Name: Eine Phänotypisierung Regimen für genetisch modifizierte Mäuse verwendet, um Gene in menschlichen Krankheiten des Alterns Beteiligt Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Lernen Sie eine Phänotypisierungsmethode für genetisch modifizierte Mäuse zur Untersuchung neurologischer Defekte bei HtrA2-assoziierten Parkinson-Symptomen. Dieser Ansatz ermöglicht auch unerfahrenen Labors fundierte Studien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Finanzierung für diese Forschung kam von Rosebay Medical Foundation und Yale Medical School Deans Research Fund (JH). Wir danken Dr. Claire Koenig für die Hilfe bei Verhaltensexperimenten. Gentechnisch veränderte Mauslinien wurden bei Ozgene (Perth, Australien) erzeugt.

Ethik Aussage: Studien Tiere wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Yale University durchgeführt. 1. Verhaltenstest von genetisch veränderten Mäuse Hinweis: Alle Mäuse sollten auf den gleichen Testprozeduren unterzogen werden, um Unterschiede in Gewöhnung zu begrenzen Handhabung. Tests sollte jedes Mal an der gleichen Tageszeit durchgeführt werden. <ol><li> Neonatal Hind Gliedmaßen-Test Hinweis: Die hinteren Gliedmaßen Test durchgeführt täglich von postnatalen Tag (P) 4 bis P10 proximalen hinteren Gliedmaßen Muskelkraft, Schwäche und Müdigkeit zu bewerten. <ol><li> Transport Mäuse Testbereich und lassen Sie es 30 Minuten vor dem Test zur Ruhe. </li><li> Bereiten Sie Testgerät durch eine 50 ml konischen Röhrchen mit 70% Ethanol Reinigung, Drücken von zwei (P4-P8) oder ein (P9-P10) Wattebällchen auf dem Boden des tube und in einer vertikalen Position zu sichern. </li><li> Entfernen Sie einen Welpen aus dem Käfig und Rekordgewicht. Halten Sie pup Tablett auf Heizkissen in halten, wenn nicht zu testen. </li><li> Sanft suspendieren die Hinterbeine des Neugeborenen über den Rand des konischen Rohrs, so dass es in Richtung der Wattebäusche nach unten zeigt. Zählen Sie die Anzahl der Ziehversuche gemacht und messen die Latenz zu fallen, um eine Stoppuhr. </li><li> Wiederholen Sie einmal dann mit der Markierung den Welpen beschriften. Danach P6 Welpen durch Zehen Clipping identifizieren. Reiben Sie Welpen sanft mit Bettwäsche von zu Hause Käfig vor dem Austausch. </li><li> Wisch konisches Rohr mit 70% Ethanol. </li><li> Wiederholen Sie Prüfung auf der nächsten Welpen, bis die ganze Wurf wurde getestet. </li><li> Entsorgen Wattebausch und konischen Röhrchen. Reinigen Sie alle Geräte mit 70% Ethanol. </li></ol></li><li> Weanling Observation-Test Hinweis: Der Absetzer Beobachtungstest verabreicht wird täglich von P19 bis P21 Bewegung und allgemeine Aktivitätsniveau zu erzielen. <ol><li> Transport Mäuse Testbereich einnd lassen Sie es 30 Minuten vor dem Test zur Ruhe. </li><li> Vorbereitung Testfeld Plexiglas markiert mit einem 6x6-Raster von 2 inch Quadrate auf der Basis von mit 70% Ethanol gereinigt wird. Richten Sie Videogerät an der Seite, so dass das ganze Feld im Blickfeld ist. Halten Sie die Einrichtung und Umgebung jeden Tag das gleiche zu vermeiden Neuheit einzuführen. </li><li> Entfernen Sie einen Absetzer aus dem Käfig und in einem sauberen Betrieb Tasse. Nehmen Sie Gewicht. </li><li> Beginnen Videoaufzeichnung durch die Testidentifikationskarte filmt, mit Maus-Identifikationsnummer, Alter und Datum der Prüfung. Übertragen Sie die Maus aus dem Becher zu der Mitte Platz zu halten. Zeit für drei Minuten die Anzahl der Zeilen von beiden Vorderpfoten der Maus während des Tests durchlaufen zu zählen. </li><li> Rück Maus in einen sauberen Käfig und End-Videoaufzeichnung. </li><li> Reinigen der Testvorrichtung mit 70% Ethanol. </li><li> Wiederholen, bis alle Wurf getestet wird, dann wieder alle Welpen an den Käfig. </li><li> Reinigen Sie alle Prüfgeräte mit 70% Ethanol. </li><li&gt; Die Videos verwenden, Quantifizieren durch Auszählung nach der visuellen Beobachtung der Anzahl Ereignisse der Aufzucht, wo eine Maus mit beiden Vorderpfoten klare Unterstützung steht und Pflege Veranstaltungen, bei denen die beiden Vorderpfoten in der Reinigung tätig sind. </li></ol></li><li> Wire Mesh Grip Festigkeitstest Hinweis: Die Grifffestigkeit Test an abwechselnden Tagen zwischen P22 und P26 durchgeführt wird, um die neuromuskuläre Stärke beurteilen. <ol><li> Transport Mäuse Testbereich und lassen Sie es 30 Minuten vor dem Test in Heimkäfig zur Ruhe. </li><li> Bereiten Sie Gerät durch ein Plexiglas-Box und Maschengitter mit 70% Ethanol reinigen. Setzen Sie Luftpolsterfolie im Boden der Schachtel und Deckel mit Papier. </li><li> Getrennte Mäuse in Gruppen von drei, in einzelnen Haltebecher platzieren. </li><li> Platzieren erste Maus auf die Mitte des Drahtgeflecht und invertieren langsam 10-20 cm über die weiche Oberfläche in den Boden des Plexiglas-Box. Messen Sie die Latenzzeit zu fallen, um eine Stoppuhr. Beenden Tests nach 60 sec verstrichen sind, wenn die Maus nicht tutFall. </li><li> Rück Maus zu halten Tasse, Abwischen mit 70% Ethanol Netz und ersetzen Papier über die Luftpolsterfolie. Führen Sie den Test auf den verbleibenden zwei Mäuse in der Gruppe, bevor mit dem ersten zurückkehrt. Wiederholen, bis jede Maus insgesamt dreimal getestet wurde. </li><li> Bringen Sie die Gruppe in einen sauberen Käfig und weiter mit anderen Gruppen. Bei weniger als drei Mäuse in jeder Gruppe sind, stellen Sie sicher, dass ein 5 min zu interProbeErholungsIntervall erlaubt ist. </li><li> Gibt alle Mäuse an den Käfig, entsorgen Papier und saubere Prüfgeräte mit 70% Ethanol. </li></ol></li></ol> 2. Die Prüfung der Retinal Struktur <ol><li> Anästhesieren Tiere an P30-35 durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Beurteilen Tiefe der Anästhesie durch den Fußballen Quetschung und nur in Abwesenheit einer Antwort, in Übereinstimmung mit IACUC Richtlinien erfolgen. Perfuse mit 4% PFA / PBS 48. </li><li> Um die Augen zu entfernen, reinigen Sie die Haut an der Einschnitt site mit 70% Ethanol, bevor an der Basis des Schädels durch die Haut zu schneiden. Ziehen Sie die Haut wieder auf den Schädel und sauber mit 70% Ethanol aus. Mit sauberen Instrumente, schneiden Sie vorsichtig durch den Schädel, die Augenhöhlen zu erreichen und die Augen aus. Sever den Sehnerv, sanft entfernen Sie das Auge aus der Steckdose und spülen in PBS. </li><li> Fix Augen in 4% PFA / PBS für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Zeigen die Augen in eine kleine Petrischale mit PBS. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Mitte der Hornhaut unter Verwendung von Stichentfernung Schere. Entfernen Sie die Hornhaut durch die Kante zwischen der Hornhaut und Lederhaut zu schneiden. Verwenden einer Pinzette, die Iris zu entfernen. Schließlich schälen die RPE Schichten, so dass die Netzhaut intakt und die Linse an Ort und Stelle aus. Hinweis: Die 4% PFA / PBS Fixierung bewirkt RPE Ablösung so dass für die RPE leicht von der Außenseite der Netzhaut abgeschält werden. </li><li> Re-fix in 4% PFA / 30% Saccharose / PBS für 15 min bei Raumtemperatur vor dem Auge auf eine Petrischale mit PBS zurückkehrt. Ziehen Sie die lens Zange, womit sich die Glaskörper zusammen mit ihm mit. </li><li> Cryoprotect in 30% Saccharose über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Mantel Augen in eine optimale Schnitt Temperatur Verbindung (OCT) und Übertragung auf eine Einbettform mit frischem Oktober Orientieren des Auges, so dass der Sagittalebene ist parallel mit der Schneidfläche, indem so wenig wie möglich Bewegungen und die Vermeidung der Einführung von Luftblasen. Blitzeis, indem die Form in einem Trockeneis / Ethanol-Bad eingetaucht wird. Store Blöcke bei -80 ° C. </li><li> Mit Hilfe eines Kryostaten geschnitten 20 um Sagittalschnitte und sammeln sich auf vorgereinigte Dias. </li><li> Stain Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardprotokollen 49. Bild mit einem Lichtmikroskop für Hellfeldmikroskopie ausgestattet. </li></ol> 3. histochemische Färbung <ol><li> Probenvorbereitung <ol><li> Euthanize Tiere bei P30-35 mit Isofluran Überdosierung (30% in Propylenglykol) über offene Tropfen Einatmen. Beurteilen Sie die Euthanasie durch das Aufhörender Atmung, Herzschlag und der Mangel an Reaktion auf die Fußballen Kneifen. Bestätigen Tod durch Genickbruch und Organentnahme mit IACUC Richtlinien im Einklang. </li><li> Um das Gehirn zu entfernen, reinigen Sie die Haut an der Einschnittstelle mit 70% Ethanol, bevor an der Basis des Schädels durch die Haut zu schneiden. Ziehen Sie die Haut wieder auf den Schädel und sauber mit 70% Ethanol aus. Mit sauberen Instrumente, sorgfältig durch den Schädel schneiden und entfernen Sie das Gehirn zu belichten. Entfernen Sie die Membranen und sanft das Gehirn aus dem Schädelhöhle zu entfernen. Spülen in PBS. </li><li> Coat das Gehirn in OCT und Übertragung auf eine Einbettform mit frischem Oktober Orientieren das Gehirn, so dass der sagittalen Ebene ist parallel zu der Schnittfläche unter Verwendung von möglichst wenigen Bewegungen wie möglich und der Vermeidung der Einführung von Luftblasen. Blitzeis, indem die Form in einem Trockeneis / Ethanol-Bad und bei -80 ° C eingetaucht wird. </li><li> Mit Hilfe eines Kryostaten geschnitten 10 um Sagittalschnitte und sammeln sich auf vorgereinigte Dias. </li></ol></li> &lt;li&gt; NADH Diaphorase-Färbung <ol><li> Bereiten 0,05 M Tris-Puffer, pH 7,6 durch Auflösen von 5,72 g Tris-HCl und 1,66 g Tris-Base in 1L-VE-Wasser. Lagerung bei 4 ° C für bis zu sechs Wochen. </li><li> Bereiten NADH-Lösung (2,25 mM NADH in 0,05 M Tris-Puffer). Aliquotieren und bei -20 ° C. </li><li> Bereiten NBT-Lösung (2,5 mM Nitro-Blue-Tetrazolium in 0,05 M Tris-Puffer). Lagerung bei 4 ° C für bis zu sechs Wochen in einer Glasflasche. </li><li> Kombinieren Sie gleiche Volumina von NADH-Lösung und NBT-Lösung Färbelösung machen und 1 ml zu jeder Folie. in einer befeuchteten Kammer für 30 min bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Absaugen Färbelösung und waschen dreimal mit dH 2 O. </li><li> Waschen dreimal jeweils in aufsteigender und absteigenden Konzentrationen von Aceton / dH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) für 2 min bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie dreimal in dH 2 O und montieren Abschnitte mit wässrigem Medium. Bild mit einem Lichtmikroskop ausgestattet für helle field Mikroskopie. Blau-Färbung entspricht der enzymatischen Aktivität. </li></ol></li><li> Succinatdehydrogenase histochemische Färbung <ol><li> Bereiten 0,2 M Natrium monobasischen Phosphat / dH 2 O und 0,2 M Natriumhydrogenphosphat / dH 2 O. </li><li> Machen 0,2 M Phosphatpuffer, pH 7,6 durch die Kombination von 3 Teilen einbasischen Phosphat mit 20 Teilen Natriumhydrogenphosphat. </li><li> Bereiten Sie Färbungslösung (0,1 M Natriumsuccinat, 1,25 M NBT in 0,2 M Phosphatpuffer) und 1 ml zu jeder Folie. in einer befeuchteten Kammer für 60 min bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Absaugen Färbelösung und waschen dreimal in dH 2 O. </li><li> Waschen dreimal jeweils in aufsteigender und Konzentrationen von Aceton / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) für 2 min bei Raumtemperatur absteigend. </li><li> Spülen Sie dreimal in dH 2 O und montieren Abschnitte mit wässrigem Medium. Bild mit einem Lichtmikroskop für Hellfeldmikroskopie ausgestattet. Blau-Färbung entspricht enzymatic Aktivität. </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen offenzulegen.

Robust Behandlungen notwendig, um die Auswirkungen der lähmenden Bedingungen menschlichen Alterungs Bezug zu begrenzen, aber sie bleiben schwer für viele Bedingungen. Um potentielle therapeutische Targets zu identifizieren und zu entwickeln Strategien für die Intervention, die Ursachen und die Pathologie der Zusammenhang mit der Alterung Krankheiten müssen zuerst verstanden werden. Nicht alle genetisch veränderten Mäusen unmittelbar gegenwärtig mit klaren Phänotypen, die für die Krankheit von Interesse verbunden sind, a...

Altersassoziierten Erkrankungen werden immer häufiger in der modernen Gesellschaft. Da die medizinische Wissenschaft und die Lebenserwartung steigt verbessert, wächst die Bevölkerung nach Alter und die Last dieser Krankheiten wächst. Effektive Behandlungen sind notwendig, um die Auswirkungen der lähmenden Bedingungen zu verringern, bleiben aber schwer in vielen Fällen. Nur wenn wir die Ursachen zu verstehen und Pathologie der Zusammenhang mit der Alterung Krankheiten können die Wissenschaftler beginnen potentielle therapeutische Targets zu identifizieren und zu entwickeln Strategien für die Intervention. Gemeinsame altersbedingten Bedingungen umfassen neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit (PD) und altersbedingte Makuladegeneration (AMD). PD ist die häufigste durch Neurodegeneration verursacht Bewegungsstörung beim Menschen. Die meisten Parkinson-Patienten zeigen Symptome wie Ruhetremor, Bradykinesie und Steifigkeit nach 50 Jahren. Frühem Beginn wurde auch in etwa 10% der Fälle beobachtet. AMD ist die häufigste Ursache für Erblindung beiältere Menschen, progressiv und Photorezeptoren der retinalen Pigmentepithel (RPE) im Auge zu beschädigen. Zentrale Vision beeinträchtigt aber die periphere Sicht ist in der Regel nicht betroffen. Es gibt zwei Formen von AMD. In der &quot;trockenen&quot; Form, extrazelluläre Proteinablagerungen als Drusen Form zwischen dem RPE und Bruch-Membran (BM) bekannt, was zu einer geographischen Atrophie und Unschärfe des zentralen Sehens. Die schwereren &quot;nasse&quot; Form ergibt sich aus Neovaskularisation aus der Chorioidea über BM in die RPE und Photorezeptorschichten und kann unter der Netzhaut führen zu hamorrhaging, die zu dauerhaften Schäden an Netzhautgewebe verursacht. Genomweite Assoziationsstudien haben zuvor identifizierten Loci, die mit einer erhöhten Anfälligkeit für diese Krankheit und identifiziert zwei Bereiche von Interesse verbunden sind: Komplement-Faktor H (CFH) auf dem Chromosom 1 und dem 10q26-Locus, wo die altersbedingte Makulopathie Anfälligkeit 2 (ARMS2) und Hochtemperatur - Anforderung Faktor A1 (HtrA1) Gene befinden sich 1-5 </sup&gt;. Kombinationen dieser Allele erhöhen die Wahrscheinlichkeit von AMD in einer dosisabhängigen Weise und spezifischer SNPs können vorzugsweise entweder mit den nassen oder trockenen Formen von AMD 3-6 verbunden sein. CFH wirkt als negativer Regulator des alternativen Wegs (AP) des Komplementsystems durch die Aktivierung von C3 zu hemmen. A single nucleotide polymorphism (SNP) wurde zu einem erhöhten Risiko von AMD verbunden, was den Austausch von Tyrosin 402 in Exon 9 mit Histidin durch eine T nach C Substitution 1. In AMD wird angenommen, dass der AP wegen einer Funktionsverlust von CFH falsch reguliert ist aber, ob das SNP spielt eine kausale Rolle ist unklar. Eine Hypothese ist , dass die positiv geladene Histidin gedacht , ist die Fähigkeit von CFH zu negieren , um interagierende Proteine ​​C-reaktives Protein und Heparinsulfat 1,7 zu binden. In - vitro - Studien von CFH Y402H liefern widersprüchliche Ergebnisse über funktionelle Unterschiede zwischen den Varianten und in vivo Arbeit in &lt;em&gt; Cfh - / - Mäusen, die humanisierte CFH 8 ist noch nicht abgeschlossen. ARMS2 stromauf HtrA1 im Primatengenom befindet, wobei das Gen in Mäusen fehlt. HtrA1 ist eine Serinprotease, aber ARMS2 ist schlecht charakterisiert. Das Kopplungsungleichgewicht zwischen SNPs in der AMD-assoziierten Locus hat es schwierig gemacht, die Beiträge zu Risiko einzelner Mutationen der Gene in dieser Region zu bestimmen, aber die jüngsten Arbeiten haben vorgeschlagen, dass es eine Überexpression von HtrA1 anstatt ARMS2, die Neovaskularisation führt und subretinalen Proteinablagerungen 9-11. Allerdings kann die große Nähe der Gene in diesem Locus für Interaktionen ermöglichen, der nicht zufällig eingefügt Transgene unter Verwendung untersucht werden können. Neben AMD hat die HtrA- Familie von Serin-Proteasen wurden mit vielen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Alle HtrA-Proteine ​​enthalten eine Serin-Protease-Domäne durch mindestens einen C-terminalen PDZ-Domäne folgt. HtrA1, HtrA3 und HtrA4 teilen sich die grissest Homologie, bestehend aus einem Signalpeptid, insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-Bindungsdomäne, einer Kazal-Protease-Inhibitor-Domäne der Serinprotease-Domäne und eine PDZ-Domäne. HtrA2 hat eine andere N-Terminus, der aus einem Mitochondrienlokalisierungssequenz, Transmembrandomäne und Inhibitor der Apoptose - Bindungsdomäne durch die Protease und PDZ - Domänen 12-16 folgte. Mammalian HtrA1 wird durch substratinduzierte Remodeling in der aktiven Stelle der Protease - Domäne 17-20 reguliert und HtrA2 kann auch durch Wechselwirkung zwischen der Serin - Protease und PDZ - Domänen moduliert werden , die Proteaseaktivität 21 unterdrückt. Interessanterweise scheint die PDZ - Domäne nicht ähnliche Regelung zu HtrA3 16 verleihen scheinen. Die HtrA Proteasen können auch durch extrinsische Faktoren reguliert werden: Es wurde vor kurzem gezeigt , dass es eine regulatorische Interaktion zwischen HtrA1 existiert und Protoporphyrine 22 und HtrA2 können durch Phosphorylierung bei Aktivierung der p38 - MAP - Kinase reguliert werdenWeg in einem PINK1 abhängig 23. Die Löschung der einzelnen Mitglieder der Familie HtrA in Mäusen wurde dokumentiert, aber mechanistisch Effekte sind meist unklar, teilweise aufgrund des Fehlens von sichtbaren Phänotypen. HtrA1 spielt eine wichtige Funktion bei der Proteinqualitätskontrolle und deren Fehlregulation oder Mutation hat mit vielen verschiedenen menschlichen Krankheiten wie Arthritis, Krebs und ein erhöhtes Risiko für AMD 3,4,24-32 in Verbindung gebracht worden. Der Verlust der HtrA2 Funktion in Nervengewebe wurde mit PD - Phänotypen in Menschen und Mäusen, während der Verlust aus nicht-neuronalen Gewebe führt zu einer beschleunigten Alterung 33-37 in Verbindung gebracht worden. HtrA3 Dysregulation hat mit Krankheiten wie Präeklampsie und bestimmte Arten von Krebs 38,39 in Verbindung gebracht worden. Hochregulierung von HtrA4 hat in den Plazenten von Präeklampsie - Patienten aber knockout Mäuse zeigen keine offensichtlichen Phänotyp 40,41 beobachtet. Der Mangel an Phänotypen in einigen knockout-Mäusen beobachtet wurde,postulierten ein Ergebnis der Kompensation zwischen dem HtrA Familienmitglied zu sein: es wird angenommen , dass sowohl HtrA4 und HtrA1 mit der TGF-B - Familie von Proteinen in Wechselwirkung treten, was eine Kompensation durch HtrA1 beim Löschen von HtrA4 41. In ähnlicher Weise wird angenommen , dass seit HtrA1 und HtrA3 ein hohes Maß an Domäne Homologien aufweisen könnten sie 42 ergänzende Funktionen haben. Aber es wurde vorgeschlagen , dass HtrA- Proteine ​​teilweise antagonistische Rollen haben können, gemeinsame Ziele 43 zu regulieren , zu konkurrieren. Um diese Gefahr zu untersuchen Faktoren drei humanisierten Knock-in-Mauslinien generiert wurden. In Cfh tm1 (CFH * 9) jhoh und Cfh tm2 (CFH * 9) jhoh, Exon 9 des Cfh Gens mit Exon 9 des menschlichen Homolog ersetzt wird. Cfh tm1 (CFH * 9) jhoh codiert die nicht Krankheit assoziiert Tyrosin Rest an Position 402, während Cfh tm2 (CFH * 9) jhoh die Y402H, Risiko-assoziierten SNP trägt. ImARMS2 tm1jhoh menschlichen ARMS2 Sequenz wurde an eine Region stromaufwärts von HtrA1 abgezielt. Eine loxP-flankierte STOP - Sequenz der Gensequenz , aber stromabwärts von dem Promotor enthalten UBIC wurde OzCre Mäusen durch Kreuzung exzidiert angeordnet stromaufwärts , die Cre - Rekombinase unter der Kontrolle des Promotors exprimieren Rosa26, wie zuvor beschrieben 34. Zusätzlich zu diesen Knock-in - Linien, Knockout - Allele für Cfh und HtrA1 (CFH tm1jhoh und HtrA1 tm1jhoh) sowie die anderen Mitglieder HtrA- Familie bekannt wurden erzeugt: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) und HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). Die Keimbahn Vorprägungen wurden konstruiert durch Kreuzung OzCre Mäuse Tiere erstellt spezifische Exons mit loxP - Stellen zu flankieren, so dass das Löschen bewirkt eine Rahmenverschiebung und / oder Löschung der aktiven Domäne (CFH; Exon 3, HtrA1; Exons 2-3, HtrA2: Exons 2-4, HtrA3; Exon 3, HtrA4; Exons 4-6) 34,41. Ein neuronales Deletion HtrA2, deletiert unter Verwendung von Cre - Rekombinase unter der Kontrolle des Nestin - Promotor (HtrA2 flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J), wurde ebenfalls 34 beschrieben. Nur Mäuse HtrA2, entweder systemisch oder in Nervengewebe, zeigte klare Phänotypen fehlt, mit Parkinson- Phänotypen zu präsentieren. Da einige dieser Gene von Interesse gesetzt zu Mitochondrien 11,44-47 lokalisiert werden, und Löschen von HtrA2 erzeugt Parkinsonian Phänotypen, eine Phänotypisierung Regime mit einer mitochondrialen und neurologischen Fokus wird hier beschrieben und repräsentative Ergebnisse aus den Tests von Interesse zur Verfügung gestellt werden . Um gentechnisch veränderten Mäusen zu untersuchen, erzeugt ein Mensch zu untersuchen, gründlich altersbedingte Krankheiten und systematisch eine anfängliche Phänotypisierung Zeitplan festgelegt wurde, die aus einer Reihe von Tests an den beiden HauptbezogenenKrankheiten von Interesse: AMD und Parkinson.

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>Decon (Fisher Scientific)</td><td>435541</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konisches Rohr</td><td>Fisher Scientific</td><td>1443222</td><td></td></tr><tr><td>Wattebällchen</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizmatte</td><td>Sunbeam</td><td>0000756-500-000</td><td></td></tr><tr><td>Halteschale (Eiswürfelschale)</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektronische Stoppuhr</td><td>GOGO</td><td>PC396</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglaskasten</td><td>aus Werkstatt</td><td></td><td>12" x 12" &nbsp;</td></tr><tr><td>Vixia HF R400 Camcorder</td><td>Canon</td><td>8155B004</td><td></td></tr><tr><td>9 oz Clear Cups</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4 Zoll Drahtgeflecht</td><td>Home Depot</td><td>204331884 (online) / 554219 (im Geschäft)</td><td>12" x 12" &nbsp;</td></tr><tr><td>Luftpolsterfolie</td><td>VWR</td><td>470092-416</td><td></td></tr><tr><td>Zange für gerade Proben</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>Präparierzange mit feiner Spitze</td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16%ige Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072-04000</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>JT Baker</td><td>4072-01</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost-Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin-Fleckenlösung</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>353016</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y Fleckenlösung</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>2845-32</td><td></td></tr><tr><td>Trishydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02000-01000</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid, reduziertes Dinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>Nitrotetrazoliumblauchlorid</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>JT Baker</td><td>9006-05</td><td></td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisches Heptahydrat</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsuccinat zweibasisches Hexahydrat</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount wässriges Eindeckmedium</td><td>Vector Labs</td><td>H-5501-60</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td>60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>AxioImager A1 Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Videokamera-Stativ</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimale Schnitttemperatur (OCT)</td><td>Fischer Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat-Schnitte&nbsp; Maschine</td><td>Leica &nbsp;</td><td>CM1900</td><td>Abgekündigt, aber inzwischen durch CM1950 ersetzt</td></tr></tbody></table>

eine phänotypisierung regimen für genetisch modifizierte mäuse verwendet, um gene in menschlichen krankheiten des alterns beteiligt study

A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

Altersbedingte Krankheiten werden immer häufiger und die Belastung nimmt mit zunehmendem Alter unserer Bevölkerung weiter zu. Wirksame Behandlungen sind notwendig, um die Auswirkungen von schwächenden Erkrankungen zu verringern, bleiben aber in vielen Fällen schwer fassbar. Nur durch das Verständnis der Ursachen und der Pathologie von Krankheiten, die mit dem Altern verbunden sind, können Wissenschaftler beginnen, potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren und Interventionsstrategien zu entwickeln. Die häufigsten altersbedingten Erkrankungen sind neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson und Blindheit. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache für Erblindung bei älteren Menschen. Genomweite Assoziationsstudien haben zuvor Loci identifiziert, die mit einer erhöhten Anfälligkeit für diese Krankheit assoziiert sind, und zwei interessante Regionen identifiziert: den Komplementfaktor H (CFH) und den 10q26-Locus, in dem sich die Gene für die altersbedingte Makulopathie-Anfälligkeit 2 (ARMS2) und den Hochtemperatur-Bedarfsfaktor A1 (HtrA1) befinden. CFH fungiert als negativer Regulator des alternativen Signalwegs (AP) des Komplementsystems, während HtrA1 eine extrazelluläre Serinprotease ist. ARMS2 befindet sich im Primatengenom stromaufwärts von HtrA1, obwohl das Gen bei Mäusen nicht vorhanden ist. Um die Auswirkungen dieser Gene zu untersuchen, wurden humanisierte Knock-in-Mauslinien von Cfh und ARMS2, Knockouts von Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 und HtrA4 sowie eine bedingte neuronale Deletion von HtrA2 generiert. Von allen gentechnisch veränderten Mäusen, die produziert wurden, zeigten nur Mäuse, denen HtrA2 entweder systemisch oder im Nervengewebe fehlte, klare Phänotypen. Um diese Mäuse gründlich und systematisch zu untersuchen, wurde ein anfänglicher Phänotypisierungsplan erstellt, der aus einer Reihe von Tests bestand, die sich auf zwei Hauptkrankheiten von Interesse bezogen: AMD und Parkinson. Genetisch veränderte Mäuse können geeigneten Experimenten unterzogen werden, um Phänotypen zu identifizieren, die mit den damit verbundenen Krankheiten beim Menschen in Verbindung stehen können. Hier wird ein Phänotypisierungsschema mit mitochondrialem Fokus neben repräsentativen Ergebnissen der interessierenden Tests vorgestellt.

In diesem Abschnitt werden Beispiele für die Ergebnisse, erhältlich unter Verwendung dieser Verfahren. Im Hinterschenkel-Test hat die Anzahl der Ziehversuche und die Latenzzeit für jeden Tag summiert werden in zwei aufeinander folgenden Tests zu fallen. Dieser Test kann verwendet werden , genetisch verschiedenen Gruppen zu vergleichen Mäuse mit reduzierter Stärke neuromuskulären HtrA2 tm1jhoh (HtrA2 KO) -Mäusen in 1A zu unterscheiden -. B</str...

Ein reverse-genetischer Ansatz zum Verständnis von Genfamilien, die mit menschlichen Krankheiten assoziiert sind, wird vorgestellt, wobei die Maus als Modellsystem verwendet wird, und der anschließende Maus-Phänotypisierungsplan wird beschrieben. Da Mäuse, die an einem interessierenden Gen, HtrA2, defekt waren, Parkinson-Symptome zeigten, konzentriert sich das Phänotypisierungsschema auf die Identifizierung neurologischer Defekte.

Eine Phänotypisierung Regimen für genetisch modifizierte Mäuse verwendet, um Gene in menschlichen Krankheiten des Alterns Beteiligt Study

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Testverfahrens besteht darin, eine Reihe einfacher Tests zu etablieren, die als anfängliche Phänotypisierungspipeline dienen können, um anschließende detaillierte Untersuchungen der Verhaltensphänotypen sowie der Struktur und Funktion von Geweben gezielt zu steuern. Ob die verhaltensbezogenen und zellulären Phänotypen menschlicher Erkrankungen im Mausmodell nachgebildet werden. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass die Tests in Laboren ohne vorherige Erfahrung mit solchen Experimenten durchgeführt werden können, ohne dass erhebliche Investitionen erforderlich sind, und dennoch gezielte, detailliertere Studien ermöglichen.Führen Sie den Hinterbeintest täglich vom vierten bis zum zehnten Tag nach der Geburt durch, um die Muskelkraft, Schwäche und Ermüdung der proximalen Hinterbeinmuskulatur zu bewerten. Beginnen Sie damit, dass die Mäuse sich 30 Minuten lang an den Testbereich gewöhnen. Bereiten Sie in der Zwischenzeit ein neues 500-Milliliter-Kegelrohr vor, indem Sie es mit 70 % Ethanol ausspülen und anschließend ein oder zwei Wattebällchen in den Boden des Rohrs drücken.Befestigen Sie dieses Röhrchen in vertikaler Position für den Test. Wenn die Welpen nicht getestet werden, bewahren Sie sie bei der Muttertiers, um deren Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Nach der halbstündigen Akklimatisierung nehmen Sie einen Welpen aus dem Käfig und notieren dessen Gewicht.Dann hängen Sie das Neugeborene vorsichtig an seinen Hinterbeinen über den Rand des Rohrs, sodass das Jungtier auf die Baumwolle blickt. Zählen Sie anschließend die Anzahl der Zugversuche des Welpen und messen Sie die Latenz bis zum Herunterfallen. Nach einer Wartezeit von 30 Sekunden wiederholen Sie den Test.Nach dem zweiten Test kennzeichnen Sie das Jungtier mit einem Marker. Reiben Sie dann das Jungtier vorsichtig mit Einstreu aus dem Heimkäfig ab und geben Sie es zur Mutter zurück. Da ältere P8-Jungtiere nicht markiert werden können, identifizieren Sie sie durch Zehenabschneiden.Bevor Sie mit dem nächsten Welpen fortfahren, wischen Sie das Reagenzglas mit 70 % Ethanol ab. Führen Sie den Beobachtungstest für Absetzlinge täglich von P19 bis P21 durch, um Bewegung und allgemeine Aktivitätsniveaus zu bewerten. Beginnen Sie damit, dass die Mäuse sich 30 Minuten lang an den Versuchsbereich gewöhnen.Während sich die Welpen akklimatisieren, bereiten Sie die Versuchsarena vor. Markieren Sie einen Plexiglas-Testbehälter mit einem sechs mal sechs großen Raster aus zwei Zoll großen Quadraten. Reinigen Sie den Behälter vor der Verwendung mit 70 % Ethanol.Positionieren Sie dann eine Videokamera so, dass eine Seitenansicht der gesamten Box das Sichtfeld ausfüllt. Standardisieren Sie das Erscheinungsbild der Umgebung, um die Einführung von Neuheit zu vermeiden. Überführen Sie vor dem Test den entwöhnten Welpen in einen sauberen Haltebecher und notieren Sie dessen Gewicht.Danach wurde die Videoaufnahme gestartet. Zuerst wird eine Test-Identifizierungskarte mit der Maus-Identifikationsnummer, dem Alter und dem aktuellen Datum aufgezeichnet. Anschließend wird die Maus aus dem Haltebecher in das mittlere Feld transferiert.Zählen Sie drei Minuten lang die Anzahl der Linien, die von beiden Vorderpfoten überschritten werden. Nach drei Minuten bringen Sie die Maus in einen sauberen Käfig zurück und beenden die Videoaufnahme. Reinigen Sie die Box zwischen jedem Test mit 70 % Ethanol.Aus den Videos die Aufrechteinstellungen zählen, also die Momente, in denen eine Maus mit beiden Vorderpfoten den Halt verlässt. Außerdem die Pflegewaschverhalten zählen, die auftreten, wenn beide Vorderpfoten mit Reinigungsaktivitäten beschäftigt sind. Zwischen dem 22. und 26. Postnataltag im Wechseltagsturnus den Grifftest durchführen, um die neuromuskuläre Kraft zu beurteilen.Wie üblich die Mäuse 30 Minuten lang an den Versuchsbereich gewöhnen lassen. Die Versuchsapparatur ist eine Plexiglasbox mit einem Maschennetz. Beides mit 70 % Ethanol reinigen.Danach den Boden der Box mit einer Schicht Luftpolsterfolie auslegen, um Polsterung zu gewährleisten, und die Luftpolsterfolie mit Papier bedecken, um Ausscheidungen aufzunehmen. Anschließend die Versuchsmäuse voneinander trennen und in einzelne Becher geben. Nun die erste Maus in die Mitte des Drahtgitters setzen und das Gitter langsam umdrehen, sodass es sich in einer Höhe von 10 bis 20 Zentimetern über der weichen Oberfläche der Box befindet.Messen Sie die Latenz bis zum Herunterfallen oder beenden Sie den Test nach 60 Sekunden, falls die Maus nicht herunterfällt. Bringen Sie danach die erste Maus in den Haltebecher zurück. Wischen Sie zwischen den Tests das Netz mit 70 % Ethanol ab und ersetzen Sie das Papier über der Luftpolsterfolie.Testen Sie anschließend die beiden anderen Mäuse in der Gruppe. Nachdem jede Maus einmal getestet wurde, wiederholen Sie den Vorgang zweimal, sodass jede Maus insgesamt drei Versuchsdurchläufe absolviert. Falls sich weniger als drei Mäuse in einer Gruppe befinden, stellen Sie sicher, dass zwischen den Versuchsdurchläufen eine Erholungszeit von mindestens fünf Minuten eingehalten wird.Für eine NADH-Diaphorase-Färbung mischen Sie gleiche Volumina frisch hergestellter NADH-Lösung und frisch hergestellter NBT-Lösung. Geben Sie anschließend ein Milliliter der Färbelösung auf jeden Objektträger und inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius. Für eine Succinat-Dehydrogenase-Färbung stellen Sie eine Lösung aus 0,1 molarer Natriumsuccinat-, 1,25 molarer NBT- und 0,2 molarer Phosphatpufferlösung her.Gegeben Sie dann einen Milliliter auf jede Objektträgerfläche. Stellen Sie die Objektträger in eine befeuchtete Kammer und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation mit einer der Färbungen saugen Sie die Färbelösung ab und waschen die Objektträger dreimal mit destilliertem Wasser.Anschließend spülen Sie die Objektträger durch eine Abfolge von Acetonbädern mit zunehmender und abnehmender Konzentration. Führen Sie für jede Acetonkonzentration drei Waschschritte durch, wobei jeder Waschschritt zwei Minuten dauert. Zum Schluss spülen Sie die Objektträger dreimal mit destilliertem Wasser ab.Danach die Objektträger mit einem wässrigen Medium eindecken. Mäuse ohne HTRA2-Expression wurden mittels der beschriebenen Testbatterie untersucht und mit Wurfgenossen-Kontrollen verglichen. Zwischen P4 und P6 wurde keine Veränderung in der Anzahl der Züge oder der Latenz bis zum Herunterfallen beobachtet. Zwischen P7 und P10 zeigte sich eine Abnahme der neuromuskulären Kraft.Im Aktivitätstest zeigten HTRA2-Knockout-Mäuse eine verminderte Aktivität. HTRA2-Knockout-Mäuse wiesen ebenfalls eine Verringerung der Kraft im Drahtgittergriff-Test auf. H-und-E-Färbungen zeigen, dass die HTRA2-Knockout-Mäuse im Vergleich zu Kontrollen am P35 keine offensichtlichen Veränderungen in der retinalen Struktur aufwiesen.Schließlich wurde eine histoenzymatische Färbung zur Bestimmung der Aktivität von Komplexen der Elektronentransportkette verwendet, um Veränderungen in der Funktion der Atmungsenzyme nachzuweisen. Bei den HTRA2-Knockout-Mäusen zeigte sich im Vergleich zu den Kontrollen eine verminderte Färbung. Dies war im Kleinhirn und im Striatum, jedoch nicht in der Großhirnrinde, festzustellen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Aktivität und neuromuskuläre Kraft genetisch veränderter Mäuse beurteilt sowie wie man diese Untersuchungen mit zellulären Achsen kombiniert. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

a-phenotyping-regimen-for-genetically-modified-mice-used-to-study

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Manuskript beschreibt ein Morris Water Maze (MWM) Protokoll, das auf die Verwendung mit einem häufig verwendeten Mausmodell der Alzheimer-Krankheit zugeschnitten ist. Das MWM wird häufig in transgenen Mausmodellen eingesetzt. Die Implementierung eines Verfahrens, das empfindlich auf die Hintergrundbelastung des Mausmodells reagiert, ist für die Erkennung von Gruppenunterschieden unerlässlich.

Morris Wasser-Labyrinth-Test: Optimierung für Mausstamm und Testumgebung

Stressresistenz ist eines der Markenzeichen für Langlebigkeit und ist bekannt, genetisch geregelt. Hier entwickelten wir eine unvoreingenommene Hochdurchsatzverfahren für Mutationen, die Stress-Resistenz verleihen in ES-Zellen, mit dem Maus-Modelle für Langlebigkeit Studien entwickeln zu screenen.

Vorwärts genetische Ansatz zur Stressresistenz-Gene in Mäuse Entdecken - Hochdurchsatz-Bildschirm in ES-Zellen

Dieses Videoprotokoll beschreibt eine sensitive, zuverlässige und schnelle Methode zur Bewertung der neuromuskulären Defizite in einem transgenen Mausmodell der amyotrophen Lateralsklerose.

A Quick Phänotypische Neurologische Scoring System zur Bewertung der Krankheitsprogression im SOD1 G93A-Mausmodell der ALS

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für die kognitive Bewertung für genetische Modelle von der Alzheimer-Krankheit mit dem IntelliCage-System, das eine automatisierte Hochdurchsatz Verhaltens-monitoring-System mit operanten Konditionierung ist.

Automatisiert, langfristige Verhaltensstörungen Assay für kognitive Funktionen in mehreren genetischen Modellen der Alzheimer-Krankheit, mit IntelliCage

Hier stellen wir eine modifizierte Methode zur Kryokonservierung von Einzellembryonen sowie ein Protokoll vor, das die Verwendung von gefriergetauten Embryonen und Elektroporation für die effiziente Erzeugung genetisch veränderter Mäuse koppelt.

Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

Mausmodelle können nützliche Werkzeuge sein, um die Biologie des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass Mäuse eine Reihe von RPE-Pathologien entwickeln können. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Aufklärung und Quantifizierung von RPE-Pathologien in Mäusen mittels Licht-, Transmissionselektronen- und konfokaler Mikroskopie.

Ein Protokoll zur Bewertung und Quantifizierung von retinalen pigmentierten Epithelpathologien in Mausmodellen der altersbedingten Makuladegeneration

Das Protokoll präsentiert den bildgebenden und rechnergestützten Workflow zur Extraktion und Validierung von bildgebungsbasiertem Chromatin und epigenetischen Alter (ImAge).

Messung der Einzelzellalterung mit einem bildgebenden Biomarker von Chromatin und epigenetischer Alterung

Das chirurgische Verfahren zum experimentellen Herzinfarkt in Mäusen zu induzieren beginnt mit linken Thorakotomie zwischen der dritten und der vierten Rippe, um die vordere Oberfläche des Herzens und linken Lunge visualisieren. Die linke Koronararterie ligiert ist, wird die Brust geschlossen und der Maus erlaubt ist, spontan zu erholen.

Geändert Technik für Coronary Artery Ligation in Mäuse

Das Gebrechlichkeitssyndrom tritt häufig bei älteren Menschen auf und spiegelt eine multisystemische physiologische Veränderung wider. Mit verminderter Funktionsreserve und Resilienz ist jedoch auch bekannt, dass Gebrechlichkeit in der HIV-infizierten Bevölkerung häufig vorkommt. In dieser Studie wurde ein leicht durchzuführender Screening-Test zur Identifizierung von HIV-Patienten mit Gebrechlichkeit vorgestellt. Wenn signifikante Komponenten der Gebrechlichkeit identifiziert werden, können...

Messen Frailty in HIV-infizierten Personen. Bezeichnung des gebrechlichen Patienten ist der erste Schritt zur Besserung und Umkehr der Frailty

Wir zeigen: (1) Verfahren zur Entnahme von Speichelproben bei kognitiv beeinträchtigten älteren Erwachsenen durch pflegende Angehörige im häuslichen Umfeld, (2) Verfahren zur Messung der Stressaktivität über Speichelcortisol und Alpha-Amylase und (3) repräsentative Profile. Protokolle, die es Forschern ermöglichen, stressbedingte Prozesse zu untersuchen, erweitern unser Verständnis von biologischer Empfindlichkeit und Anfälligkeit.

Speichelentnahme und Messung von Speichel-Cortisol und Alpha-Amylase in gebrechlichen älteren Erwachsenen in der Gemeinschaft über pflegende Angehörige

Lernen Sie eine Phänotypisierungsmethode für genetisch modifizierte Mäuse zur Untersuchung neurologischer Defekte bei HtrA2-assoziierten Parkinson-Symptomen. Dieser Ansatz ermöglicht auch unerfahrenen Labors fundierte Studien.

Eine Phänotypisierung Regimen für genetisch modifizierte Mäuse verwendet, um Gene in menschlichen Krankheiten des Alterns Beteiligt Study (Video) | JoVE Journal

Eine Phänotypisierung Regimen für genetisch modifizierte Mäuse verwendet, um Gene in menschlichen Krankheiten des Alterns Beteiligt Study

Weitere Videos entdecken