Die Erzeugung von Unreife, Ältere und Tolerogene Dendritischen Zellen mit unterschiedlichen Metabolic Phänotypen

Unreife dendritische Zellen können selektiv in tolerogene oder reife dendritische Zellen differenziert werden, um das Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz zu regulieren. Diese Arbeit stellt eine Möglichkeit vor, aus unreifen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (moDCs) in vitro tolerogene und reife moDCs zu generieren, die sich in metabolischen Phänotypen unterscheiden.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, tolerogene und reife dendritische Zellen aus Monozyten für Experimente oder die Impfstoffentwicklung zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, indem sie ein Modell zur Untersuchung der Entwicklung, Reifung und Antigenpräsentation von dendritischen Zellen bereitstellt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Erzeugung einer großen Anzahl von dendritischen Zellen in vitro für Experimente ermöglicht.

Beginnen Sie die Monozytenanreicherung, indem Sie 20 Mikroliter einer zuvor vorbereiteten mononukleären Blutzelle oder PBMC-Zellsuspension mit 20 Mikrolitern Tripanblau mischen, um die Anzahl der lebenden Zellen mit einem Zytometer zu zählen. Zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension. Aspirieren Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie das Zellpellet auf eine Konzentration von 80 Mikrolitern Färbepuffer für 10 bis die siebte Zelle.

Geben Sie 20 Mikroliter CD-4-Mikrokügelchen pro 10 Zellen in die siebten Zellen. Gut mischen und die Zellen 15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter Färbepuffer pro 10 bis siebte Zellen und zentrifugieren Sie die Zellen.

Saugen Sie den Überstand vollständig an und suspendieren Sie das Zellpellet erneut. Man erhält eine mittlere Säule für maximal zwei mal 10 bis zur achten Zelle und stellt die Säule in das Magnetfeld des Separators. Spülen Sie anschließend die Säule mit 500 Mikrolitern Färbepuffer

Pipettieren Sie die Zellsuspension auf die Säule und sammeln Sie die unmarkierten Zellen, die die Säule passieren, in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Setzen Sie ein neues 15-Milliliter-Röhrchen unter die Säule und waschen Sie die Säule dreimal mit 500 Mikrolitern Färbepuffer. Stellen Sie sicher, dass der Säulenbehälter leer ist, bevor Sie zwischen den Wäschen neuen Färbepuffer hinzufügen.

Nehmen Sie die Säule aus dem Separator und stellen Sie sie auf ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen. Pipettieren Sie einen Milliliter Färbepuffer auf die Säule und spülen Sie die magnetisch markierten Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben fest in die Säule drücken. Wiederholen Sie dann die magnetischen Trennschritte mit der abgebildeten Fraktion in einer neuen Säule, um die Reinheit der CD14 plus-Zellen zu erhöhen.

Vier Sätze CD14 plus Monozyten in einer Konzentration von null Komma drei bis null Komma fünfmal 10 bis zum Sechstel pro Milliliter Zellkulturmedium von IL-4 in sechs Vertiefungsplatten aussäen. Inkubieren Sie die Zellen in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent CO2. Am vierten Tag 850 Mikroliter Medium aus der Kultur nehmen und zentrifugieren.

Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in einem Milliliter Zellkulturmedium. Geben Sie die Zellmischung zurück in die Kultur. Fügen Sie am fünften Tag einen Mikroliter Vitamin-D3-Brühe und einen Mikroliter Dexamethazon-Brühe pro einem Liter Medium zu zwei der Sets hinzu, um tolerogene moDCs zu erzeugen.

Fügen Sie am sechsten Tag 200 Nanogramm pro Milliliter GMCSF und 200 Nanogramm pro Milliliter IL-4 zu allen Sets hinzu. Fügen Sie ein Mikrogramm pro Milliliter LPS zu einem der Sets hinzu, die nur mit GMCSF und IL-4 behandelt wurden, um reife moDC zu erzeugen. Fügen Sie ein Mikrogramm pro Milliliter LPS zu einem Satz der tolerogenen moDCs hinzu, um tolerogene LPS-moDCs zu erzeugen.

Am siebten Tag schließlich werden die verschiedenen Arten von moDCs geerntet, indem Sie die Kulturschale mit PVS EDTA spülen. Die unreifen moDCs wurden durch Zugabe von GMCSF und IL-4 zu gereinigtem CD-14 plus Monozyten an den Tagen null, vier und sechs erzeugt. Die Zugabe von Vitamin D3 und Dexamethazon nach GMCF und IL-4 führte zur Differenzierung von unreifen moDCs in tolerogene moDCs.

LPS wurde hinzugefügt, um die Reifung von unreifen moDCs zu reifen moDCs zu induzieren. Und tolerogene moDCs wurden mit LPS stimuliert, um die Resistenz gegen Reifung zu verifizieren. Eine Analyse von DC-Oberflächenmarkern zeigte, dass reife moDCs die höchsten Konzentrationen an Reifungsmarkern HLA-DR, CD80, CD83 und CD86 exprimieren.

Umgekehrt zeigten tolerogene moDCs eine erhöhte Expression von CD14, BDCA3 und Immunglobulin-ähnlichen Transkripten im Vergleich zu unreifen und reifen moDCs. Unter Verwendung von rotem CMXRos zur Darstellung der mytokondrialen Aktivität wurde beobachtet, dass tolerogene moDCs im Vergleich zu den anderen moDC-differenzierten Subtypen eine höhere mytokondriale Aktivität aufweisen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um metabolische Merkmale in dendritischen Zellen für die Entwicklung von Impfstoffen und Immuntherapien zu erforschen.