Eine Phänotypisierung Regimen für genetisch modifizierte Mäuse verwendet, um Gene in menschlichen Krankheiten des Alterns Beteiligt Study

Das übergeordnete Ziel dieses Testschemas ist es, eine Reihe einfacher Tests zu etablieren, die als erste Phänotypisierungspipeline verwendet werden können, um spätere detaillierte Untersuchungen zu Verhaltensphänotypen und der Struktur und Funktion von Geweben zu leiten. Ob die verhaltensbezogenen und zellulären Phänotypen menschlicher Krankheiten im Mausmodell rekapituliert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Tests in Laboratorien durchgeführt werden können, die keine Vorkenntnisse in solchen Experimenten haben, ohne nennenswerte Investitionen, aber dennoch fundierte weitere Detailstudien durchführen können.

Führen Sie den Test der hinteren Gliedmaßen täglich vom vierten bis zum 10. Tag nach der Geburt durch, um die Kraft, Schwäche und Ermüdung der proximalen Muskeln der hinteren Gliedmaßen zu beurteilen. Lassen Sie die Mäuse zu Beginn 30 Minuten lang an den Testbereich gewöhnen. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine neue konische Tube von 500 Millilitern vor, indem Sie sie mit 70% Ethanol auswaschen und dann ein oder zwei Wattebällchen in den Boden der Tube schieben.

Befestigen Sie dieses Rohr für den Test in einer vertikalen Position. Wenn sie nicht getestet werden, behalten Sie die Welpen bei der Hütin, um ihre Temperatur zu halten. Nach der halbstündigen Eingewöhnung nehmen Sie einen Welpen aus dem Käfig und notieren Sie sein Gewicht.

Hängen Sie dann das Neugeborene vorsichtig an seinen Hinterbeinen über den Rand der Röhre, so dass das Jungtier der Watte zugewandt ist. Zählen Sie dann die Anzahl der Pull-Versuche, die der Welpe unternommen hat, und messen Sie die Latenz, um zu sinken. Nachdem Sie 30 Sekunden gewartet haben, wiederholen Sie den Test.

Beschriften Sie den Welpen nach dem zweiten Test mit einem Marker. Reiben Sie dann den Welpen vorsichtig mit Einstreu aus dem Käfig ab und bringen Sie ihn zur Hündin zurück. Da ältere P8-Welpen nicht markiert werden können, identifizieren Sie sie mit einem Zehenschnitt.

Bevor Sie zum nächsten Welpen übergehen, wischen Sie das Reagenzglas mit 70% Ethanol ab. Führen Sie den Entwöhnungsbeobachtungstest täglich von P19 bis P21 durch, um das Bewegungs- und allgemeine Aktivitätsniveau zu bewerten. Beginnen Sie damit, die Mäuse 30 Minuten lang an den Testbereich zu gewöhnen.

Während sich die Welpen akklimatisieren, bereitest du die Arena vor. Markieren Sie eine Testbox aus Plexiglas mit einem Raster von sechs x sechs Zoll großen Quadraten. Reinigen Sie die Box vor der Verwendung mit 70% Ethanol.

Positionieren Sie dann eine Videokamera so, dass eine Seitenansicht des gesamten Kartons das Sichtfeld ausfüllt. Standardisieren Sie das Erscheinungsbild der Umgebung, um die Einführung von Neuheiten zu vermeiden. Übertragen Sie das Entwöhnungstier vor dem Test in einen sauberen Haltebecher und notieren Sie sein Gewicht.

Dann begann die Videoaufnahme. Filmen Sie zunächst einen Testausweis mit der Mausidentifikationsnummer, seinem Alter und dem aktuellen Datum. Übertragen Sie dann die Maus aus dem Haltebecher auf das mittlere Quadrat.

Zähle drei Minuten lang die Anzahl der Linien, die von beiden Vorderpfoten gekreuzt werden. Stellen Sie die Maus nach drei Minuten wieder in einen sauberen Käfig und beenden Sie die Videoaufnahme. Reinigen Sie die Box zwischen jedem Test mit 70% Ethanol.

Zählen Sie in den Videos die Aufzuchtereignisse, bei denen eine Maus mit beiden Vorderpfoten frei von der Unterstützung steht. Zählen Sie auch die Pflegeereignisse, die auftreten, wenn beide Vorderpfoten mit der Reinigung beschäftigt sind. Führen Sie den Griffkrafttest an abwechselnden Tagen zwischen P22 und P26 durch, um die neuromuskuläre Kraft zu beurteilen.

Geben Sie den Mäusen wie üblich 30 Minuten Zeit, um sich an den Testbereich zu gewöhnen. Bei der Prüfvorrichtung handelt es sich um einen Plexiglaskasten mit einem Maschengitter. Reinigen Sie beide mit 70% Ethanol.

Legen Sie dann den Boden der Schachtel mit einer Schicht Luftpolsterfolie zum Polstern aus und decken Sie die Luftpolsterfolie mit Papier ab, um Ausscheidungen aufzunehmen. Trennen Sie die Testmäuse und laden Sie sie in einzelne Becher. Platzieren Sie nun die erste Maus auf der Mitte des Drahtgeflechts und drehen Sie das Netz langsam auf 10 bis 20 Zentimeter über die weiche Oberfläche der Box.

Messen Sie die Latenz bis zum Herunterfallen oder beenden Sie den Test nach 60 Sekunden, wenn die Maus nicht herunterfällt. Lege dann die erste Maus wieder in den Haltebecher zurück. Wischen Sie das Netz zwischen den Tests mit 70 % Ethanol ab und legen Sie das Papier wieder über die Luftpolsterfolie.

Führen Sie dann den Test an den beiden anderen Mäusen in der Gruppe durch. Nachdem jede Maus einmal getestet wurde, wiederholen Sie den Vorgang noch zweimal für drei Versuche pro Maus. Wenn es weniger als drei Mäuse in einer Gruppe gibt, stellen Sie sicher, dass zwischen den Versuchen eine Erholungszeit von mindestens fünf Minuten liegt.

Kombinieren Sie für einen NADH-Diaphorase-Farbstoff gleiche Mengen frisch hergestellter NADH-Lösung und frisch hergestellter NBT-Lösung. Geben Sie dann einen Milliliter Färbelösung zu jedem Objektträger und inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Für eine Succinathydrogenase-Färbung bereiten Sie eine Lösung aus 0,1 molaren Natriumsuccinat, 1,25 molaren NBT und 0,2 molaren Phosphatpuffer vor.

Fügen Sie dann jedem Objektträger einen Milliliter hinzu. Packen Sie die Objektträger in eine befeuchtete Kammer und inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach dem Inkubieren mit einem der beiden Flecken aspirieren Sie die Färbelösung und waschen Sie die Objektträger dreimal mit destilliertem Wasser.

Waschen Sie dann die Objektträger durch eine Reihe von Acetonbädern, deren Konzentration zu- und abnimmt. Führen Sie mit jeder Konzentration von Aceton drei Wäschen für zwei Minuten pro Waschgang durch. Zum Schluss spülen Sie die Objektträger dreimal mit destilliertem Wasser ab.

Montieren Sie dann die Objektträger mit einem wässrigen Medium. Mäuse ohne HTRA2-Expression wurden mit der beschriebenen Versuchsbatterie untersucht und mit Wurfgeschwisterkontrollen verglichen. Zwischen P4 und P6 wurde keine Veränderung in der Anzahl der Pulls oder der Latenz zum Sinken festgestellt. Zwischen P7 und P10 wurde eine Verringerung der neuromuskulären Kraft festgestellt.

Im Aktivitätstest war die Aktivität von HTRA2-Knockout-Mäusen reduziert. HTRA2-Knockout-Mäuse zeigten auch eine Verringerung der Festigkeit im Drahtgeflecht-Grifftest. Die H- und E-Färbung zeigt, dass die HTRA2-Knockout-Mäuse im Vergleich zu den Kontrollen bei P35 keine offensichtlichen Veränderungen in der Netzhautstruktur aufwiesen.

Schließlich wurde die histochemische Färbung der Komplexaktivität der Elektronentransportkette verwendet, um Veränderungen in den Funktionen der respiratorischen Enzyme zu identifizieren. Bei den HTRA2-Knockout-Mäusen war die Färbung im Vergleich zu den Kontrollen verringert. Dies wurde im Kleinhirn und Striatum festgestellt, nicht aber im Kortex.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Aktivität und neuromuskuläre Stärke von genetisch veränderten Mäusen beurteilt und wie man diese Studien mit zellulären Achsen kombiniert. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.