeschaltete Screening-Workflows.
- Standardisiert die Charakterisierung von Oberflächenmarkern und metabolischem Phänotyp zur Reproduzierbarkeit von Assays.
- Ermöglicht die quantitative Beurteilung des Antigenpräsentationspotenzials und der T-Zell-Aktivierung.
- Ermöglicht die skalierbare Herstellung von DCs für Plattformen zur Wirkstoff- oder Antigenscreening.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung von in-vitro-DC-Modellen mit krankheitsrelevanten Strategien zur Immunmodulation.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung von Immuntherapien und tolerogenen Interventionen.
- Unterstützt eine risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem vorhersagende Daten zur DC-Funktion und metabolischen Phänotypisierung bereitgestellt werden.
- Erleichtert die Erforschung translationsrelevanter Biomarker, die mit der DC-Maturierung und Toleranz in Verbindung stehen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem sie die Erzeugung und Charakterisierung von dendritischen Zellsubtypen für Studien zur Immunmodulation ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Bietet eine Plattform für die Hypothesenprüfung zur DC-Maturierung, Antigenpräsentation und Toleranzinduktion.
- Screening: Stellt reproduzierbare, phänotypisch definierte DCs für die Assay-Entwicklung und Wirkstoffbewertung bereit.
- Analytik: Liefert quantitative Auswertungen von Oberflächenmarkern und metabolischer Aktivität für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit präklinischen Modellen der Immunintervention und Impfstoffentwicklung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen wiederverwendbaren Workflow zur Erzeugung von DCs über mehrere Immunologieprogramme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Validierung immunologischer Zielstrukturen und der mechanistischen Entschärfung von Risiken.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Erzeugung und Charakterisierung dendritischer Zellen für Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung über Fortführung oder Abbruch immunmodulatorischer Programme und verringert biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Assets zur Immunmodulation sowie translationsrelevanter Kandidaten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolierung von Monozyten, Zellkultur und Immunphänotypisierung.
- Benötigt Zugang zu Durchflusszytometrie und Assays zur Bestimmung der metabolischen Aktivität für die Charakterisierung von dendritischen Zellen.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei Zytokin- und Reifungsprotokollen zur Reproduzierbarkeit voraus.
- Möglicherweise ist eine Anpassung für unterschiedliche Spenderquellen oder Krankheitsmodelle erforderlich.
- Zu den Einschränkungen gehören die Variabilität primärer Zellquellen und mögliche Batch-Effekte.
