Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, die genomweite DNA-Methylierungslandschaft in großen Patientenkohorten systematisch zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im epigenetischen Bereich zu beantworten, insbesondere im Hinblick darauf, welche Regionen in der DNA-Methylierungslandschaft bei Patienten dereguliert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine große Anzahl von Patienten kostengünstig untersucht werden kann.

Diese Technologie kann sich positiv auf die Therapie und Diagnose des Patienten auswirken, da wir bestehende Biomarker untersuchen und auch neue Biomarker identifizieren können. Obwohl diese Methode Einblicke in die Patientenkohorte geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie die DNA-Methylierung in Zellen angewendet werden, die aus kultivierten Zelllinien aus Mausproben stammen. Zusammen mit Dr. Ya-Ting Hsu wird Herr Joseph Liu, ein Techniker in unserem Labor, dieses Verfahren demonstrieren.

Der Sequenzierungsteil wird von Frau Dawn Garcia vorgeführt, die als Technikerin in unserem Sequenzierungskern tätig ist. Nach der Isolierung genomischer DNA aus Tumor oder normalem Gewebe gemäß dem Textprotokoll fügen Sie 1,2 Mikrogramm genomische Gesamt-DNA zu 96 Mikrolitern TE-Puffer und 24 Mikrolitern 5X Bind Wash Puffer hinzu, um eine 120-Mikroliter-Lösung herzustellen. Beschallen Sie die DNA-Lösung 30 Sekunden lang und lassen Sie sie dann 30 Sekunden ruhen.

Wiederholen Sie die Beschallung insgesamt 20 bis 25 Mal. Verwenden Sie ein Bioanalysesystem mit einem kommerziellen hochempfindlichen DNA-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers, um einen Mikroliter beschallte DNA-Lösung zu verwenden, um die Größe der Fragmente zu überprüfen. Sie sollten im Bereich von 150 bis 350 Basenpaaren liegen.

Um eine Einzelfraktions-Elution durchzuführen, bereiten Sie den Elutionspuffer vor, indem Sie eine Eins-zu-Eins-Lösung aus salzarmem Puffer und hohem Salzgehalt herstellen. Verwenden Sie 200 Mikroliter des Elutionspuffers, um die methylbindenden DNA- oder MBD-Kügelchen zu resuspendieren, und inkubieren Sie die Suspension drei Minuten lang auf einem rotierenden Mischer. Legen Sie das Röhrchen nach der Inkubation für eine Minute auf das Magnetgestell, pipettieren Sie dann vorsichtig die Flüssigkeit, ohne die Spitze der Pipette auf den Kügelchen zu berühren, und geben Sie sie in ein sauberes DNase-freies 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Lagern Sie diese Probe auf Eis. Wiederholen Sie die Elution für die zweite Probe und entnehmen Sie sie im selben Röhrchen wie die erste Probe. Zu jeder nicht aufgefangenen Wasch- und Verdünnungsfraktion wird ein Mikroliter Glykogen, ein Zehntel des Volumens von drei molaren Natriumacetaten, ein pH-Wert von 5,2 und zwei Probenvolumina mit 100 % Ethanol hinzugefügt.

Nachdem Sie die Lösung gut gemischt haben, inkubieren Sie mindestens zwei Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius. Dann zentrifugieren Sie die Reaktion bei 11.363 g und vier Grad Celsius für 15 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören, und fügen Sie 500 Mikroliter kaltes 70%iges Ethanol hinzu.

Drehen Sie die Tube erneut, bevor Sie die Ethanolwäsche wiederholen. Trocknen Sie das Pellet fünf Minuten lang an der Luft. Verwenden Sie dann DNase-freies Wasser oder Puffer, um es wieder zu suspendieren.

Überprüfen Sie, ob die Gesamtmenge an DNA gemäß dem Textprotokoll über 20 Nanogramm liegt. Legen Sie die DNA dann auf Eis oder lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Verwenden Sie für die Vorbereitung von DNA-Sequenzierungsbibliotheken ein vollautomatisches Bibliothekskonstruktionssystem und befolgen Sie das vom Hersteller bereitgestellte Standardprotokoll.

Wählen Sie DNA-Fragmente mit einer Länge von 200 bis 400 Basenpaaren für die Bibliotheksvorbereitung aus. Entfernen Sie nach der Vorbereitung der DNA-Sequenzierungsbibliothek die Reaktion und verwenden Sie ein fluorometrisches Quantifizierungssystem, um die DNA-Sequenzierungsbibliothek zu quantifizieren. Um eine PCR-Amplifikationsreaktion einzurichten, geben Sie in ein PCR-Röhrchen 15 Mikroliter DNA-Sequenzierungsbibliothek, 25 Mikroliter PCR-Mastermix, zwei Mikroliter PCR-Primer-Mix und acht Mikroliter Wasser.

Verwenden Sie das im Textprotokoll beschriebene Programm und nehmen Sie bei Bedarf Anpassungen auf der Grundlage der Empfehlungen des Herstellers des PCR-Mixes vor. Führen Sie genügend Zyklen durch, um zwei bis 10 Millimolare Bibliotheks-DNA zu produzieren. Nachdem Sie die PCR-Reaktionen gereinigt haben, versehen Sie jede Probe mit einem Barcode und ziehen vier Proben zusammen in eine Spur einer Durchflusszelle.

Verwenden Sie das standardmäßige 50-Basenpaar-Single-Read-Protokoll unserer Sequenzierung. Führen Sie Bioinformatik gemäß dem Textprotokoll durch. Diese Studie zeigte, dass von den gesamten CpG-Inseln, die sich in Genpromotoren befinden, 19,5% der gesamten CpG-Inseln, die sich in Genpromotoren befinden, eine unterschiedliche Methylierung in Tumoren im Vergleich zu normalem Gewebe aufwiesen.

In ähnlicher Weise zeigten 55,2 % der untersuchten intragenen CpG-Inseln eine differentielle Methylierung. Intragene Promotoren zeigten eine differentielle Methylierung von 28,1 % und von Genpromotoren ohne CpG-Inseln zeigten 1,8 % eine differentielle Methylierung. Diese Heatmap zeigt deutlich die unterschiedlich methylierten Regionen von 77 Brusttumoren, 10 Brustnormalgeweben und 38 Brustkrebszelllinien.

In dieser Abbildung ist die Methylierung in zwei Untergruppen des Endometriumkarzinoms, nicht rezidividivierend vs. rezidividivierend, bei zwei Patientinnen an unterschiedlichen CpG-Stellen auf der Promotor-CpG-Insel des identifizierten Zielgens SFRP1 quantifiziert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier bis fünf Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, zuerst die Qualität einer zu testenden genomischen DNA zu testen. Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Methoden wie Pyrosequenzierung durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten wie: Was sind die genauen CpGs in den identifizierten differentiell angereicherten Regionen, die verändert wurden? Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Epigenetik, um die DNA-Methylierung in großen Patientenkohorten zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die genomweite DNA-Methylierung in Patientenproben mit der MBD-Kappensequenzierungstechnik untersuchen können. Denken Sie daran, dass es manchmal schwierig sein kann, die hohe Qualität der DNA aus FFP- und DNA-Proben zu erfassen, daher wird die genomische DNA immer richtig bewertet, wenn wir den Eingriff durchführen.