Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von Drosophila Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize In Vivo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, intrazelluläre elektrische Reaktionen von Drosophila-Photorezeptoren und visuellen Interneuronen auf kontrollierte Lichtreize aufzuzeichnen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurokodierung zu beantworten, z. B. wie ein Lichtreiz ihn in eine seiner Reaktionen kodiert oder wie seine visuellen Informationen sowie Photorezeptoren und Interneurone aus Lichtreizen extrahiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie langlebige, qualitativ hochwertige Aufzeichnungen aus der Studie mit geringer Schädigung des intrazellulären Milieus und der Informationsabtastung liefert.

Demonstrationsmerkmal, das dies beeinflussen kann, ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig ist, die verschiedenen Schritte korrekt auszuführen, ohne sie zu sehen. Ziehen Sie eine Referenzmikroelektrode aus filamentiertem Borosilikatglas oder aus Quarzglasrohren mit einem Standard-Pipettenabzieher. Versuchen Sie, eine kurze, allmähliche Verjüngung zu erreichen.

Die genauen Einstellungen variieren je nach Instrument. Die Porengröße an der Spitze ist nicht entscheidend, da sie für die Experimente aufgebrochen wird. Ziehen Sie dann eine Aufzeichnungselektrode aus demselben Glasschlauch und versuchen Sie, eine 10 bis 15 Millimeter lange, feine, allmähliche Verjüngung zu erreichen.

Montieren Sie die Elektrode an einem Lichtmikroskop auf einer Glasseite mit Mehrfachkleber und verwenden Sie ein 40-fach-Luftobjektiv, um die Spitze zu inspizieren. Eine gute Elektrode verjüngt sich sanft zu einer unsichtbar kleinen Spitze, um die herum kontinuierlich parallel dunklere und hellere Interferenzmuster zu sehen sind. Kurz vor dem Experiment wird die Referenzelektrode mit Fliegenringern verfüllt, indem eine Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einem Partikelfilter verbunden ist, mit einer feinen Kunststoffspitze

Für Photorezeptorexperimente wird die Aufzeichnungselektrode mit 3 molaren Kaliumchlorid beladen, bis sich an ihrem großen Ende ein Tröpfchen bildet. Dadurch wird das Rauschen des Flüssigkeitsübergangs während der Aufnahme minimiert. Um mit histaminergen LMCs zu arbeiten, füllen Sie die Aufzeichnungselektroden mit 3 molaren Kaliumacetat und 0,5 millimolarem Kaliumchlorid, um die Auswirkungen auf die Chloridbatterie der Zelle zu minimieren.

Beginnen Sie damit, ein frisches Fliegenfläschchen mit fünf bis 10 Tage alten Fliegen zu befüllen. Jüngere Fliegen sind zerbrechlicher, können aber von ihnen aufgezeichnet werden. Wählen Sie die erste Fliege für die Elektrophysiologie aus.

Mit großen Weibchen lässt es sich am einfachsten arbeiten. Wenn Sie sich im Fangröhrchen befinden, nutzen Sie die inhärente Tendenz, nach oben in die Pipettenspitze zu klettern und die kleinere Spitze zu verschließen. Schließen Sie dann eine 100-Milliliter-Spritze mit einem flexiblen Kunststoffschlauch an die Pipettenspitze an, die vergrößert ist, um eine Drosophila durchzulassen, und verbinden Sie das andere Ende mit einer großen Pipettenspitze, die am Fliegenhalter befestigt ist.

Drücken Sie dann eine kleine Menge Luft aus der Spritze, um die Fliege in den Fliegenhalter auszuwerfen. Schauen Sie durch das Stereomikroskop und verabreichen Sie vorsichtig mehr Luft, bis der Kopf der Fliege aus dem konischen Ende des Fliegenhalters herausragt. Achten Sie darauf, dass die Fliege fest von ihrem Brustkorb eingeklemmt ist.

Sichern Sie dann die Fliege mit Bienenwachs. Verwenden Sie die niedrigste Temperatur des Wachserhitzers, um das Wachs sauber zu schmelzen, das transparent erscheint. Ist es zu heiß, brennt das Wachs weg.

Ruhigstellen Sie den Kopf der Fliege ruhig, indem Sie etwas Bienenwachs auf den Rüssel und den Augenwinkel auftragen und dabei die Hornhaut aussparen. Befestigen Sie diese beiden Punkte am Fliegenhalter. Beenden Sie diesen Schritt schnell, um ein Verbrennen der Fliege zu vermeiden.

Setzen Sie als Nächstes eine Schutzbrille auf und stellen Sie ein Mikromesser her. Klemmen Sie eine Rasierklinge aus nicht-rostfreiem Stahl mit zwei Klingenhaltern mit flachem Griff ein und knacken Sie einen kleinen Streifen ihrer scharfen Kante. Im Idealfall erzeugen Sie eine rasiermesserscharfe Kante, die einer Turmspitze ähnelt.

Öffne nun vorsichtig und mit viel Liebe zum Detail mit dem Mikromesser einige Ommatidien des linken Auges der Fliege, etwa bei vier bis fünf Ommatidien von der dorsalen Kutikula knapp über dem Äquator des Auges. Dadurch wird der Durchgang für die Aufzeichnungsmikroelektrode bereitgestellt. Dies ist eine ziemliche Herausforderung, erfordert ein gut gemachtes Messer und muss mit Übung erlernt werden.

Entfernen Sie dann vorsichtig das kleine Stück Hornhaut aus der Öffnung und legen Sie die darunter liegende Netzhaut frei. Bedecke nun mit den feinen Haaren des Vaseline-Applikators das Loch schnell mit einem winzigen Klecks Vaseline. Das Gelee hat den zusätzlichen Vorteil, dass es die intramurale Kapazität der Pipette reduziert.

Vermeiden Sie es, das Auge zu verschmieren, da dies die Optik verwischt. Wenn Sie den Mikroelektrodenverstärker betreiben, sollten Sie immer durch Berühren der Metalloberfläche des Faradayschen Käfigs oder des Antivibrationstisches geerdet werden, um statische Aufladungen zu vermeiden. Befestigen Sie die montierte Fliege an der Stange der Fliegenvorbereitungsplattform.

Drehen Sie den Fliegenhalter so, dass das linke Auge der Fliege direkt zum Untersucher zeigt. Verwenden Sie dann einen kleinen Mikromanipulator, um die stumpfe Referenzelektrode vorsichtig durch die Augenflecken der Fliege in die Kopfkapsel einzuführen. Stellen Sie sicher, dass die Fliege noch gesund aussieht und bewegen Sie ihre Antennen.

Die Vorbereitung muss hervorragend sein, um eine Aufnahme zu verdienen. Treiben Sie nun die scharfe Aufzeichnungsmikroelektrode durch die mit Gelee überzogene Öffnung in das linke Auge. Beim Eintritt in das Gewebe sollte die Position der Elektrodenspitze durch ihr Reflexionsmuster erkennbar sein.

Die zerbrechliche Elektrodenspitze muss perfekt geführt werden, sonst bricht sie, was eine große Herausforderung darstellt. Je nachdem, aus welchem Zelltyp aufgezeichnet wird, sollte der Kopf der Fliege etwas anders ausgerichtet sein. Schalten Sie den Mikroelektrodenverstärker ein, wenn die Elektroden an Ort und Stelle sind.

Schalten Sie dann die Kaltlichtquelle aus, ziehen Sie den Netzstecker und schließen Sie sie an die zentrale Masse an, um durch Erdschleifen verursachtes elektrisches Rauschen zu minimieren. Stellen Sie anschließend die Schwanenhals-Lichtleiter so ein, dass das Carden-Armsystem frei um die Außenscheibe bewegt werden kann. Schalten Sie dann die Raumbeleuchtung aus, um die Fliegenvorbereitung in relative Dunkelheit zu stellen.

Messen Sie nun den Widerstand der Aufzeichnungselektrode im Auge. Er muss zwischen 100 und 260 Megaohm liegen. Manchmal ist die Spitze blockiert und kann mit den kapazitiven Brumm- und Stromimpulsfunktionen des Verstärkers gelöscht werden.

Wenn das nicht hilft, verwenden Sie eine neue Elektrode. Stellen Sie als Nächstes den Verstärker auf Stromzange oder -brücke ein und setzen Sie die Spannung zwischen den Elektroden auf Null. Nachdem die Fliege einige Minuten lang dunkeladaptiert wurde, treiben Sie die Spitze der Aufnahmeelektrode in Schritten von 0,1 bis einem Mikrometer mit einem Piezo-Stepper oder durch sanftes Drehen des Feinauflösungsknopfes in das Auge.

Stimulieren Sie das Auge bei jedem Schritt mit einem Lichtblitz von ein bis 10 Millisekunden. Jedes leichte Aufblitzen verursacht einen kurzen Einbruch der Spannung oder des ERG. Wenn die Elektrodenspitze in die Lamina eintritt und sich auf den LMCs schließt, kehrt sich das ERG um.

Fahren Sie dann mit den Messungen fort. Aufgrund der Nicht-Invasivität kann die Signalleistung einzelner Zellen in ihrem naturnahen Zustand untersucht werden. Die Spannungsreaktion eines R1-R6-Photorezeptors auf schwaches und helles Licht wurde bei 20 Grad Celsius gemessen.

Als nächstes wurde ein R1-R6-Photorezeptor mit einem LMC bei 25 Grad Celsius verglichen. Jede Fliege wurde an einer anderen Fliege gemessen, da intrazelluläre Aufzeichnungen durch zwei scharfe Mikroelektroden in derselben Fliege zu schwierig sind, um durchführbar zu sein. Die Wiederholbarkeit der Antworten wird deutlich, wenn die Daten überlagert werden.

Signal-Rausch-Verhältnisse im Frequenzbereich wurden nach vier Jahren erhalten, indem die Signal- und Rauschdatenblöcke in das Leistungsspektrum umgewandelt und dann das mittlere Signalleistungsspektrum durch das entsprechende mittlere Rauschleistungsspektrum dividiert wurde. Das Ergebnis kann bei den besten Präparaten äußerst empfindlich auf Signale reagieren. Die Technik kann für viele Arten verwendet werden, um zu erfassen.

Coenocia-Fliegen erhielten die gleiche naturalistische, repetitive Lichtstimulation bei 19 Grad Celsius. Die Daten wurden prä- und postsynaptisch von derselben Fliege entnommen, indem die Aufzeichnungselektrode vorgeschoben wurde. Die schnellere Dynamik der Aufnahme steht im Einklang mit der räuberischen Natur dieser Spezies.

Einmal gemastert, ermöglicht diese Technik bei richtiger Ausführung immer lange, qualitativ hochwertige Aufnahmen. Wenn man diese Prozedur versucht, ist es wichtig zu erkennen, ich meine, es ist wie das Erlernen des Klavierspielens. Je mehr Sie üben, desto bessere Ergebnisse werden Sie erzielen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. pharmakologische Interventionen, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Rolle von Neuromodulatoren bei der Gestaltung der Reaktionen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurobiophysik, um zu erforschen, wie Lichtinformationen, -einfang und -übertragung sowie die ätzenden biochemischen Reaktionen in der Phototransduktionsmaschinerie und in den folgenden biologischen Wissenschaften optimiert werden können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Drosophila auf intrazelluläre Experimente vorbereitet und wie man Neuroreaktionen von seinen Photorezeptoren und Interneuronen weckt.