Name: FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Erfahren Sie FRET-Imaging in dreidimensionalen Hydrogelen zur Echtzeit-Analyse intrazellulärer Signale. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatz-Studien an Zellen mit konventioneller Epifluoreszenzmikroskopie.

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Die Autoren erkennen an, die finanzielle Unterstützung der School of Dental Medicine an der University of Pittsburgh, die National Institutes of Health Award K01 AR062598 und die Gewährung von P30 DE030740. Die Autoren danken auch Dr. Jin Zhang für die ICUE1 Plasmid, Wayne Rasband für ImageJ und Michael Cammer für die ImageJ Makro zu entwickeln.

Die Autoren haben keine Konflikte zu deklarieren.

Diese Arbeit zeigt, wie FRET-Bildgebung verwendet werden können zelluläre Signal in 3D Hydrogele zu analysieren. Während frühere Studien FRET - Bildgebung von Zellen auf Substraten Hydrogels 35-37, von extrazellulären Wechselwirkungen mit Hydrogele 38 und von Molekülen gefangen in Hydrogelen 39-41, ist dies die erste Veröffentlichung FRET Bildgebung basierend intrazellulärem Analyse von Zellen ausgesät gezeigt haben innerhalb eingebettet zu beschreiben 3D Hydrogelen. Die Arbeit löst mehrere Probleme Implementierung bei FRET-Bildgebung von 2D auf 3D zu übersetzen. Zunächst werden mit hoher numerischer Apertur Ziele für FRET-Bildgebung benötigt eine ausreichende Emissionssignal zu sammeln, aber sie begrenzen die Tiefe des Feldes. Die hier Zellen dürfen leicht absetzen durch Zentrifugieren der Anzahl von Zellen in einer Brennebene in der Nähe der Glas dies zu kompensieren zu erhöhen. Zweitens 3D Hydrogels Gerüste während der Bildgebung über das Sichtfeld, die Analyse erschwert driften kann. Die Hydrogele sind hier an den cov gebundenerslip so daß sie bleiben während des gesamten Versuchs festgelegt. Drittens Auswahl geeigneter Hydrogelzusammensetzungen für 3D FRET ist wesentlich, weil Hydrogele Sichtbarmachung der Zellen behindern. Hier transparente Hydrogele von PC-Gel und TR-Gel verwendet. Jedoch Sammeln der Zellen mit Zentrifugation in eine Brennebene in der Nähe des Deckglas kann auf Bildzellen in Hydrogele mit einem höheren hängt diffraction.The Wahl des Hydrogels auf die Mikroumgebung Bedingungen verwendet werden , die simuliert werden müssen, was in einer Bewertung auf Hydrogelen zu finden sind 42 . Viertens ist eine alternative Berechnung hier für das FRET - Verhältnis der einzelnen Kette ICUE1 Sonde (dh E QE = QE / CAEM) verwendet , um die Anzahl der Bildkanäle für die Analyse zu minimieren und dadurch Photobleaching minimieren. Die durchschnittliche FRET-Verhältnis pro Zelle wird als Mittelwert der Verhältnisse pro Pixel in einer Zelle Unterschätzung des tatsächlichen FRET-Verhältnis zu minimieren, berechnet. Schließlich wird eine lineare ratiometrisch Analyse und MittelZur Berechnung der aktivierten Fraktion von einkettigen binären Sonden beschrieben. Es gibt einige kritische Aspekte der erfolgreichen FRET Durchführung von Experimenten unter Verwendung von Weitfeldmikroskopie. In Bezug auf die Hardware, muss die Kamera empfindlich genug sein, kleine Signaländerungen zu lösen, so dass neuere wissenschaftliche CMOS-Kameras und Elektronenvervielfachungs CCDs besser geeignet als herkömmliche CCDs. Um am besten die räumliche Verteilung des FRET-Verhältnis zu analysieren, die Kamera auf mindestens besitzen muss zweimal die räumliche Auflösung der Punktbildfunktion des Objektivs (Nyquist-Kriterium). Dies macht Dual-View-Systeme weniger geeignet für die Aufgabe. Entscheidender ist es, eine angemessene Belichtung und Bildaufnahmerate für das gegebene FRET-Paar auszuwählen, um Photobleichens der Fluorophore zu minimieren. Eine verringerte Erfassungsrate wird als Versuchsdauer erhöht empfohlen. Die Verwendung von schnellen Filterräder erhöht Erfassungsrate und die Anzahl der FOVs zur Analyse während vermeidening die Bildregistrierung Probleme mit Dual-View und Revolver Filterwürfel. Die inhomogene Beleuchtungsfeld erschwert Korrektur für die Hintergrundfluoreszenz, die von der Probenautofluoreszenz und Kamerasystem Lärm entsteht. Einige Hydrogele, insbesondere solche kollagenen Proteine ​​enthalten , sind 43,44 hoch autofluoreszierenden. Die FRET-Verhältnisse werden ohne Hintergrundkorrektur unterschätzt. Hier beschäftigen wir einen einfachen Hintergrund - Korrekturverfahren, die auf dem relativ flachen Beleuchtungsfeld stützt , die oft mit Epi-Fluoreszenz - Beleuchtung über der Mitte des Bildes (3B, Schritt 7.2) konfiguriert werden können. Diese Methode schränkt daher Zellen von Interesse für die in diesem Beleuchtungsfeld. Die Hintergrundkorrektur hier beschrieben berücksichtigt nicht zelluläre Autofluoreszenz in den Wellenlängen für die binäre Sonde lesen. In einem solchen Fall unmarkierter Zellen (keine Sonde Transfektion) sollte subtrahiert unter den gleichen Bedingungen und Hintergrund abgebildet werden. A mix von markierten und unmarkierten Zellen können verwendet werden und die nicht markierten Zellen für den Hintergrund ROI ausgewählt. Alternative Methoden, die für die Zellanalyse über das gesamte Bildfeld liefern, schließen die Verwendung eines Abschattungsmaske, mehrere Hintergrund ROIs oder identische Proben ohne Zellen und ein Protokoll ist auf Anfrage erhältlich. Spezifisch für 3D - FRET - Bildgebung ist Sondenantwort sehr empfindlich auf die Hydrogel - Durchlässigkeit für den Analyten (Abbildung 6). Daher sind die gleichen Hydrogels Regionen sind über experimentelle Behandlungen verglichen, vorzugsweise an einem Punkt, der Geometrie Symmetrie wie in der Nähe der Gerüstmitte wie hier verwendet. Alternativ mikrofluidischen Kammern / Bioreaktoren schnell eingesetzt werden können und gleichmäßig um das Hydrogel mit Lösung 45 Analyten perfuse. Eine FRET-Signal kann nicht detektiert werden (Signal-Rausch-Verhältnis zu niedrig ist), wenn das Hydrogel der Autofluoreszenz zu hoch ist; ein dünneres Hydrogel oder verschiedene Sonde (verschiedene Fluorophore) verwendet werden soll.In Bezug auf die 3D-FRET-Bildgebung in der photovernetzten Hydrogelen, die Verwendung von Mindest Bestrahlung Belichtung und Wellenlängen außerhalb der Anregungsspektren der Sonde Fluorophore wird empfohlen. LAP kann bei 405 nm mit einer sichtbaren Lichtquelle verwendet werden , um potentielle minimieren Zellschäden 31,46. Jedoch wird mit LAP mit 365 nm Bestrahlung empfohlen, da diese Sonde Bleichen minimiert. 365 nm liegt am hinteren Ende der GFP Donoranregung Spektrum, während 405 nm an der Spitze Anregung liegt. Alternativ kann die Sonde Ausdruck für einen Tag zu erholen dürfen. Verwendung von binären Sonden minimiert Probleme der Empfindlichkeit auf Unterschiede in Expressionsniveaus und in der molekularen Diffusion der Donor- und Akzeptor-Fluorophoren. Nicht-binäre Sonden verwendet werden können, aber mit SE statt QE Bildgebung und zusätzliche Korrektur für die spektrale Durchbluten von Anregungs- und Emissionsspektren (siehe unten). Darüber hinaus ist die geringe Verfügbarkeit im Handel und die Komplexität bei der Gestaltung FRET-Sondenkann ein Hindernis sein. Der kritischste Faktor für eine erfolgreiche Experimente bleibt richtige Korrektur und Analyse der Fluoreszenzsignale. Eine alternative Berechnung des FRET-Verhältnis für mehrere weitere Gründe außer Minimierung der Photobleaching verwendet. Für binäre Einzelketten - Sonden, die häufigsten berichteten Verhältnis Akzeptor - Emission unter Anregung des Donors (sensibilisierte Emission, SE) zu Donoremission unter Donoranregung (abgeschreckt Emission, QE), dh das Verhältnis = SE / QE 25,47,48 FRET. SE / QE nicht linear ist in Bezug auf Veränderungen der FRET - Effizienz 21,22,47. Weist nämlich das Verhältnis eine exponentiell nichtlineare Beziehung inhärenter FRET - Effizienz der Sonde (Ei) (Donius, AE, Taboas, JM unveroffentlicht. (2015)), wobei das Verhältnis linearsten für Ei weniger als etwa 15%. SE / QE wird unterschätzen auch den Anteil von Aktivsonden (FAP, das heißt Fraktion von Sonden - Bindungs ​​Analyt). Therefore, die Analyse der SE / QE erfordert eine umständliche Gleichgewicht Dosis-Wirkungs-Studie und Kurvenanpassung. Glücklicherweise linear sind die Verhältnisse der SE oder QE an den Akzeptor - Emission unter Anregung des Acceptors (AEM) in Bezug auf Ei und der FAP, dh die FRET - Verhältnisse SE / Aem und QE / Aem. SE / Aem wird häufig für binäre Sonden verwendet und erfordert nur die Endpunktkalibrierung (ohne Sonde Aktivität und vollständige Sonde Aktivität), aber basale zelluläre Signal macht dies schwierig. Um die Notwendigkeit für die Endpunktkalibrierungs eliminieren kann SE für die spektrale Überlappung von Donor- und Akzeptor-Anregungs- und Emissionsspektren (spektrale Durchbluten) und für die Quantenausbeute und die spektrale Empfindlichkeit (QS) der kombinierten Sonde Fluorophore und Mikroskop korrigiert (CSE) werden Abbildungssystem. Die korrigierte SE FRET - Verhältnis basierend auf CSE definiert die beobachteten FRET - Effizienz der Sonden innerhalb jedes Pixels eines Bildes, das heißt, E SE = CSE / Aem. verfügbar Kommerzielle und freie Software SE für diese Effekte zu korrigieren undwird der Leser auf die Arbeit von Chen und Periasamy 2006 für eine detaillierte Erläuterung der Methoden 50 bezeichnet. Allerdings erfordert E SE Berechnung Erfassung von drei Bildkanäle pro Zeitpunkt (SE, QE, AEM). Daher wird in dieser Arbeit beschäftigen wir auch ein alternatives FRET Verhältnis E QE = 1 - QE / CAEM, die nur zwei Bildkanäle erfordert Erfassung von (QE und AEM). Die Berechnung E QE aus diesen Kanälen erfordert nur die Korrektur Aem für QS (CAEM = Aem x QS). QS = Dem / Aem ist leicht mit zwei Bilder von der einen Kalibrierungsprobe geschätzt, wobei Dem ist die Donoremission unter Donoranregung mit Akzeptor gebleicht. Die FAP zu jedem Zeitpunkt durch einen Vergleich E SE oder E QE zum Ei der Sonde berechnet werden. Letztendlich sollten FRET Verhältnis Auswahl (E SE = CSE / Aem vs. E QE = QE / CAEM) unter Beachtung des Sondentyp basieren und die Kanäle mit den besten Signal. sowohl einpproaches umfassen Hintergrundrauschen Korrektur von Bildern pro Bild oben für Änderungen in Autofluoreszenz im Laufe der Zeit Rechnung beschrieben. Sie übernehmen keine Überlappung von Aem Anregungslicht in den Dem Anregungsspektrum, was oft der Fall ist durch Design und Mikroskop Filterkonfiguration zu sondieren. Einzelketten-Sonden können entweder verwenden und die Auswahl beruht auf dem besten Sondensignals (Helligkeit) zur Kamera Lärm und Hintergrundsignal auf SE und QE-Kanäle. Für die ICUE1 Sonde und experimentellen Bedingungen verwendet hier (Zellen und Hydrogel-Typen), hat SE ein stärkeres Signal als QE. Zweikettigen Sonden erfordern die Verwendung von E SE aufgrund nicht-äquimolare Verteilung von Donor- und Akzeptor - Fluorophoren. Für Sonden , die bei der Bindung Analyten wie ICUE1 in FRET verringern, FRET - Effizienz kann &quot;invertiert&quot; werden , um eine positive Signaländerung zu präsentieren bei der Bindung des Analyten wie wir es hier zu tun, mit E SE = 1 - CSE / Aem oder E QE = QE / (AEM x QS). Analyse von the FAP ist, um eine ordnungsgemäße Korrektur der FRET-Verhältnisse und der Schätzung von Ei empfindlich. Es kann mit dem gleichen Kalibrierungsprobe für QS und einem herkömmlichen Endpunkt - FRET - Effizienz - Test verwendet geschätzt werden als Ei = 1- (QE / Dem) (QE Bild gefolgt von Acceptor Photobleaching und einem Dem Bild) 28, sondern muss darauf geachtet werden , zu minimieren versehentliche Bleichen des Spenders. Wir beschreiben eine modifizierte Version , in der die Schätzung von Dem basierend auf Aem für QS eingestellt wird ersetzt, dh Ei = 1 - (QE / (AEM x QS)). Alternativ Ei = CSE / Aem verwendet werden. Die Einschätzung von Ei in lebenden Zellen erfordert, dass alle Sonden auf volle FRET gefahren werden. Dies ist schwierig für die Sonden in der Praxis zu erreichen, wie ICUE1 die bei der Bindung des Analyten in FRET verringern. Eine In - vitro - basierte Berechnung von Ei unter Verwendung von Zelllysaten und gereinigten Analyten ist am besten, aber nicht in den Anwendungsbereich dieser Arbeit. Hier empfehlen wir 2 &#39;mit, 5&#39;-Didesoxyadenosin cAMP in den Zellen zu verringern. Jedoch kann eine relativ FAP be berechnet ein Ei Schätzung unter Verwendung von aus dem Basisniveau der Signalisierung abgeleitet. Aus diesen Gründen Studien berichten meistens der FRET-Verhältnis (wie hier geschehen) oder ein relatives auf Endpunkt Kalibrierung basierend FAP, wobei die Signalisierungsbasislinie vor Agonist Zugabe ist die untere Grenze und das Signal nach einer zweiten Agonist hinzufügen, die Signalisierungs sättigt die obere gebunden. Forskolin wird oft als Steuer Agonist verwendet cAMP Signal zu sättigen. Alternativ kann ein cAMP-Analogon wie 8-Bromadenosin 3 &#39;verwendet werden, 5&#39;-Monophosphat. Positive Kontrollen bei Beendigung der Studien verwendet, um mögliche Veränderungen in den Signalweg zwischen experimentellen Behandlungen identifizieren empfohlen. Berechnung der durchschnittlichen Signalantwort pro Zelle erfordert die Berücksichtigung mehrerer Faktoren. Erstens sollte die durchschnittliche FRET - Verhältnis als Mittelwert der Verhältnisse innerhalb einer Zelle, dh (Σ (QE/cAem)) / (Anzahl der Pixel), anstelle der ra bei jedem Pixel berechnet werdentio des durchschnittlichen QE und AEM in einer Zelle, dh (ΣQE) / (ΣcAem). Obwohl diese nicht vorsichtig Maskierung erfordert als Hintergrundrauschen gering ist, unterschätzt sie streng die wahre durchschnittliche FRET-Verhältnis. Jedoch erfordern Pixelverhältnisse Fließkommaberechnung und vorsichtig binäre Maskierung der Zellfläche die ROIs und vermeiden Aufnahme von unechten Verhältnisse von Hintergrundgeräuschen außerhalb der Zelle erzeugt zu definieren. Die gesamte Zellenbereich muss Vorbelastungs Ergebnisse auf der Zellform zu vermeiden, werden quantifiziert. Die Maskierung benötigen im Laufe der Zeit in Abhängigkeit von Änderungen in der Zellform und der Migration neu definiert werden. Alternativ ROIs größer ist als die Zelle kann verwendet werden, wenn Ausschlusskriterien definiert werden Pixelverhältnisse von QE und Aem Signale zu entfernen, die auch fallen unter zellulärer Ebene und sind in der Nähe von Hintergrundwerten liegen. Die beschriebene Analyseverfahren sollen die grundlegenden Schritte in dieser Arbeit für FRET-Analyse ohne spezielle Software / Plugins verwendet. Hersteller von Mikroskopen und anderen Anbietern verkaufen Add-on-Moduls für ihre Mikroskop-Software, die automatisierte ratiometrischem unterstützen und Analyse FRET. Ebenso hat die Public Domain ImageJ Software mehrere Plugins für Partikel und FRET-Analyse, wie RiFRET. Zweitens ist die pixelbasierten durchschnittlichen FRET Verhältnis unterschätzt die wahre mittlere Verhältnis der 3D-Zellstruktur, weil ein 2D-Bild verwendet wird. Die 2D-Signale darstellen und die mittlere entlang der z-Achse. Berechnung der 3D räumlichen Verteilung von FRET - Verhältnisse in lebenden Zellen nicht möglich ist, ohne Hochgeschwindigkeits - 3D - Bildgebung (z. B. unter Verwendung von Spinnplatten konfokale Mikroskopie). Dies ist ein Problem für die 2D- und 3D-Kulturen, aber einen größeren Effekt in 3D, da mehr der Zellstruktur aus der Ebene existiert. Dies ist von großer Bedeutung für die Sonden, die an zellulären Strukturen, wie beispielsweise die Plasmamembran EPAC1 Sonde PM-ICUE lokalisieren. Siehe Spiering et al. 2013 Vorschläge für die Zelldicke Auswirkungen auf die Berechnungen des Verhältnisses von 24 zu korrigieren. Analyse der Verteilung von Aem kann verwendet werden,erkennen, ob Sonde in Regionen der Zelle und Abbildungsebene eingestellt ansammelt. Dies wird auch dazu beitragen , die räumliche Verteilung der FRET - Verhältnisse zu interpretieren und zu falschen Ergebnissen zu beseitigen, z. B. Sonde Sättigung zu identifizieren (dh eine niedrige Aem Region niedrige Sondenkonzentration aufweisen und Sondensättigung und hohe FRET - Verhältnis aufweisen). Drittens können unterschiedliche FRET Ausgangswerte einen Unterschied in der Transfektionseffizienz zeigen Sonde Ausdruck oder basalen Signalisierung zwischen den Versuchsgruppen. &quot;Relative-Analyse&quot; (Schritt 10.1.1) hilft Drift in der FRET-Verhältnis im Laufe der Zeit zu entfernen, falls vorhanden. Es erleichtert den Vergleich der relativen Größe der Antworten zwischen den Proben, sondern behindert Vergleich zum Zeitverlauf der Reaktion für die Referenzprobe (Kontrollparzelle ist eine flache Linie). &quot;Absolute Analysis&quot; (Schritt 10.1.2) erleichtert den Vergleich der Geschwindigkeit der Reaktion in Proben, aber behindert Vergleich der Größe der Reaktion, da jede Zeile durch eine dissim skaliertIlar konstant. Studien verwenden häufig eine lineare Regression auf der Basislinie für die Drift in der FRET-Verhältnis über die Zeit zu korrigieren. Die beschriebene 3D-FRET-Verfahren ist eine nützliche und praktische Weise Zeitraffer-Bildgebung von Zellen beladen 3D Hydrogele herzustellen und auszuführen, die zu anderen Sonden und Bildgebungsverfahren angewendet werden kann. Andere FRET-System neben einkettigen binären Sonden komplexere Korrektur der Intensitätsbasierte Signale erfordern, wie oben diskutiert. Alternativ Fluorescence Lifetime Imaging von FRET (FLIM-FRET) verwendet werden FRET-Effizienz über eine Änderung der Emissionslebensdauer der Sonde Spender zu berechnen. Anders als Intensität basiert FRET, FLIM-FRET ist unempfindlich gegenüber Hintergrundrauschen, spektralen Durchbluten, Quanteneffizienz und die spektrale Empfindlichkeit des Detektors 2. FLIM - Systeme sind jedoch teuer, komplex und ungewöhnlich, und die Arbeit am besten mit Fluorophore mit einzelnen Exponenten Zerfall und keine FLIM Run-off - 49. Das beschriebene Verfahren kann auch mit Mo verwendet werdenWiedermikroskopieplattformen (z. B. FRET-TIRF, Fluoreszenzanisotropiemessungen und spektrale Korrelation FRET). Die Anwendung dieser Methode auf die 3D-Bildgebung mit hoher Geschwindigkeit konfokale und Multiphotonen-Mikroskopie wird Analyse der subzellulären Verteilung von Signalantwort erleichtern und erhöhen die Genauigkeit der Analyse zu signalisieren. Diese 3D-FRET-Methode erweiterte Zellbiologie Studien in simulierten 3D-zellulären Mikroumgebung ermöglichen. Als solches kann es leicht zu Pharmakologie und der regenerativen Medizin Bedürfnisse angewendet werden, einschließlich interzelluläre Signalübertragung zu studieren und Screening-Arzneimittelreaktion in engineered Hydrogel-basierte microtissues.

Cellular-Signalisierung ist sowohl komplex als auch Folge für zahlreiche Felder, einschließlich Pharmakologie, Tissue Engineering und der regenerativen Medizin. Nützliche Prüfpräparat Werkzeuge nötig sind, um unser Verständnis der Zellbiologie zu fördern und optimale Materialien für die Geweberegeneration zu entwickeln. Förster - Resonanzenergietransfer (FRET) Bildgebung ist ein wichtiges Werkzeug , um die Analyse der Rezeptoraktivierung, molekulare Konformation und supramolekularen Wechselwirkungen (z. B. Protein / DNA - Komplexbildung ) in lebenden Zellen. FRET ist eine Art von nicht-radiative Energieübertragung zwischen Fluorophoren 1. Es hat einen Wirkungsgrad, der zwischen einem Donor-Fluorophor und dem Akzeptor-Fluorophor umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Abstandes ist. (- 10 nm typischerweise 1) 2 Somit kann Informationen über die räumliche Distanz zwischen zwei verschiedenen Molekülen oder zwischen den Regionen eines Moleküls im Nanometerbereich sorgen. Die Spender und Akzeptor-Fluorophore können verschiedene m seinolecule Typen (hetero-FRET), in dem der Spender die höhere Energieemission (kürzere Wellenlänge) aufweist, oder des gleichen Typs (homo-FRET). FRET-Bildgebung kann auf feste oder lebenden Zellen durchgeführt werden, aber im Allgemeinen fixierten Zellen werden für die Bildgebung von molekularen Wechselwirkungen mit hoher räumlicher Auflösung verwendet wird, wenn Hochgeschwindigkeits-konfokale Systeme nicht verfügbar sind. Lebende Zellen werden verwendet , Interaktionen und Prozesse zu untersuchen , die inhibiert werden oder durch Fixierung verändert, wie das Echtzeit - intrazelluläre Signalantwort 3. Studien an lebenden Zellen, die beschäftigen FRET-Imaging-Anwendung zweidimensionale (2D) Zellkulturen zum Teil wegen der Einfachheit und geringeren Hintergrund (keine Emission von aus der Ebene Zellen). Jedoch auch 2D - Kulturen zahlreiche zelluläre Prozesse , verglichen mit der physiologischen Mikroumgebung und dreidimensionale (3D) Kultur 4,5 verändern. Zum Beispiel nativen Zelle zu Zelle und Zelle zu extrazellulären Matrix-Interaktionen werden in 2D-Kultur drastisch verändert den eas führendenily beobachteten Veränderungen in der Zellmorphologie und Polaritäts 6. Membranmikrodomänen (z. B. Caveolae und Lipid Rafts) und Rezeptor - Signal werden von der Kulturumgebung, teilweise stark reguliert , weil sie Zytoskelett - Komponenten 7,8 und die Zellform und Zytoskelettstruktur binden , werden stark von der räumlichen Kulturumgebung geregelt 9. Mechanotransduktion wird nicht nur durch die Matrix 3D beeinflusst, sondern durch den komplexeren sekundären Belastungsbedingungen erzeugt in 3D - Umgebungen im Vergleich zu 2D - Kulturen 10. Schließlich ist die Durchlässigkeit von 3D-Matrices weniger als das Kulturmedium im allgemeinen mit der Diffusion verringert und eine erhöhte Zellbindungsmoleküle im Vergleich zu 2D Kulturen signalisiert. Mit der 3D-Kulturen ist eine Lage, eine Mikro mehr ähnlich der physiologischen in Bezug auf Klebstoff, chemische und mechanische Signale zu erzeugen und zu beobachten. Zell-Zell-Wechselwirkungen gefördert werden, und die Klebeeigenschaften können gesteuert werden, wit der Struktur, Zusammensetzung und Architektur (Strukturierung) des 3D - Material 11-13. Die mechanischen Eigenschaften des Materials kann ebenfalls durch die Zusammensetzung und Struktur 14,15 zugeschnitten werden. Kultivieren von Zellen in Hydrogelen daher ermöglicht FRET Untersuchungen an primären Zellen , die sonst dedifferenzieren oder Änderung im Phänotyp würde unter Verwendung herkömmlicher Techniken, z. B. Zellen , die aus Gelenkknorpel. Somit wird ein Verfahren benötigt, FRET-Assays mit lebenden Kulturen 3D zu ermöglichen. Hydrogele Gerüste sind ideal für 3D-FRET-basierte Studien, weil sie optisch transparent gemacht werden können und zugeschnitten auf die Mikroumgebung zu steuern und zelluläre Signale zur Verfügung zu stellen. Hydrogele hergestellt aus natürlichen Polymeren wurden in der Zellkultur seit Jahrzehnten, einschließlich Gelatine und Fibrin 16 verwendet. Größere Kontrolle über die zelluläre Mikroumgebung kann mit chemischen Modifizierung dieser Polymere mit der Verwendung von synthetischen Polymeren 17,18 erreicht werden. HydrOGEL mechanische Steifigkeit und Permeabilität kann durch Änderung ihrer polymeren Zusammensetzung und Maschenweite (Polymer und die Vernetzungsdichte) 19,20 gesteuert werden. Ferner können Hydrogele bioaktiven durch den Einbau von Wachstumsfaktoren und zellulären Liganden hergestellt werden. Aufgrund dieser Möglichkeiten, die Entwicklung von Hydrogelen für die Biosensorik, Arzneimittelabgabe, und Tissue Engineering - Anwendungen ist ein sehr aktiver Forschungsbereich 21. 3D - Druck von Hydrogelen ist auch die Entwicklung für die Herstellung von Mikrogewebe unterzogen und -organs 15. Somit FRET Bildgebung von Zellen in Hydrogelen ist nicht nur nützlich als ein Mittel physiologischen zellulären Verhalten anzunähern, aber auch als Hilfsmittel zum Studium und konstruiert Gewebewachstum zu optimieren. Binary ratiometrisch FRET-Sonden sind sehr nützlich in zelluläre Signal studieren und kann in Hydrogels Kulturen eingesetzt werden. Für eine unvollständige Liste der veröffentlichten fluoreszierenden Sonden und FRET finden Sie in der Zellmigration Consortium Website <sup&gt; 22. Die häufigste Sondentyp enthält zwei verschiedene Fluorophore, die von einem Erkennungselement (e) (Analyt empfindlichen Bereich) assoziiert oder verbunden sind. Diese Bereiche werden einer Konformationsänderung, Assoziation oder Dissoziation bei Detektion des Analyten (z. B. die Bindung eines Ions oder Moleküls, enzymatische Spaltung der Region), der den Abstand zwischen den Fluorophoren und daher der FRET Grße verändert (entweder höher oder niedriger) 23. Eine weniger häufige, aber nützliche Sondentyp stützt sich auf einen Analyten empfindlich Veränderung der spektralen Überlappung der beiden Fluorophore, die FRET-Größe verändert. &quot;Single-chain&quot; ratiometrisches Sonden verwenden ein Fluorophor Paar auf einem einzigen Molekül verbunden. &quot;Dual-Kette&quot; -Sonden Fluorophor - Paare auf separaten Molekülen nutzen, aber ihr Ausdruck kann unter der gleichen Expressionskassette 24 gekoppelt werden. Im Gegensatz zu Studien mit einzelnen Fluorophor Ausdruck (z. B. fluoreszierende Fusionsproteine), Studien mit ratiometrischemFRET-Sonden erfordern keine dual-Transfektion für die Transfektionseffizienz oder die Lebensfähigkeit der Zellen zu steuern. Ratiometrisch FRET - Sonden sind relativ unempfindlich gegen Transfektionseffizienz wenn sie über eine Mindestschwelle (Konzentration unempfindlich) 23,25 ausgedrückt. Sie sind unempfindlich gegen Anregungsquelle Schwankungen und anderen intrazellulärer Umgebungsfaktoren (z. B. pH, Ionen) so lange beide Fluorophore ähnlich reagieren. Darüber hinaus ist ihre Reaktion nicht unter Transkriptions Verzögerung, im Gegensatz zu Leuchtstofflampen und Biolumineszenz - Promotor-Reporter - Konstrukte 26,27. Ratiometrisch FRET-Sonden sind leicht und häufig in herkömmlichen Weitfeld- Epifluoreszenzmikroskope Systemen eingesetzt. Weitfeld-Mikroskope sind über die Leitung konfokalen Systeme für Live Cell Imaging bevorzugt aufgrund von Bedenken über die Systemkosten, Fluorophore Bleichen und Erfassung von Signaländerungen mit ausreichender zeitlicher Auflösung. Darüber hinaus einzelne Zelle anallyse über eine große Population von Zellen ist mit einer motorisierten Stufe und Bilderfassung über mehrere Sichtfelder. Weitfeldmikroskopie erfordert Intensität basierte Analyse der Hetero-FRET-Sonde Signale. Obwohl Intensitätsanalyse nicht komplex erfordert Hardware wie andere FRET Methoden, mehr nach dem Erwerb Arbeit ist erforderlich , 28 für die Effekte von Fluorophor Verhaltensweisen und Mikroskop / Imaging - System - Konfigurationen zu korrigieren. Die erfassten Emissionsintensität eines Fluorophors ist eine Funktion der Anregungsenergie, Fluorophor Quantenausbeute und die kombinierte Filter- und Kamera / Detektor spektrale Empfindlichkeit und Linearität 2. Diese können für unterschiedliche Donor und Akzeptor und Kalibrierung für quantitative Analyse erfordert. Zusätzlich Abbildung der Akzeptor - Emission wird durch die spektrale Überlappung der Fluorophore (Anregung des Akzeptors durch Geberanregungslicht und Durchbluten von Donoremission in die Akzeptor - Emissionsspektren) 2 beeinflusst.4; Einzelketten &quot;-Sonden sind intern normalisiert , weil ihre Fluorophore auf der Nanoskala äquimolare sind, während die Fluorophore von&quot; Dual-Kette &quot;Sonden an verschiedenen Stöchiometrien während einer Zelle 25,28 existieren kann , wenn die Fluorophore.&quot; Single-chain &quot; Sonden sind von ähnlicher Helligkeit (Funktion des Extinktionskoeffizienten und Quantenausbeute) wird die Auswirkungen der nichtlinearen Detektorempfindlichkeit sind klein und nur Korrektur für die Hintergrundfluoreszenz und die gekoppelte Quantenausbeute / Detektorempfindlichkeit 23 benötigt. Somit &quot;single-chain&quot; ratiometrisch FRET - Sonden werden am einfachsten in der Weitfeldmikroskopie 24 umgesetzt. Dieses Dokument beschreibt eine einfache Technik FRET Abbilden von lebenden Zellen in 3D Hydrogels Kulturen führen eine konventionelle Weitfeld Epifluoreszenz-Mikroskop. Es kann von Laboratorien leicht angenommen werden bereits FRET-Experimente in 2D als auch Labors interessiert sich unter Durchführungzelluläre Signal in microtissues. Hier zeigen wir die Methode mit FRET-Bildgebung auf Basis Messung von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) Ebenen in lebenden Chondrozyten innerhalb Photo (PC-Gel, Polyethylenglykoldimethacrylat) und thermoresponsiven (TR-Gel, Matrigel) Hydrogele. A ratiometrisch FRET-Sonde basiert auf EPAC1 (ICUE1) verwendet, um die cAMP-Spiegel in Reaktion auf Forskolin, einem chemischen Agonist für Adenylylcyclase detektieren, die die Umwandlung von ATP zu cAMP katalysiert. cAMP ist eine der Haupt second messengers vermittelnde G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Signal und verschiedene Faktoren aktiviert, einschließlich der nachgeschalteten Wechsel Proteine ​​direkt aktiviert durch cAMP (EPACs). Die Fluorophore auseinander bewegen, auf cAMP an das EPAC-Bindungsdomäne zu einer Verringerung des FRET führt. Beschrieben ist hier die Herstellung der Hydrogel-Materialien, Zell Transfektion mit dem ICUE1 Sonde, und Einbetten der Zellen in 3D-Hydrogele. Das 3D-FRET-Experiment Verfahren und die Bildanalyse notwendigSonde Aktivität pro Zelle zu bewerten sind, erläutert. Wir diskutieren auch die inhärenten Grenzen der FRET-Analyse in 2D und 3D mit Weitfeldmikroskopie. Die hier vorgestellte Technik ist eine Verbesserung gegenüber den bestehenden 2D-Verfahren, da sie eine Analyse in einer physiologischen Kontext ermöglicht und erfordert weniger Bildkorrektur und Kalibrierung. Große Nützlichkeit liegt in der Tatsache, dass viele transparente Materialien verwendet werden können, während die Zelle und Transfektion Präferenzen aufrechterhalten werden kann.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit]</td><td>Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)</td><td>NC0162601</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>Polyethylenglykoldimethacrylat (PEGDM)</td><td>Hergestellt nach Lin-Gibson mit PEG von Sigma Aldrich</td><td>95904</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6514</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>3- Glycidoxypropyltrimethoxysilan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440167</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>Dimethylphenylphosphonit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>149470-5g</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>2,4,6-Trimethylbenzoylchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC244280100</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>2-Butanon</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC149670010</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>Lithiumbromid</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC199871000</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>190764</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>Sigmacote (silikonisierendes Reagenz)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>Toluol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC36441-0010</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3025601</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, kein Phenolrot (phenol- und serumfreies Medium)</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>FuGENE HD Transfektionsreagenz (Transfektionsreagenz)</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>Cellstripper (Zelle Dissoziationslösung)</td><td>Corning</td><td>25-056-CI</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>Wachstumsfaktor reduziert Matrigel, phenolfrei</td><td>Corning</td><td></td><td>356231 Reagenzien</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (10,200,1,000 &mu; l)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td><td>Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Puderfreie Untersuchungshandschuhe</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-149-863B</td><td>Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Biopsie-Stanze (3 mm)</td><td>Miltex</td><td>3332</td><td>Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Glas-Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544C</td><td>Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Vorbeschichtete Glasdeckgläser (Epoxysilan)</td><td>Arrayit</td><td>CCSL</td><td>Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550D</td><td>Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Sterile Fläschchen (15 ml, 50 ml konisch)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C, 14-959-49A</td><td>Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Zellkulturschale (6- well)</td><td>Falcon</td><td>351146</td><td>Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Epifluoreszierendes Mikroskop mit motorisiertem Tisch</td><td>Nikon</td><td>MEA53100 (Eclipse TiE Inverted)</td><td>Große/nicht einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Verstellbarer Probenhalter für XY-Tisch</td><td>Nikon</td><td>77011393</td><td>Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>60X (1,3 NA) Objektiv (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td><td>Nikon</td><td>MRD01605</td><td>Halterungen</td></tr><tr><td>für Nicht-Einweg-Laborgeräte CFP/YFP-Lichtquelle und Anregungs-/Emissionsfilterhalter (Lambda-Lichtquelle & -rad, Lambda-Emissionsfiltersystem)</td><td>Nikon (Händler von Sutter Instrument)</td><td>77016231, 77016088</td> Nicht <td>einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>CYF/YFP-Filterset</td><td>Nikon (Chroma Technology Corp)</td><td>77014928</td><td>Nicht einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Kamera (ORCA Flash 4.0 v1)</td><td>Nikon (Hamamatsu) Wiederverkäufer)</td><td>77054076</td><td>Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>NIS-Elements 40.20.02 Mikroskopsoftware)</td><td>Nikon</td><td>MQS31100&nbsp;</td><td>Nicht wegwerfbare Laborgeräte</td></tr><tr><td>Prism (Tabellenkalkulations- und Grafiksoftware)</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>Version 6</td><td>Nicht wegwerfbare Laborgeräte</td></tr><tr><td>OmniCure S1000 UV-Punkthärtungslampensystem mit 365-nm-Filter oder anderer Lichtquelle (&lambda; = 365 oder 405)</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td>Große/nicht wegwerfbare Laborgeräte</td></tr><tr><td>Pipettenhilfe</td><td>Drummond Scientific Co.&nbsp;</td><td>DP-100</td><td>Nicht-Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>Reichert Bright-Line 1475</td><td>Nicht-Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Vakuum-Exsikkator-Kammer/Entgaser&nbsp;</td><td>Alle</td><td></td><td>großen/nicht wegwerfbaren Laborgeräte</td></tr><tr><td>Gewebekulturhaube&nbsp;</td><td>Alle</td><td></td><td>großen/nicht wegwerfbaren Laborgeräte</td></tr><tr><td>Chemische Abzugshaube&nbsp;</td><td>Alle</td><td></td><td>Große/Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Ofen</td><td>Alle</td><td></td><td>Große/nicht Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Alle</td><td></td><td>Nicht-Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Becher</td><td>Alle</td><td></td><td>Nicht-Einweg-Laborgeräte</td></tr><tr><td>Inkubator&nbsp;</td><td>Alle</td><td></td><td>großen/nicht wegwerfbaren Laborgeräte</td></tr></tbody></table>

fret-imaging im dreidimensionalen hydrogelen

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging von Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Zellbiologie in Echtzeit zu untersuchen. Studien FRET unter Verwendung allgemein zweidimensionale (2D) Kultur eingesetzt werden, die nicht die dreidimensionale (3D) zelluläre Mikroumgebung nicht imitieren. Ein Verfahren zur abgeschreckt Emission FRET-Bildgebung durchführen unter Verwendung herkömmlicher Weitfeld- Epifluoreszenzmikroskopie von Zellen in einer 3D-Hydrogel-Umgebung vorgestellt. Hier ist eine Analysemethode für ratiometrisches FRET-Sonden, die lineare Verhältnisse über die Sonde Aktivierungsbereich ergibt beschrieben. Messung des intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) Ebenen wird in Chondrozyten unter Forskolin-Stimulation unter Verwendung einer Sonde für EPAC1 Aktivierung (ICUE1) und die Fähigkeit, zu erkennen, Unterschiede in der cAMP-Signalisierungs abhängig von Hydrogelmaterial Typ, hierin ein Photo Hydrogel (PC-Gel zeigte, Polyethylenglykoldimethacrylat) und einem Hydrogel thermoresponsive (TR-Gel). Im Vergleich zu 2D-FRET-Methoden,Diese Methode erfordert nur wenig zusätzliche Arbeit. Laboratories bereits FRET-Bildgebung in 2D verwendet, kann diese Methode leicht annehmen zelluläre Studien in einer 3D-Mikroumgebung auszuführen. Es kann weiter auf einen hohen Durchsatz Wirkstoff-Screening in engineered 3D microtissues angewendet werden. Darüber hinaus ist es kompatibel mit anderen Formen der FRET-Bildgebung, wie Anisotropie Messung und Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) und mit erweiterten Mikroskopie-Plattformen mittels konfokaler, gepulst oder modulierte Beleuchtung.

Alle Hydrogel-Vorläufer, Zellen und Gießformen wurden hergestellt, wie oben beschrieben. Die Zellbeladenen Vorläuferlösungen wurden in PDMS Formen gegossen und dann vor dem Gelieren zentrifugiert / Photozellen in der Nähe des Deckglases zu immobilisieren und zu erleichtern FRET Bildgebungsanalyse (Abbildung 1). Die Hydrogele mit angebrachtem Deckgläser wurden in vorbereitete PDMS Bildgebungs Vertiefungen für mikroskopische Abbildung (Abbildung 2) angeordnet ist . Die optischen Konfigurationen und Bildaufnahmeparameter wurden dann eingestellt , wie in 3A gezeigt. Erfassung aller vier FRET im Zusammenhang mit Bildkanäle für CFP-YFP Fluorophor - Paare (siehe unter &quot;Optical Conf.&quot; In Abbildung 3) gezeigt, wie für nicht-binäre Sonden benötigt wird. Doch in dieser Arbeit nur zwei Bilder für die einzelnen Kette binären ICUE1 Sonde, QE = &quot;CFP CFP&quot; und AEM = &quot;YFP YFP&quot; (Anregung Emission) erforderlich. Mehrere FOVs (xy-Positions) wurden ausgewählt , in denen mehrere Zellen innerhalb der homogenen Beleuchtungsbereich residiert (3B). Nach Zeitraffer Akquisition wurde die Signaldaten für die Sonde exportiert. ROIs für die Hintergrundkorrektur von Kanalsignalen und für die Zellanalyse wurden unter Verwendung gethresholdeten Aem Bilder von Beginn der Experimente (Abbildung 4) bezeichnet. Die Zellen wurden aus den Reihen der Zellpool als diejenigen ausgewählt ausdrücken ausreichend (nicht zu dunkel), aber nicht zu hoch (zu hell) Sonde (4B). Die QE und SE FRET Verhältnisse pro Pixel bei jeder Akquisition wurden berechnet Gleitkommadivisionsschaltung der Hintergrund subtrahiert Bildkanäle. Die durchschnittliche FRET - Verhältnis pro Zelle (dh pro ROI) berechnet wurde, normiert auf das Basissignal vor der Stimulation (dh eine Regression auf der Basislinie von allen Zeitpunkten subtrahiert) und aufgetragen mit Fehlerbalken als Standardfehler des Mittelwert (SEM). Sowohl die QE und CSE basierte FRET-Verhältnisse deZum Schutz des erhöhten cAMP - Aktivität in Chondrozyten unter Forskolin - Stimulation (100 nM, Abbildung 5). Die QE FRET-Verhältnis war empfindlicher gegenüber Hintergrundkorrektur ist als das Verhältnis CSE FRET weil das QE-Signal aufgrund der niedrigen Grundniveau der cAMP-Aktivität geringer war innerhalb der Hydrogele in Chondrozyten eingebettet. Beide Hydrogel - Typen (TR-Gel und PC-Gel) zeigte einen Anstieg in FRET - Verhältnis über die Zeit (Abbildung 6), was auf eine erhöhte cAMP - Signalisierung Reaktion auf die Zugabe von Forskolin. Wie durch das QE FRET - Verhältnis angegeben, zeigen Chondrozyten in PC-Gel - Hydrogele eine größere Änderung in cAMP (gezeigt) und eine höhere Grundniveau von cAMP (E QE = 0,19 in PC-gel vs. E QE = 0,09 in TR-Gel, nicht in Basislinie subtrahiert Figur nicht gezeigt). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> Abbildung 1: Zellverteilung in photo Hydrogels (PC-Gel) </strong&gt; A: Die Zelle beladene Hydrogel-Vorläufer wurde zentrifugiert, um die Anzahl von Zellen in einer Brennebene in der Nähe des Deckglases zu maximieren. B: Dies erhöht die Anzahl von Zellen in dem FOV und minimiert Signal Hintergrund von aus der Ebene Zellen. (Maßstabsbalken = 200 &amp; mgr; m) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> Abbildung 2: Hydrogele in PDMS Dish Das Hydrogel wurde in einem riesigen PDMS gut (10x Volumen von Hydrogel) mit einem Deck Basis für mikroskopische Bildgebung und Analyt Stimulation platziert. Die PC-Gel-Hydrogele sind transparent und auf dem Deckglas verbunden, so dass sie während des Tests an Ort und Stelle bleiben. Die PDMS kann auch größer gemacht werden, 10x Medium als das Hydrogel Volumen enthalten eine breitere Biopsie Punch zusätzlich zur Verwendung beihicker PDMS Blatt. (Maßstab = 2 mm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> Abbildung 3: Acquisition Konfiguration für FRET - Imaging A: alle 7 sec an mehreren Standorten Die Akquisition wurde für die Bilderfassung konfiguriert. Für QE FRET Verhältnis Berechnung werden nur zwei Bildkanäle für die ICUE1 verwendete Sonde benötigt hier (binär single chain-Sonde), QE = &quot;CFP CFP&quot; und AEM = &quot;YFP YFP&quot; (Anregung Emission) im Rahmen der &quot;Optical Conf.&quot; Spalte in der λ-Registerkarte des Mikroskop-Software. B: FOVs ( &quot;XY&quot; Positionen) wurden ausgewählt, in denen mehrere Zellen innerhalb des homogenen Beleuchtungsbereich wohnhaft war. Das Grundstück unterhalb des Bildes zeigt die Beleuchtungsintensität entlang der blauen Linie arroweddass quert durch das Zentrum des FOV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> Abbildung 4: Auswahl von ROIs für FRET - Imaging - Analyse A: Eine Region von Interesse (ROI) frei von Zellen wurde für das Hintergrundsignal auf jedem Kanal zu korrigieren ausgewählt. Ein Bild eines zellfreien Hydrogel stattdessen für Hintergrundsubtraktion verwendet werden, wenn die Zelldichte oder Migration hoch ist, oder wenn eine Schattierungsmaske nicht verwendet wird, wenn die Zellen nicht in einer homogenen Beleuchtungsfeldes liegen. B: Die Zelle ROIs wurden ausgewählt, unter Verwendung von Bild Schwellwertbildung und binäre Maskierung des Aem Kanal. Auswählen eines ROI größer als die Zellen wird sich negativ auf die Berechnung des durchschnittlichen FRET-Verhältnis pro Zelle beeinflussen aufgrund des Einschlusses von extrazellulären Verhältnisse von Hintergrund n erzeugtoise. Die Berechnung des zellulären FRET Verhältnis der durchschnittlich pro Kanal pro Zelle wird nicht empfohlen, da dies das Verhältnis unterschätzt. (Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> Abbildung 5: Vergleich der FRET - Ratios in Thermoresponsive Hydrogels (TR-Gel) Sowohl QE und SE basierte FRET-Verhältnisse erfassen die erhöhte cAMP-Aktivität in Chondrozyten unter Forskolin-Stimulation. Forskolin ist ein Adenylzyklase-Agonist, der cAMP-Produktion induziert. FRET abnimmt , wenn die Sonde ICUE1 cAMP bindet und somit die QE FRET - Verhältnis (E = QE SQE / (Saem x QS)) zunimmt. Im Gegensatz dazu nimmt die SE FRET - Verhältnis und damit als E SE = 1 aufgetragen ist - CSE / Saem. In Hydrogel eingebettet Chondrozyten, die QE FRET-Verhältnis ist empfindlicher gegenüber Hintergrundkorrektur als das Verhältnis SE FRET, weil das QE-Signal aufgrund der niedrigen basalen cAMP-Aktivität niedrig ist. Die Fehlerbalken = SEM, n = 25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> Abbildung 6: Vergleich der FRET - Verhältnis in verschiedenen Hydrogele Die Chondrozyten in beiden Typen Hydrogel reagierte auf Forskolin-Stimulation mit einer Zunahme der cAMP-Aktivität wie durch die erhöhte QE FRET-Verhältnis über die Zeit demonstriert. Die Hydrogel - Typ wirkt sich auf die zelluläre Antwort durch verschiedene Effekte, einschließlich der Unterschiede in der Permeabilität an Forskolin und in basalen zellulären cAMP - Aktivität (E QE = 0,19 in PC-gel vs. E QE = 0,09 in TR-Gel, nicht gezeigt). Die Fehlerbalken = SEM, n für TR-Gel= 25, n für PC-Gel = 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Echtzeit Zellbiologie Studien. Hier wird ein Verfahren für FRET Abbildungszellen in physiologischen dreidimensionalen (3D) Hydrogel-Mikroumgebungen herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskopie verwendet wird präsentiert. Eine Analyse für ratiometrisches FRET-Sonden, die lineare Verhältnisse über den Aktivierungsbereich ergibt beschrieben.

FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Das übergeordnete Ziel dieser experimentellen Methode besteht darin, die Echtzeit-Untersuchung intrazellulärer Signalwege mittels FRET-Bildgebung von Zellen zu ermöglichen, die in dreidimensionalen Hydrogelen eingebett游戏副本Nachdem die Formen für das Gießen von Hydrogelen hergestellt und kultivierte Zellen gemäß dem Textprotokoll in einer Gewebekulturhaube in Hydrogel-Lösung suspendiert wurden, fügen Sie den zellhaltigen Präkursor unter sterilen Bedingungen den Gießformen hinzu. Zentrifugieren Sie vor der Vernetzung die in dem Hydrogel-Präkursor suspendierten Zellen, um die Bildgebung zu optimieren, indem die Zellen in einer einzigen Fokusebene konzentriert und das Signal außerhalb dieser Ebene minimiert werden. Anschließend vernetzen Sie die PC-Hydrogels durch Bestrahlung des zellhaltigen Präkursors mit einer UVA-Lichtquelle für eine Belichtungszeit von 3,2 Joule pro Quadratzentimeter pro Millimeter Dicke.Alternativ kann eine kostengünstigere handgehaltene Zahnarztlampe verwendet werden. Vermeiden Sie eine Überbelichtung des Hydrogels, da dies die Zellviabilität verringern würde. Physikalisch vernetzte Hydrogels werden stattdessen bei 37 Grad Celsius platziert. Nach der Vernetzung entfernen Sie die Gießform aus PDMS-Hydrogel und ersetzen Sie sie durch die zuvor vorbereitete PDMS-Schale. Drücken Sie das PDMS mit einem sterilen Spatel auf das Glas, um es anzubringen. Geben Sie ein Phenol-freies, serumfreies Medium oder ein chemisch definiertes Medium in die Vertiefung der PDMS-Schale mit Deckglas, um das Hydrogel unter Flüssigkeit zu halten.Inkubieren Sie die Petrischale 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Sobald die PDMS-Schale mit dem Hydrogel auf dem Mikroskopständer befestigt und Öl auf das Objektiv aufgetragen wurde, verwenden Sie Durchlicht, um mindestens 15 Zellen zur Abbildung zu finden, und überprüfen Sie die Transfektion mittels Fluoreszenzbildgebung. Konfigurieren Sie in der Mikroskop-Software die Kameraeinstellungen für die FRET-Bildkanäle, indem Sie einige Zellen nahe dem Zentrum des Sichtfeldes auswählen, und optimieren Sie Belichtungszeit und Verstärkung für jeden Bildkanal gemäß dem Textprotokoll.Wählen Sie Zellen aus, die nahe dem Zentrum des Hydrogels liegen, innerhalb eines relativ flachen Beleuchtungsfelds, das weder zu hell noch zu dunkel ist, und die ein FRET-Verhältnis zwischen 0,0 und 1,0 aufweisen. Wählen Sie anschließend mehrere Bildfelder aus, um Aufnahmen von mindestens 15 transfizierten Zellen anzufertigen. Schalten Sie nach Beendigung das Licht aus, um die Belichtung zu begrenzen.Um die Aufnahmegeschwindigkeit für die zeitrafferartige Bildaufnahme zu konfigurieren, geben Sie die Periodizität der Aufnahmen ein. Verwenden Sie eine hohe Geschwindigkeit für die Erfassung des Basiswerts, beispielsweise alle fünf Sekunden pro Bildfeld, und eine langsamere Geschwindigkeit für die anschließende Erfassung langfristiger Signalverläufe. Wählen Sie „Jetzt starten“, um die Bildaufnahme zu beginnen und fünf Minuten lang Bilder aufzunehmen, um einen Basiswert für die Probenreaktion im festgelegten Bildfeld zu etablieren.Nach den fünf Minuten der Bildaufnahme pipettieren Sie das gewünschte Agonist- oder Antagonistenmittel zu, mischen durch Pipettieren und setzen die Bildaufnahme fort. Nach Durchführung der FRET-Kalibrierung gemäß dem Textprotokoll wählen Sie im Mikroskop-Software das Pfeilsymbol am Symbol für den interessierenden Hintergrundbereich und anschließend „Elliptischen Hintergrundbereich des Interesses zeichnen“. Zeichnen und definieren Sie je Sichtfeld einen interessierenden Bereich (ROI) in der Nähe der Zellen, um das Hintergrundniveau festzulegen.Stellen Sie sicher, dass „Weiterhin Hintergrundversatz aktualisieren“ ausgewählt ist, und aktivieren Sie anschließend die Anzeige des Hintergrund-Bereichs von Interesse, indem Sie auf das Symbol „Hintergrund-Bereich von Interesse“ klicken. Alternativ wählen Sie das Symbol für den Bereich von Interesse und setzen die Eigenschaften des Bereichs von Interesse auf „Als Hintergrund-Bereich von Interesse verwenden“ und „Bereiche von Interesse sind in jedem Mehrpunkt unterschiedlich“. Wählen Sie mithilfe des Hintergrund-Bereichs-von-Interesse-Symbols die Option „Hintergrund mithilfe des Bereichs von Interesse subtrahieren“ aus.Wählen Sie im Popup-Fenster unter „Subtract Background Region of Interest“ die Option „Every Image“ und unter „Apply To“ die Option „All Frames“. Um für jedes Bildfeld einen interessierenden Bereich um die Zelle herum mithilfe des Akzeptoremissionskanals und einer binären Maske zu definieren, verwenden Sie das Menü „Binary“, wählen Sie „Define Threshold“ und aktivieren Sie „Apply To Current Frame“. Anschließend passen Sie die untere Schwelle an, um die Zellen auszuwählen.Verwenden Sie anschließend gegebenenfalls die Funktion Binäres Schließen, um Löcher in der binären Maske zu füllen. Nutzen Sie dann das Symbol für den Bereich von Interesse, um Binäres in Bereich von Interesse kopieren auszuwählen und die binäre Maske als Bereiche von Interesse zu speichern. Fügen Sie die Bereiche von Interesse für nachfolgende Bildausschnitte dem bestehenden Pool an Bereichen von Interesse hinzu.Löschen Sie alle zufälligen Interessenbereiche. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf die Interessenbereiche und überprüfen Sie, ob ihre Eigenschaften „Als Standard-Interessenbereich verwenden“ und „Interessenbereiche sind in jedem Mehrpunkt unterschiedlich“ lauten. Die Interessenbereiche für Zellen können manuell gezeichnet werden, es muss jedoch darauf geachtet werden, zufällige Werte zu entfernen.Das Protokoll enthält Verfahren für Zellen, die außerhalb des flachen Beleuchtungsfeldes liegen, sowie für Mikroskope, die kein flaches Feld aufweisen. Die Zentrifugation der Hydrogel-Vorläufer vor der Gelierung maximierte die Anzahl der Zellen in einer Fokusebene nahe der Deckglasoberfläche. Dies minimierte das Hintergrundrauschen und erhöhte die Bildaufnahmeeffizienz.Bei diesem FRET-Experiment zur Berechnung des FRET-Verhältnisses für die abgeschwächte Emission (QE) waren nur zwei Bilder für die einkettige binäre ICUE1-Sonde erforderlich, wobei QE gleich CFP CFP für Anregung und Emission sowie Akzeptoremission gleich YFP YFP für Anregung und Emission ist. Es wurden mehrere Aufnahmebereiche ausgewählt, in denen sich jeweils mehrere Zellen innerhalb des homogen beleuchteten Bereichs befanden, wie hier dargestellt. ROIs zur Hintergrundkorrektur der Kanalsignale und zur Zellanalyse wurden anhand der schwellenwertbasierten Akzeptoremissionsbilder vom Versuchsbeginn aus definiert.Zusätzlich wurden, wie hier gezeigt, Zellen ausgewählt, die ausreichend Sonden exprimierten. Das QE- und das mittels sensibilisierter Emission bestimmte FRET-Verhältnis pro Pixel sowie das durchschnittliche FRET-Verhältnis pro Zelle wurden berechnet. Der Kehrwert des SE-Verhältnisses wurde ermittelt, und beide Verhältnisse wurden normalisiert.Unter der Forskolin-Stimulation zeigen sowohl die auf QE als auch auf SE basierenden FRET-Verhältnisse eine erhöhte cAMP-Aktivität in Chondrozyten. Sowohl physikalisch als auch chemisch vernetzte Gele zeigten im Zeitverlauf eine Zunahme des QE-FRET-Verhältnisses, was auf eine verstärkte cAMP-Signalantwort nach Zugabe von Forskolin hinweist. Dieses Verfahren kann mit anderen Mikroskopietechniken wie FRAP, FLIM-FRET sowie FRET- und Anisotropiemessungen kombiniert werden, um Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Unterschiede in der Permeabilität und zellulären Signalgebung zwischen verschiedenen Mikrogewebetypen bestehen.Da die Vernetzung nahe dem PDMS unterbunden wird, ist es wichtig, die Formen für die photochemisch vernetzenden Hydrogelen etwas größer im Durchmesser als die Hydrogelen selbst zu konstruieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

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