FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Das übergeordnete Ziel dieser experimentellen Methode ist es, die Echtzeituntersuchung der intrazellulären Signalübertragung mithilfe der FRET-Bildgebung von Zellen zu ermöglichen, die in dreidimensionale Hydrogele eingebettet sind, die natürliches Gewebe nachahmen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie, Pharmakologie und regenerativen Medizin zu beantworten, wie z. B. die Entwicklung optimaler Biomaterialien und das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening in künstlich hergestellten 3D-Mikrogeweben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass FRET mit herkömmlichen Weitfeldmikroskopsystemen auf eine große Anzahl von Zellen in zahlreichen Hydrogeltypen angewendet werden kann.

Nach der Herstellung von Formen für das Hydrogelgießen und dem Suspendieren der kultivierten Zellen in Hydrogellösung gemäß dem Textprotokoll in einer Gewebekulturhaube wird die zellhaltige Vorläufer in den Gießformen unter Verwendung einer sterilen Technik hinzugefügt. Vor dem Crosslinking zentrieren Sie die im Hydrogel-Vorläufer suspendierten Zellen, um die Bildgebung zu optimieren, indem die Zellen auf eine einzige Brennebene beschränkt und das Signal außerhalb der Ebene minimiert wird. Um PC-Hydrogele zu vernetzen, verwenden Sie als Nächstes eine UVA-Lichtquelle für eine Belichtungszeit von 3,2 Joule pro Quadratzentimeter pro Millimeter Dicke, um die Zelle mit dem Vorläufer zu bestrahlen.

Alternativ können Sie eine günstigere Handzahnlampe verwenden. Vermeiden Sie es, das Hydrogel zu überbelichten, da dies die Lebensfähigkeit der Zellen verringert. Physikalisch vernetzende Hydrogele werden stattdessen bei 37 Grad Celsius platziert.

Entfernen Sie nach dem Vernetzung die PDMS-Hydrogel-Gießform und ersetzen Sie sie durch die zuvor vorbereitete PDMS-Schale. Verwenden Sie einen sterilen Spatel, um das PDMS auf das Glas zu drücken, um es zu verkleben. Geben Sie phenolfreies serumfreies Medium oder ein chemisch definiertes Medium mit einem Deckglas in die Vertiefung, um das Hydrogel eingetaucht zu halten.

Inkubieren Sie das Gericht bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Sobald die PDMS-Schale mit dem Hydrogel auf dem Mikroskoptisch befestigt und das Öl auf das Objektiv aufgetragen wurde, verwenden Sie Durchlicht, um mindestens 15 Zellen für die Bildgebung zu finden, und überprüfen Sie die Transfektion mit Fluoreszenzbildgebung. Konfigurieren Sie in der Mikroskopsoftware die Kameraeinstellungen für die FRET-Bildkanäle, indem Sie aus einigen Zellen in der Nähe der Mitte des Sichtfelds wählen und die Belichtung und Verstärkung pro Bildkanal gemäß dem Textprotokoll optimieren.

Wählen Sie Zellen, die sich nahe der Mitte des Hydrogels befinden, innerhalb des relativ flachen Beleuchtungsfeldes, die weder zu hell noch zu schwach sind, und mit einem FRET-Verhältnis zwischen 00 und 1,0. Wählen Sie dann mehrere Sichtfelder aus, um Bilder für mindestens 15 transfizierte Zellen aufzunehmen. Schalten Sie das Licht aus, wenn Sie fertig sind, um die Belichtung zu begrenzen.

Um die Aufnahmerate für die Zeitraffer-Bilderfassung zu konfigurieren, geben Sie die Periodizität der Aufnahmen ein. Verwenden Sie eine schnelle Rate für die Erfassung des Basissignals, z. B. alle fünf Sekunden pro Sichtfeld, und eine langsamere Rate für nachfolgende Langzeitsignalkinetiken. Wählen Sie Jetzt ausführen aus, um die Bildaufnahme zu starten, und erfassen Sie Bilder fünf Minuten lang, um eine Ausgangsbasis für die Reaktion des Prüfkopfs im angegebenen Sichtfeld festzulegen.

Nach den fünf Minuten der Bildaufnahme pipettieren Sie den gewünschten Agonisten oder Antagonisten, mischen durch Pipettieren und setzen Sie die Bildgebung fort. Nachdem Sie die FRET-Kalibrierung gemäß dem Textprotokoll durchgeführt haben, wählen Sie in der Mikroskopsoftware den Pfeil auf dem Symbol für den interessierenden Hintergrundbereich aus und wählen Sie Elliptischer Hintergrundbereich zeichnen. Zeichnen und bestimmen Sie einen Interessenbereich (ROI) pro Sichtfeld in der Nähe der Zellen, um die Hintergrundebene zu definieren.

Stellen Sie sicher, dass die Option "Hintergrundversatz immer aktualisieren" ausgewählt ist, und aktivieren Sie dann die Anzeige des Hintergrundbereichs, indem Sie auf das Symbol "Hintergrundbereich von Interesse" klicken. Alternativ können Sie das Symbol für den Interessenbereich auswählen, und legen Sie die Eigenschaften für den Interessenbereich auf Als Hintergrundbereich verwenden fest, und die Interessenbereiche sind in jedem Multipunkt-Element unterschiedlich. Wählen Sie mit dem Symbol für den Hintergrund des Interessenbereichs die Option Hintergrund mit Interessenbereich subtrahieren.

Wählen Sie im Popup-Fenster unter "Hintergrundbereich von Interesse subtrahieren" die Option "Jedes Bild" und unter "Anwenden auf" die Option "Alle Frames" aus. Um für jedes Sichtfeld einen Interessenbereich um die Zelle herum mithilfe des Akzeptor-Emissionskanals und einer Binärmaske zu definieren, verwenden Sie das Menü Binär, Schwellenwert definieren und wählen Sie Auf aktuellen Frame anwenden. Passen Sie dann den unteren Schwellenwert an, um die Zellen auszuwählen.

Verwenden Sie anschließend die Funktion Binäres Schließen, um bei Bedarf Lücken in der Binärmaske zu füllen. Verwenden Sie dann das Symbol "Interessenbereich", um "Binärdatei in Interessenbereich kopieren" auszuwählen und die Binärmaske als Interessenbereiche zu speichern. Fügen Sie die Interessenbereiche für nachfolgende Sichtfelder an den vorhandenen Pool von Interessenbereichen an.

Löschen Sie alle unerwünschten Interessenbereiche. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf die Interessenbereiche, und überprüfen Sie, ob ihre Eigenschaften als Standardinteressenbereich verwendet werden und die Interessenbereiche in jedem Multi Point unterschiedlich sind. Die Zellregion der Interessen kann von Hand gezeichnet werden, aber es muss darauf geachtet werden, dass falsche Werte entfernt werden.

Das Protokoll enthält Verfahren für Zellen, die sich außerhalb des flachen Beleuchtungsfeldes befinden, und für Mikroskope, die kein flaches Feld haben. Die Zentrifugation der Hydrogel-Vorläufer vor der Gelierung maximierte die Anzahl der Zellen in einer Brennebene in der Nähe des Deckglases. Dadurch wurde das Hintergrundrauschen minimiert und der Bilddurchsatz erhöht.

In diesem FRET-Experiment waren für die Berechnung der gequenchten Emission (QE) nur zwei Bilder für die einkettige binäre ICUE1-Sonde erforderlich, einschließlich QE gleich CFP CFP für Anregung und Emission und Akzeptoremission gleich YFP YFP für Anregung und Emission. Es wurden mehrere Sichtfelder ausgewählt, in denen sich mehrere Zellen innerhalb des homogenen Beleuchtungsbereichs befanden, wie hier gezeigt. Die ROIs für die Hintergrundkorrektur von Kanalsignalen und für die Zellanalyse wurden zu Beginn der Experimente anhand von Akzeptoremissionsbildern mit Schwellenwerten bestimmt.

Darüber hinaus wurden, wie hier gezeigt, Zellen ausgewählt, die ausreichend Sonde exprimierten. Es wurden die QE- und sensibilisierten Emissions-FRET-Verhältnisse pro Pixel sowie das durchschnittliche FRET-Verhältnis pro Zelle berechnet. Der Kehrwert des SE-Verhältnisses wurde berechnet und beide Verhältnisse wurden normiert.

Unter der Forskolin-Stimulation zeigen sowohl die QE- als auch die SE-basierten Fret-Verhältnisse die erhöhte zyklische AMP-Aktivität in Chondrozyten. Sowohl physikalisch vernetzte als auch chemisch vernetzte Gele zeigten einen Anstieg des QE-FRET-Verhältnisses im Laufe der Zeit, was auf eine erhöhte zyklische AMP-Signalantwort auf die Zugabe von Forskolin hinweist. Dieses Verfahren kann mit anderen Mikroskopietechniken wie FRAP, Flim-Bund und Bund- und Anisotropiemessung verwendet werden, um Fragen zu beantworten, wie z. B. die Unterschiede in der Permeabilität und zellulären Vereinzelung zwischen verschiedenen Mikrogewebetypen.

Da die Vernetzung in der Nähe des PDMS abgeschreckt wird, ist es wichtig, daran zu denken, die Formen für die photovernetzenden Hydrogele mit einem etwas größeren Durchmesser als die Hydrogele selbst zu entwerfen.