Name: Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von Drosophila Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Lernen Sie elektrophysiologische Methoden zur Aufzeichnung intrazellulärer Spannungsantworten von Drosophila-Fotorezeptoren und Interneuronen auf Lichtreize. Diese Technik ermöglicht hochwertige, langanhaltende Messungen mit minimalem Zellschaden.

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Die Autoren danken Mick Swann, Chris Askham und Martin Gautrey für ihre wichtigen Beiträge bei der Konstruktion und dem Bau vieler elektrischer und mechanischer Komponenten der Bohrinseln. Die aktuelle Forschung von MJ wird vom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC Grant: BB/M009564/1), dem State Key Laboratory of Cognitive Neuroscience and Learning Open Research Fund (China), dem High-End Foreign Expert Grant (China), dem Jane and Aatos Erkko Foundation Fellowship (Finnland) und dem Leverhulme Trust Grant (RPG-2012-567) unterstützt.

Die Autoren haben nichts offenzulegen

Wir haben die grundlegenden Schritte vorgestellt, wie scharfe konventionelle Mikroelektroden verwendet werden können, um intrazelluläre Reaktionen von R1-R6-Photorezeptoren und LMCs in intakten Fliegenaugen aufzuzeichnen. Diese Methode wurde in den letzten 18 Jahren zusammen mit maßgeschneiderten Hardware- und Software-Tools optimiert, um qualitativ hochwertige, langlebige Aufnahmen zu liefern, die eine Vielzahl von experimentellen Fragen beantworten. Durch die Investition von Zeit und Ressourcen in den Aufbau robuster und präziser Versuchsaufbauten und die Herstellung von Mikroelektroden mit günstigen elektrischen Eigenschaften können qualitativ hochwertige Aufzeichnungen in jedem Labor, das sich mit der visuellen Neurophysiologie von Drosophila beschäftigt, zur Norm werden. Während gut konzipierte Aufnahme- und Lichtstimulationssysteme für die schnelle Ausführung verschiedener experimenteller Paradigmen wichtig sind, gibt es drei Verfahrensschritte, die für erfolgreiche Aufnahmen noch wichtiger sind: (i) die Vorbereitung der Fliege mit minimaler Augenschädigung, (ii) das Ziehen von Mikroelektroden mit den richtigen elektrischen Eigenschaften und (iii) das Eintreiben der Aufnahmeelektrode in das Auge, ohne ihre Spitze zu brechen. Um aussagekräftige Daten erfassen zu können, muss der Forscher die physikalischen Grundlagen der Elektrophysiologie verstehen und wissen, wie geeignete Mikroelektroden für die Zielzelltypen hergestellt werden können.
Daher werden die Grenzen dieser Technik in erster Linie durch die Geduld, Erfahrung und technischen Fähigkeiten des Untersuchers gesetzt. Da es bei kleinen Drosophila-Zellen sehr lange dauern kann, diese Technik zu beherrschen, ist es für angehende Elektrophysiologen ratsam, zunächst mit größeren Insektenaugen wie der Schmeißfliege36 oder der Heuschrecke35 mit demselben Rig zu üben. Sobald die Durchführung hochwertiger intrazellulärer Ableitungen von den größeren Photorezeptoren und Interneuronen zur Routine wird, ist es an der Zeit, sich dem Drosophila-Auge zuzuwenden. Eine weitere Einschränkung der Technik betrifft die zelluläre Identifizierung. Durchdrungene Drosophila-Zellen können elektrophoretisch mit Farbstoffen beladen werden, darunter Luzifergelb oder Neurobiotin. Aufgrund der geringen Spitzengröße der Mikroelektroden arbeitet die Elektrophorese jedoch weniger effizient als mit Elektroden mit niedrigerem Widerstand, wie z. B. Patch-Elektroden. Darüber hinaus haben die farbstoffgefüllten Mikroelektroden charakteristischerweise ungünstigere elektrische Eigenschaften, was es viel schwieriger macht, mit ihnen qualitativ hochwertige Reaktionen von Drosophila-Photorezeptoren und LMCs aufzuzeichnen.
Ein technisches Problem, das manchmal auftritt, ist ein instabiles Eingangssignal oder das völlige Fehlen eines solchen. Dies ist oft damit verbunden, dass das Spannungssignal entweder ständig driftet oder höher/niedriger als der Aufnahmebereich des Verstärkers ist. In den meisten Fällen wird dieses Verhalten dadurch verursacht, dass die Aufzeichnungselektrode blockiert ist (oder dass ihre Spitze zu fein ist - mit einem zu hohen Widerstand oder einer zu hohen intramuralen Kapazität - um schnelle Signaländerungen ordnungsgemäß durchzuführen). Obwohl man versuchen kann, die Spitze durch Summen der Elektrodenkapazität zu entsperren, was manchmal funktioniert, lässt sich die Situation oft am besten lösen, indem man einfach die Aufnahmeelektrode wechselt. Dies kann außerdem Parameteranpassungen im Mikroelektrodenabzieher erfordern, um den Spitzenwiderstand der neuen Elektroden zu senken. Die Elektrodenspitze kann auch bei Präparaten verstopfen, bei denen es zu lange gedauert hat, das Hornhautloch mit Vaseline abzudecken. Längerer Luftkontakt kann das frisch freiliegende Netzhautgewebe austrocknen und seine Oberflächenschicht in eine klebstoffartige Substanz verwandeln. Wenn dies der Fall ist, sieht der Untersucher in der Regel einen roten Gewebeklumpen, der auf der Aufzeichnungselektrode klebt, wenn er sie aus dem Auge zieht. Die einzige Lösung besteht hier darin, eine neue Vorbereitung zu treffen. Vaseline kann viele Vorteile für elektrophysiologische Aufzeichnungen bieten: (i) Es verhindert die Koagulation der Hämolymphe, die die Elektrodenspitze brechen könnte; (ii) es umhüllt die Elektrodenspitze und reduziert ihre intramurale Kapazität, wodurch die Zeitkonstante der Elektrode gesenkt wird, und hat somit das Potenzial, die zeitliche Auflösung der aufgezeichneten neuronalen Signale zu verbessern40,41; (iii) es hält die Elektrodenspitze sauber und erleichtert das Eindringen; und nach der Penetration (iv) kann es sogar helfen, die Elektrodenspitze mit der Zellmembran42 abzudichten. 
Das Signal kann ferner instabil sein oder verloren gehen, wenn der Silberchloriddraht des Elektrodenhalters gebrochen oder dechloridisiert wird; In diesem Fall ersetzen oder rechloridisieren Sie einfach den alten Draht. Das fehlende Signal kann auch darauf zurückzuführen sein, dass einer (oder beide) der Elektrodenhalter nicht sicher mit ihren Buchsen verbunden sind. Es ist jedoch äußerst ungewöhnlich, dass ein Gerät nicht richtig funktioniert. Wenn das Signal nicht erkennbar ist und alle anderen Möglichkeiten ausgeschöpft sind, prüfen Sie, ob alle Teile des Aufnahmegeräts, einschließlich Kopftisch, Verstärker, Tiefpassfilter und AD/DA-Wandler, ordnungsgemäß angeschlossen sind und normal funktionieren. Eine Möglichkeit, dies zu erreichen, besteht darin, jedes Instrument durch ein anderes aus einem Rig zu ersetzen, von dem bekannt ist, dass es normal funktioniert. Alternativ können Sie einen Signalgenerator verwenden, um die Leistung der elektronischen Komponenten nacheinander zu überprüfen.
Aber das vielleicht häufigste technische Problem, mit dem der Elektrophysiologe konfrontiert ist, ist das Aufzeichnen von Rauschen. Im Großen und Ganzen ist die Aufzeichnung von Rauschen die beobachtete elektrische Aktivität, die nicht die direkte neuronale Reaktion auf einen bestimmten Reiz ist. Da die Präparation der Fliege, wenn sie richtig durchgeführt wird, sehr stabil ist, resultiert das beobachtete Geräusch (das über die natürliche Variabilität der Reaktionen hinausgeht) meist aus Erdschleifen im Aufzeichnungsgerät oder wird von in der Nähe befindlichen elektrischen Geräten aufgenommen. Ein solches Rauschen ist typischerweise ein 50/60-Hz-Netzbrummen und seine Oberschwingungen; Manchmal bestehen sie jedoch aus komplexeren Wellenformen. Um den Ursprung des Geräusches zu ermitteln, nehmen Sie den Fliegenpräparationshalter aus dem Setup, verbinden Sie die Aufzeichnungs- und Referenzelektroden mit einem Tropfen Fliegenringer (oder legen Sie sie in ein kleines Ringer-Lösungsbad; siehe Schritt 1.2.6) und nehmen Sie das Signal im CC- oder Bridge-Modus auf. Wenn das Rauschen auf dem aufgezeichneten Signal zu beobachten ist, bedeutet dies wahrscheinlich, dass das Geräusch außerhalb der Fliegenvorbereitung liegt.
Ein weiterer guter Test zur Identifizierung der Ursache des Rauschens besteht darin, die Elektrodenhalter durch ein elektrisches Zellenmodell zu ersetzen, das an den Verstärker angeschlossen ist. In einem ideal konfigurierten und geerdeten Aufbau sollte das aufgenommene Signal nun praktisch rauschfrei sein und nur noch stochastisches Bit-Rauschen vom AD-Wandler zeigen (im besten Fall nicht einmal das!). Wenn weiterhin Geräusche vorhanden sind, überprüfen Sie erneut, ob alle Bohrgeräte ordnungsgemäß geerdet sind. Ein bequemer Ansatz zur Erkennung von Erdschleifen besteht darin: (i) alle Erdungsdrähte von allen Teilen innerhalb des Prüfgeräts zu trennen; ii) sicherzustellen, dass danach jedes einzelne Teil tatsächlich mit Hilfe eines Ohmmeters von der Erde isoliert ist; (iii) Verbinden Sie die Teile nacheinander direkt mit dem zentralen Boden, nicht durch einen anderen Teil des Bohrgeräts. Versuchen Sie auch, die Gerätekonfigurationen zu ändern. Beispielsweise kann es manchmal vorkommen, dass der Computer und der Monitor weiter vom Rig entfernt sind, um das Rauschen zu reduzieren. In anderen Fällen wird die Geräuschentwicklung jedoch reduziert, wenn der Computer in das Geräterack verschoben wird. Es lohnt sich auch, Geräte in der Nähe vom Stromnetz zu trennen, um zu sehen, ob der Lärm reduziert wird, oder um zusätzliche Komponenten abzuschirmen. Versuchen Sie außerdem, verschiedene Komponenten des Aufnahmegeräts vom Stromnetz zu trennen oder auszutauschen, insbesondere BNC-Kabel (die fehlerhafte Masseverbindungen aufweisen können). Wenn bei der Verwendung des Zellmodells nur Bitrauschen beobachtet wird, ist die anfängliche Rauschquelle entweder die Elektroden oder die Fliegenpräparation selbst. Es könnte zum Beispiel sein, dass die Referenzelektrode versehentlich einen motorischen Nerv oder aktive Muskelfasern im Inneren der Kopfkapsel berührt (oder die Flugmuskulatur im Brustkorb stört - falls dort platziert). In der Regel ist es am einfachsten, eine neue Fliege für die Aufnahme vorzubereiten und dabei darauf zu achten, dass die Beschädigung der Fliege so gering wie möglich gehalten wird. Wenn das Rauschen jedoch anhält und breitbandig ist, ist es wahrscheinlich, dass die Elektroden für die Experimente suboptimal sind. zu scharf/fein (daher zu laut) oder einfach falsch für den Zweck; Wir haben sogar gesehen, dass Quarzelektroden als Antennen fungieren und schwache Sendesignale empfangen! Obwohl die Iteration der Parametereinstellungen des Puller-Instruments, um die genau richtigen Mikroelektroden für konsistent hochwertige Aufzeichnungen von bestimmten Zelltypen zu erzeugen, viel Aufwand erfordern kann, lohnt es sich. Sind die Aufzeichnungselektroden für die Experimente gut abgestimmt, können sie langlebige Aufnahmen von hervorragender Qualität liefern.
Scharfe Mikroelektroden-Aufzeichnungstechniken können in ähnlicher Weise angewendet werden, um die neuronale Informationsverarbeitung in einer Vielzahl von Präparaten zu untersuchen, einschließlich verschiedener Verarbeitungsschichten in den Insektenaugen und im Gehirn43,44. Da die Mikroelektrodenspitzen sehr fein gefertigt werden können, schädigen diese die untersuchten Zellen in der Regel weniger als die meisten Patch-Clamp-Anwendungen. Wichtig ist, dass die modernen Sample-and-Hold-Mikroelektrodenverstärker eine gute Kontrolle der elektrischen Eigenschaften der Spitzen ermöglichen40,45-47. Bei korrekter Anwendung kann diese Technik daher zuverlässige Daten sowohl von in vivo3,5,7-10,44 als auch von in vitro48 Präparaten mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis bei einer Auflösung von unter einer Millisekunde liefern. Eine solche Präzision wäre mit den heutigen optischen Bildgebungsverfahren, die lauter und langsamer sind, unmöglich. Darüber hinaus kann die Methode zur Charakterisierung der elektrischen Membraneigenschaften kleiner Zellen sowohl in den Strom- als auch in den Spannungsklemmenkonfigurationen5,29,33,36,40-42,49 verwendet werden, was wertvolle Daten für biophysikalische und empirische Modellierungsansätze7,8,11,33,49-54 liefert, die Experimente mit der Theorie verbinden.

Die Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) -Verbindung Auge ist ein großes Modellsystem die funktionelle Organisation des Photorezeptors und Euron - Arrays für die neuronale Bild Probenahme und Verarbeitung sowie für die Tier Vision zu untersuchen. Das System verfügt über das umfassendste Schaltplan 1,2 und ist liebenswürdig zu genetischen Manipulationen und präzise neuronale Aktivitätsüberwachung (von hohen Signal-zu-Rausch - Verhältnis und Zeitauflösung) 10.03. Das Drosophila Auge ist modular aufgebaut, mit ~ 750 scheinbar normalen Linse bedeckten Strukturen Ommatidien genannt, die zusammen das eine Panorama - Sichtfeld fliegen sorgen , dass fast jede Richtung um seinen Kopf bedeckt. Das Auge des primären Informationsstichprobeneinheiten sind seine rhabdomer Photorezeptoren 7,8,11. Jede Ommatidium enthält acht Sehzellen (R1-R8), welche die gleiche Facettenlinse teilen, sind jedoch sieben verschiedene Richtungen ausgerichtet sind. Während die äußeren Photorezeptoren R1-R6 are am empfindlichsten auf blau-grünes Licht, spektralen Empfindlichkeiten der inneren Zellen R7 und R8, die in die gleiche Richtung liegen übereinander und zeigen, zeigen drei verschiedene Subtypen: blass, gelb und dorsalen Randbereich (DRA) 12- 15. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig1.jpg" /> Abbildung 1. Funktionelle Organisation des Drosophila Auge. (A) Die beiden ersten Opticusganglien, Retina und Lamina, sind grau im Inneren des Fliegenaugen hervorgehoben. Retina R1-R6 und Photorezeptoren Lamina Große monopolare Zellen (LMCs: L1-L3) sind leicht zugänglich in vivo zu herkömmlichen scharfen Mikroelektroden - Aufnahmen. Die schematische Elektrode hebt den normalen Weg von R1-R6 in der Netzhaut aufzuzeichnen. Ein Weg aus LMCs in der Lamina zu erfassen ist parallel der Elektrode zu verschieben nach links. (B) Lamina ist eine Matrix von retinotop organized Patronen, von denen jede mit Neuronen gepackt, die Informationen von einem bestimmten kleinen Bereich in dem Bildraum verarbeitet. Aufgrund neuralen Überlagerung von sechs Photorezeptoren aus verschiedenen benachbarten Ommatidien senden ihre Axone (R1-R6) auf den gleichen Plättchen Patrone histaminerge Ausgangs Synapsen L1-L3 und einer amacrine Zelle (Am) bilden. (C) Die Ausbreitung der neuronalen Informationen zwischen R1-R6 Axonterminalen und die visuellen Inter (einschließlich L4, L5, Lawf, C2, C3 und T1), innerhalb einer Lamina Patrone komplex ist. (D) R1-R6 Photorezeptor Axone erhalten synaptischen Feedbacks von L2 und L4 monopolare Zellen. (B) und (C) modifiziert von Rivera-alba et al 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Das Drosophila Auge des neuronalen Überlagerung Typ 16. Dies bedeutet, tHut die neuronalen Signale von acht Photorezeptoren zu sieben gehör Ommatidien Nachbar, die im Raum an der gleichen Stelle suchen, werden zusammen in den nächsten zwei Neuropile an einer neuralen Patrone gepoolt: die Lamina und Medulla. Während die sechs äußeren Photorezeptoren R1-R6 Projekt ihre Axonterminalen zu neuronalen Spalten in der Lamina (Abbildung 1), R7 und R8 Zellen umgehen diese Schicht und synaptische Kontakte mit ihren Medulla Spalte 17-19 entspricht. Diese exakten Verdrahtungen erzeugen , das neuronale Substrat für die retinotopic Abbildung von Fly frühe Vision, wonach jede Lamelle (1A-C) und der Medulla Säule (Patrone) stellt einen einzigen Punkt im Raum. Direkte Eingänge von R1-R6 Photorezeptoren sind durch die großen monopolare Zellen erhalten (LMCs: L1, L2 und L3) und die Amakrinzell (Am) in der Lamina 1,2,20. Von diesen L1 und L2 sind die größten Zellen, zu vermitteln wichtige Informationswege (1D), which reagieren auf On- und Off-bewegten Kanten und bilden somit die Berechnungsgrundlage des Bewegungsmelders 21,22. Verhaltensexperimente legen nahe , dass bei mittleren dagegen die beiden Bahnen Bewegungswahrnehmung von entgegengesetzten Richtungen zu erleichtern: Back-to-Front in L1 und Front-to-Back in L2 - Zellen 23,24. Konnektivität bedeutet ferner , dass L4 - Neuronen entscheidende Rolle zwischen benachbarten Patronen 25,26 in der seitlichen Kommunikation spielen kann. Gegenseitige Synapsen wurden zwischen L2 und L4-Zellen befindet sich in der gleichen und zwei benachbarte Patronen gefunden. Downstream jede L2 - Zelle und die drei zugeordneten L4 Zellen ihre Axone mit einem gemeinsamen Ziel - Projekt, das Tm2 Neuron in der Medulla, wobei Eingänge von benachbarten Patronen geglaubt werden , integriert werden zur Verarbeitung von vorne nach hinten Bewegung 27. Obwohl L1 Neuronen über beide gap junctions und Synapsen Eingang von gleich Patrone L2s erhalten, sind sie nicht direkt mit L4s und damit benachbarte Lamina Cartridges. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Synaptische Feedbacks zu R1-R6 Photorezeptor Axone werden nur von Neuronen, die zu den L2 / L4 - Schaltungen aber nicht die L1 - Weg 1,2 (1D) zur Verfügung gestellt. Während gleichen Patronen Verbindungen selektiv von L2 auf R1 und R2 und von L4 bis R5 alle R1-R6 Photorezeptoren erhalten synaptische Rückkopplung von L4 von einem oder beiden benachbarten Patronen. Darüber hinaus gibt es starke synaptische Verbindungen von Am zu R1, R2, R4 und R5 und Glia - Zellen werden auch synaptisch mit dem Netzwerk verbunden und kann somit in neuronalen Bildverarbeitung 6 teilnehmen. Schließlich tragen axonalen spalt Kreuzungen verbindet benachbarte R1-R6 und zwischen R6 und R7 / R8 Photorezeptoren in der Lamina, die asymmetrische Informationsdarstellung und -verarbeitung in jeder Patrone 14,20,28. Intrazellulärer Spannung Aufnahmen von einzelnen Photorezeptoren und visuelle Inter in nahezu intakten Drosophila bieten hohen Signal-zu-Rausch - ratio Daten an Sub-Millisekunden - Auflösung 3,5,7-10,29, die zur Herstellung von Sinn der schnellen neuronalen Berechnungen zwischen den verbundenen Neuronen notwendig ist. Dieser Grad an Genauigkeit ist durch aktuelle optische Abbildungstechniken unmöglich, die wesentlich geräuschvoller sind und typischerweise bei 10 arbeiten - 100 msec Auflösung. Darüber hinaus, da die Elektroden sehr klein und scharfe Spitzen haben, ist das Verfahren nicht auf Zellkörper beschränkt, sondern direkte Aufnahmen von kleinen aktiven neuronalen Strukturen zur Verfügung stellen kann; wie die dendritischen Bäume oder Photorezeptor Axone &#39;LMCs, die von viel größeren Spitzen Patch-Clamp-Elektroden nicht zugegriffen werden kann. Wichtig ist, dass das Verfahren auch strukturell weniger invasive und schädlich als die meisten Patch-Clamp-Anwendungen, und wirkt sich so weniger die intrazelluläre Milieu und Informationen Sampling &#39;studierte Zellen. So haben herkömmliche scharfe Mikroelektroden-Techniken beigetragen, und halten Sie auf einen Beitrag, grundlegenden Entdeckungen und originelle Einblicke in neuronale information Verarbeitung bei der entsprechenden Zeitskala; unser mechanistisches Verständnis der Vision Verbesserung 10.03. Dieser Artikel beschreibt , wie in vivo intrazelluläre Aufnahmen von Drosophila R1-R6 und Photorezeptoren LMCs im Juusola Labor durchgeführt werden. Dieses Protokoll wird beschrieben, wie ein geeignetes Elektro rig zu konstruieren, bereiten die Fliege, und die Aufnahmen durchführen. Einige repräsentative Daten vorgestellt, und einige häufig auftretende Probleme und mögliche Lösungen diskutiert, die auftreten können, wenn mit dieser Methode.

<table><tbody><tr><td>Stereo-Zoom-Mikroskop für die Vorbereitung der Fliege</td><td>Olympus</td><td>SZX12 DFPLFL1,6x PF-Okulare: WHN30x-H/22</td><td>Geeignet für ~150-fache Vergrößerung mit großem Arbeitsabstand; maßgeschneidertes schweres Tischmontierungsstativ aus Stahl</td></tr><tr><td>Stereomikroskop im intrazellulären Aufbau</td> <td>& Middot; &nbsp; Olympus</td><td>Olympus SZX7; Okulare: WHN30x-H/22</td><td>30X Okulare werden benötigt, um die Reflexionen der Elektrodenspitze gut zu sehen, wenn man sie durch das kleine Hornhautloch ins Auge treibt</td></tr><tr><td>Nikon Mikroskop Nikon</td><td>SMZ645; Okulare: C-W30x/7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vibrations-Tisch</td><td>Melles Griot</td><td>Mit metrischen M6-Löchern auf dem Steckbrett</td><td>Unsere maßgeschneiderten Rigs haben ein großes Loch, das durch das dicke Steckbrett gebohrt wurde und das den Mast der Fliegenvorbereitungsplattform (in dem sich ein Kupferkühlkörper mit Elektronik befindet) von unten hereinlässt</td></tr><tr><td>Newport</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatoren</td><td>Narishige</td><td>Narishige NMN-21</td><td>In unseren intrazellulären Setups werden verschiedene Mikromanipulatorsysteme verwendet, um die ShaP-Aufzeichnungselektroden in das Fliegenauge zu treiben. Alle aufgeführten Manipulatoren liefern erfolgreich lang anhaltende stabile Aufzeichnungen von Drosophila-Photorezeptoren und LMCs.</td></tr><tr><td>Huxley Bertram</td><td>Huxley xyz-Achse mit feiner manueller Steuerung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sensapex</td><td>Sensapex Dreiachser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M&auml; rzh&auml; Benutzer</td><td>M&auml; rzh&auml; Benutzer DC-3K mit zusätzlichem x-Achsen-Piezo-Schritter und MS 314 Controller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Ständer</td><td>Jeder Magnetfuß mit Ein-/Ausschalter reicht z.B</td><td></td><td>. für die Verwaltung von Kabeln im Faradayschen Käfig</td></tr><tr><td>Elektrodenhalter</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ESP/W-F10N</td><td></td></tr><tr><td>Silver Wire</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>AGW1510</td><td>Durchmesser von 0,3 - 0,5 mm; muss für die Elektrodenhalter chloridisiert werden</td></tr><tr><td>Faseroptische Lichtquelle</td><td>Viele verschiedene, einschließlich Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Bundles</td><td>UltraFine Technology</td><td></td><td>Um den LED-Lichtreiz an das Kardanarmsystem abzugeben. Wir verwenden sowohl Flüssigkeits- als auch Quarz-Lichtleiter (Bereich von UV bis IR)</td></tr><tr><td>Thorn Labs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fliegenkathetiker-Röhrchen</td><td></td><td>P80-50P 50ml Cent. Tube PP., Packung mit 100 Stück</td><td>Schneiden Sie den konischen Boden von 50 ml Kunststoff-Zentrifugenröhrchen ab und kleben Sie eine 1 ml Pipettenspitze darauf.</td></tr><tr><td>Digitales Erfassungssystem</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einelektroden-Strom-/Spannungs-Clamp-Mikroelektrodenverstärker</td><td>npi SEC-10LX</td><td>http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html</td><td>Herausragender Leistungsträger!</td></tr><tr><td></td><td>Kopftischstandard (+/- 150 nA)</td><td>Für npi SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>LED-Lichtquellen und -Treiber</td><td>2-Kanal OptoLED (Cairn Research Ltd., UK)</td><td></td><td>Viele unserer Stimulussysteme werden im eigenen Haus gebaut&nbsp;</td></tr><tr><td>Selbst entworfene und konstruierte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erfassungs- und Analysesoftware</td><td>Viele Unternehmen zur Auswahl</td><td></td><td>Biosyst; kundenspezifisch geschriebenes Matlab-basiertes System für experimentelle und theoretische Arbeiten im Juusola-Labor</td></tr><tr><td>Personal Computer oder Mac</td><td></td><td></td><td>Stellen Sie sicher, dass PC oder Mac mit dem Datenerfassungssystem und der Software kompatibel ist</td></tr><tr><td>Kardanarmsystem&nbsp;</td><td>Selbst entworfen und konstruiert</td><td></td><td>Bereitstellung einer genauen x,y,z-Positionierung der Lichtreize</td></tr><tr><td>Peltier-Temperiersystem&nbsp;</td><td>Selbst entworfener und konstruierter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td>Selbstkonstruierter</td><td></td><td>elektromagnetischer Lärmschutz</td></tr><tr>Kapillaren <td></td> aus<td>filamentiertem Borosilikatglas</td><td>Außendurchmesser: 1 mm</td><td></td></tr><tr><td>Innendurchmesser: 0,5 - 0,7 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filamentierte Quarzglaskapillaren</td><td></td><td>Außendurchmesser: 1 mm</td><td></td></tr><tr><td>Innendurchmesser: 0,5 - 0,7 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument Unternehmen</td><td>Modell P-2000 Laser Flaming/Brown Mikropipettenabzieher</td><td>Verwenden Sie für Borosilikat-Referenzelektroden das voreingestellte Programm #11 (Patch-Elektroden): Hitze = 350; Filament = 4; Geschwindigkeit 36; Verzögerung = 200).1.2.1). Verwenden Sie für Borosilikat-Aufnahmeelektroden das voreingestellte Programm #12 (dies zieht in der Regel gute herkömmliche Kreuze&nbsp; für Photorezeptor-Aufnahmen): Hitze = 355; Filament = 4; Geschwindigkeit 50; Verzögerung = 225; Zug = 150. Bei LMC-Aufnahmen, die Elektroden mit feineren Spitzen benötigen, müssen diese Werte angepasst werden. Für das Ziehen von Quarzkapillaren schlägt das Handbuch P-2000 Programme für Mikroelektroden mit feiner Spitze vor. Diese Programme Voreingestellte Parameter dienen als nützlicher Ausgangspunkt für systematische Modifikationen zur Erzeugung von Elektroden mit gutem Eindringerfolg und geringem Aufnahmerauschen.</td></tr><tr><td>Extrazelluläre Ringerlösung für die Referenzelektrode</td><td>Chemikalien von Fisher Scientific</td><td>10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, Saccharose</td><td>Siehe das Rezept im Protokollabschnitt</td></tr><tr><td>3 M KCl-Lösung zum Befüllen der filamentierten Aufzeichnungsmikroelektrode</td><td>Salze von Fisher Scientific</td><td>10010310, KCl</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Vaseline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td></td><td></td><td></td>aus nicht-rostfreiem Stahl</tr><tr><td>Klingenhalter/-brecher</td><td>Fine Science Tools By Dumont</td><td>10053-09</td><td>9 cm</td></tr><tr><td>Blu-tack</td><td>Bostik</td><td></td><td>Alternativ können Sie auch Formtonzange</td></tr> verwenden <tr><td></td><td>Fine Science Tools By Dumont</td><td>11252-00</td><td>#5SF (superfeine Spitzen)</td></tr></tbody></table>

elektrophysiologische verfahren zur aufzeichnung von intrazellulärer spannung antworten von<em&gt; drosophila</em&gt; fotorezeptoren und inter auf lichtreize<em&gt; in vivo</em

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Spannungsantworten von Insekten-Photorezeptoren und visuellen Interneuronen können mit herkömmlichen scharfen Mikroelektroden genau aufgezeichnet werden. Die hier beschriebene Methode ermöglicht es dem Untersucher, lang anhaltende (von Minuten bis Stunden) hochwertige intrazelluläre Reaktionen von einzelnen Drosophila R1-R6-Photorezeptoren und großen monopolaren Zellen (LMCs) auf Lichtreize zu messen. Da das Aufzeichnungssystem ein geringes Rauschen aufweist, kann es verwendet werden, um die Variabilität zwischen einzelnen Zellen im Fliegenauge zu untersuchen und zu untersuchen, wie ihre Ausgaben die physikalischen Eigenschaften der visuellen Umgebung widerspiegeln. Wir skizzieren alle wichtigen Schritte bei der Durchführung dieser Technik. Die grundlegenden Schritte zum Aufbau eines geeigneten elektrophysiologischen Aufbaus für die Aufzeichnung, wie z. B. Design und Auswahl der experimentellen Ausrüstung, werden beschrieben. Wir erklären auch, wie Sie sich auf die Aufnahme vorbereiten können, indem Sie geeignete (scharfe) Aufnahme- und (stumpfe) Referenzelektroden herstellen. Es werden Details gegeben, wie man eine intakte Fliege in einem maßgeschneiderten Fliegenhalter fixiert, ein kleines Fenster in ihrem Auge vorbereitet und eine Aufzeichnungselektrode mit minimaler Beschädigung durch dieses Loch führt. Wir erklären, wie man das Zentrum des rezeptiven Feldes einer Zelle lokalisiert, die untersuchte Zelle dunkel- oder lichtadaptiert und ihre Spannungsantworten auf dynamische Lichtreize aufzeichnet. Schließlich beschreiben wir die Kriterien für stabile normale Aufzeichnungen, zeigen charakteristische hochwertige Spannungsantworten einzelner Zellen auf verschiedene Lichtreize und definieren kurz, wie ihre Signalleistung quantifiziert werden kann. Viele Aspekte der Methode sind technisch anspruchsvoll und erfordern Übung und Geduld, um sie zu beherrschen. Aber wenn es einmal gelernt und für die experimentellen Ziele des Forschers optimiert ist, liefert es hervorragende neurophysiologische In-vivo-Daten.

Die scharfe Mikroelektroden - Aufzeichnungsverfahren, wie hier für das Auge Drosophila angepasst, kann zuverlässig verwendet werden , um neuronale Informations Probenahme und Verarbeitung in der Netzhaut und Lamina Zellen, und die Kommunikation zwischen ihnen 4,5,7,8,10,33 quantifizieren. Durch die Verwendung Codierung in verschiedenen Wildtyp-Bestände zu untersuchen, Mutanten oder genetisch Fliegenstämme entwickelt, hat das Verfahren sich bewährt; nicht nur in die Auswirkungen einer Mutation, die Temperatur, Ernährung oder ausgewählten Ausdruck Quantifizierung 3,4,6,9,10,14,30,34, sondern auch mechanistischen Gründe für veränderte visuelle Verhalten 14,34 in enthüllt. Das Verfahren ist auch ohne weiteres auf andere Insekten Zubereitungen 35,36, Befähigung neuroethologischen Vision Studien. wir präsentieren Next einige Beispiele für seine erfolgreiche Anwendungen. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig7.jpg" /> Abbildung 7. SpannungsAntworten eines Fruchtfliegen - R1-R6 Photorezeptor auf einen Lichtimpuls bei 20 und 25 ° C. Da die scharfen Mikroelektroden - Penetrationen oft sehr stabil sind, ist es möglich , Spannungsantworten des gleichen R1-R6 Photorezeptor zu einem gegebenen Lichtreiz aufnehmen zu unterschiedlichen Umgebungstemperaturen durch Erwärmen oder Abkühlen der Fliege. In unserem Set-ups ist die Fly-Halter auf einem geschlossenen Regelkreis-Peltier-Element-basierte Temperatur-Kontrollsystem gegeben. Dies ermöglicht uns, die Kopftemperatur in Sekunden Fliege ändern. Eine höhere Temperatur beschleunigt die Spannungsantworten und in charakteristischer Weise senkt das Ruhepotential der R1-R6 Photorezeptoren (wie durch rote Pfeile gekennzeichnet). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Die Untersuchung der Einfluss der Temperatur auf dem Photorezeptor Output <p class="jove_content" fo:kEEP-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Mit einem gut gestalteten und schwingungsisolierten Aufnahmesystem kann das Verfahren verwendet werden, um den Einfluss der Temperatur auf einer einzelnen Zelle des neuronalen Ausgang durch Erwärmung messen oder Fliege Kühlung. Das gegebene Beispiel zeigt Spannungsantworten zu einer hellen 10 msec langen Impuls, in der gleichen R1-R6 Photorezeptor aufgezeichnet bei 20 und 25 o C (Abbildung 7). Wie quantifiziert vor 4,9 senkt Erwärmung ein Ruhepotential des Photorezeptors in der Finsternis, und beschleunigt seine Spannung Antworten. <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig8.jpg" /> Abbildung 8. Signalleistung eine Fruchtfliegen - R1-R6 Photorezeptor Verbessert mit der Lichtintensität (A) Photorezeptor Ausgang zu dimmen (unten) und hell. (Oben; 10.000-mal heller Licht) wiederholt naturalistischen Lichtintensität Zeitreihe mit dem gleichen Mikroelektroden aufgezeichnetin der gleichen Zelle bei 20 o C. Die Reaktionen auf den hellen Reiz größer sind, weil sie mehr Proben, elementare Antworten (Bumps) auf einzelne Photonen 4,5,7,8 integrieren. (B) 20 aufeinanderfolgende Ein-Sekunden langen Spannungsantworten überlagert werden. Individuelle Antworten (hellgrau) wurden nach den adaptiven Trends genommen (in Pfeil A) hatte zurückgegangen (gepunktete Box in A). Die entsprechenden Antwortmittel (die Signale) sind die dunkleren Spuren. Die Differenz zwischen dem Signal und den individuellen Reaktionen ist das Rauschen. (C) Die Zellen Signal-zu-Rausch - Verhältnisse &quot;Signalisierungsleistung wurde durch die Aufnahmen quantifiziert&quot; (SNR) unter Verwendung der Standardmethoden 4,5,7,8. Der Photorezeptor - Ausgang hat etwa 64 Hz breiteres Spektrum an zuverlässigen Signalisierung an der hellen Stimulation (SNR &#39;Bright ≥1, bis zu 84 Hz) als an der dim (SNR&#39; Dim ≥1, bis zu 20 Hz), mit signal-zu-Rausch-Verhältnis erheblich zu verbessern; von SNR Dim MAX = 87 bis SNR Hell MAX = 1.868. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig8large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig8large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Studieren Anpassung und Neuronale Kodierung durch repetitive Stimulation Die Nichtinvasivität des Verfahrens, was relativ wenig Schaden in der Retina und Lamina Strukturen, macht es ideal für die Signalisierung Leistung der einzelnen Zellen auf unterschiedliche Lichtreize in ihrer nahen natürlichen physiologischen Zustand in vivo zu studieren. 8 zeigt Spannungsantworten eines R1- R6 Photorezeptor zu einem dunklen und hellen wiederholt naturalistischen Serie Stimulus Lichtintensität bei 20 ° C, während 9 </strong&gt; zeigt Reaktionen eines anderen R1-R6 Photorezeptor und einer LMC zu einem anderen naturalistischen Reiz bei 25 o C. Die prä - und postsynaptischen Aufnahmen wurden getrennt von zwei verschiedenen Fliegen durchgeführt , weil die gleichzeitige intrazelluläre Aufnahme von zwei scharfen Mikroelektroden in der gleichen Fliege, eine in der Netzhaut und die andere in der Lamina, zu schwierig sind 30 lebensfähig zu sein. <img alt="9" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig9.jpg" /> Abbildung 9. Spannungsantworten einer Fruchtfliege R1-R6 Photorezeptor und LMC Wiederholte Naturalistische Stimulation bei 25 o C (A) R1-R6 (grau) und LMC (schwarz) Ausgänge von verschiedenen Mikroelektroden aus verschiedenen Fliegen aufgezeichnet. (B) Völlig Licht angepasst 20 aufeinander folgenden Vor- (oben) und postsynaptischen (unten) Antworten auf die gleiche naturalistischen Reizmuster mit individuellen Antworten, in Licht gezeigt , dass ein graud die entsprechenden Antwortmittel (die Signale) als die dunkleren Spuren. Die Differenz zwischen dem Signal und den individuellen Reaktionen ist das Rauschen. (C) Die Zellen Signal-Rausch - Verhältnis (SNR) &quot;Signalisierungsleistung wurde durch die Aufnahmen quantifiziert&quot;. LMC - Ausgang hat etwa 10 Hz breiteres Spektrum an zuverlässigen Signalisierung (SNR &#39;LMC ≥1, bis zu 104 Hz) als R1-R6 - Ausgang (SNR&#39; R ≥1, bis zu 94 Hz). Beide Signal-zu-Rausch - Verhältnisse sind hoch (SNR LMC MAX = 142, SNR R MAX = 752), und als das Aufzeichnungsrauschen gering war, ihre Unterschiede spiegeln reale Codierung Unterschiede zwischen den Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig9large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig9large.jpg" target="_blank">eine größere Version zu sehen diese Figur.</a> Nach dem Beginn des Stimulus, die Aufnahmen typischly zeigen schnelle Trends anzupassen, die innerhalb von 5-6 sec weitgehend abklingen. Von da an produzieren die Zellen sehr konsistente Antworten auf jede 1 Sekunde lang Stimuluspräsentation (jede gepunktete Box 20 davon umschließt). Die Wiederholbarkeit der Antworten wird offensichtlich , wenn diese überlagert sind (8B und 9B). Die individuellen Antworten sind die dünnen grauen Spuren, und ihre die dicker dunkler Spur bedeuten. Die mittlere Antwort wird als neuronales Signal genommen, während das neuronale Rauschen die Differenz zwischen dem Mittelwert und jeder einzelnen Antwort 4,5,9,37,38 ist. Die jeweiligen Signal-zu-Rausch - Verhältnis im Frequenzbereich (8C und 9C) wurden durch erhaltenen Fourier-Transformieren der Signal- und Rauschdatenabschnitte in Leistungsspektren, und Dividieren des mittleren Signalleistungsspektrum mit dem entsprechenden mittleren Rauschleistungsspektrum 4, 5,9,37,38. Charakteristischer die maximalen Signal-zu-Rausch-Verhältnisse of die aufgezeichneten neuronalen Ausgänge auf naturalistische Stimulation sind hoch (100 - 1000), und in den stabilsten Zubereitungen mit sehr niedrigen Aufzeichnungsrauschen kann Werte erreichen &gt;&gt; 1000 ( zum Beispiel 8C.). Beachten Sie auch , dass die Erwärmung dehnt sich die Zellen der Bandbreite von zuverlässigen Signalisierung 4 (SNR &#39;Bright ≥ 1); die relative Differenz zwischen den beiden R1-R6s beispielsweise in den Figuren 8 bzw. 9, 10 Hz (84 bei 20 o C und 94 Hz bei 25 o C). Man kann weiter jede Rate der Zelle Schätzung der Informationsübertragung von seinem Signal-zu-Rausch - Verhältnis durch die Gleichung Shannon mit 32, oder durch den Unterschied zwischen den Antworten der Entropie und Lärm Entropierate durch die dreifache Extrapolationsmethode 39 zu berechnen. Weitere Einzelheiten zu den Informationen theoretischen Analysen und deren Verwendung und Beschränkungs speziell mit dieser Methode sind in den früheren Veröffentlichungen 7,8,39 gegeben. <img alt="10" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig10.jpg" /> Abbildung 10. Spannungsantworten eines Killer - Fly R1-R6 Photorezeptor und LMC Wiederholte Naturalistische Stimulation bei 19 o C (A) R1-R6 (grau) und LMC (schwarz) gibt mit dem gleichen Mikroelektrode aus dem gleichen Fliege aufgezeichnet; erste postsynaptisch und später präsynaptisch, da die Elektrode im Auge fortgeschritten war. (B) 20 aufeinanderfolgende prä- (oben) und postsynaptischen (unten) Antworten (hellgrau Spuren) auf denselben naturalistischen Reizmuster wurden nach der ersten Anpassung (gepunktete Box in A) erfasst. Ihre Mittel sind die Signale (die dunkleren Spuren oben), während ihre jeweiligen Differenzen zu den einzelnen Antworten der Lärm geben. (C) Das entsprechende Signal-zu-Rausch - Verhältnis (SNR) wurden , wie in den 8C und 9C berechnet. LMC - Ausgang über ein 100 Hz breiteres Spektrum an zuverlässigen Signalisierung (SNR &#39;LMC MAX ≥1 bis zu 234 Hz) als R1-R6 - Ausgang (SNR&#39; R MAX ≥1, bis 134 Hz). Beide Signal-zu-Rausch - Verhältnisse sind hoch (SNR LMC MAX = 137, SNR R MAX = 627) und als die gleiche Mikroelektrode in die Aufnahmen eingesetzt, deren Unterschiede spiegeln wirkliche Unterschiede in den prä- und postsynaptischen neuronalen Ausgänge. Diese Ergebnisse implizieren , dass das Aufzeichnungssystem geringes Rauschen hatte, und dessen Einfluss auf die Analysen war marginal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig10large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig10large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Neuroethologischen Vision - Studien </p&gt; Das Verfahren kann auch prä - und postsynaptischen Spannung Antworten von den Facettenaugen verschiedener Insektenarten 7,8,35,36 (Abbildung 10), ermöglicht vergleichende neuroethologischen Studien der visuellen Informationsverarbeitung zur Aufzeichnung verwendet werden. Für die dargestellten Aufzeichnungssystem ist die einzige erforderliche Anpassung neuer Vorbereitung Halter, die jeweils mit einem angemessen dimensionierten Öffnung für die untersuchten Arten. Diese beispielhaften Aufnahmen sind aus einer weiblichen Killer fliegen (Coenosia attenuata). Sie zeigen intrazellulärem Spannungsantworten eines R1-R6 Photorezeptor und LMC identische sich wiederholende Lichtstimulation, wie sie für die Drosophila Pendants in Figur 9 verwendet, aber bei 19 o C. In diesem Fall sind sowohl die prä- und postsynaptischen Daten wurden aus der gleichen fly aufgezeichnet; einer nach dem anderen, zuerst mit dem gleichen Aufzeichnungselektrode (gefüllt mit 3 M KCl) durch die seitliche lamina Vorschieben vor eingebening die frontale Retina. Im Vergleich zu den Drosophila - Daten bei 25 o C, die Coenosia Daten - selbst bei der Kühlertemperatur - zeigt Antworten mit schnelleren Dynamik; die Erweiterung der Palette an zuverlässigen Signalisierung (Signal-zu-Rausch-Verhältnis &gt;&gt; 1) über einen breiteren Frequenzbereich. Derartige funktionelle Anpassungen in neuronale Codierung der naturalistischen Reize sind im Einklang mit Coenosia &#39;s räuberische Lebensweise 36, die hochpräzise Raumzeit - Informations erfordern schnelle Luftjagdverhalten zu erreichen.

Scharfe Mikroelektroden ermöglichen eine genaue elektrophysiologische Charakterisierung der Photorezeptor- und visuellen Interneuronenleistung in lebenden Drosophila. Hier zeigen wir, wie man mit dieser Methode qualitativ hochwertige Spannungsreaktionen einzelner Zellen auf kontrollierte Lichtstimulation aufzeichnen kann. Diese Methode ist ideal, um die neuronale Informationsverarbeitung in Facettenaugen von Insekten zu untersuchen.

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, intrazelluläre elektrische Reaktionen von Drosophila-Photorezeptoren und visuellen Interneuronen auf kontrollierte Lichtreize aufzuzeichnen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurokodierung zu beantworten, z. B. wie ein Lichtreiz ihn in eine seiner Reaktionen kodiert oder wie seine visuellen Informationen sowie Photorezeptoren und Interneurone aus Lichtreizen extrahiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie langlebige, qualitativ hochwertige Aufzeichnungen aus der Studie mit geringer Schädigung des intrazellulären Milieus und der Informationsabtastung liefert.Das Demonstrationsmerkmal, das dies beeinflussen kann, ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig ist, die verschiedenen Schritte korrekt auszuführen, ohne sie zu sehen. Ziehen Sie eine Referenzmikroelektrode aus filamentiertem Borosilikatglas oder aus Quarzglasrohren mit einem Standard-Pipettenabzieher. Versuchen Sie, eine kurze, allmähliche Verjüngung zu erreichen.Die genauen Einstellungen variieren je nach Instrument. Die Porengröße an der Spitze ist nicht entscheidend, da sie für die Experimente aufgebrochen wird. Ziehen Sie dann eine Aufzeichnungselektrode aus demselben Glasschlauch und versuchen Sie, eine 10 bis 15 Millimeter lange, feine, allmähliche Verjüngung zu erreichen.Montieren Sie die Elektrode an einem Lichtmikroskop auf einer Glasseite mit Mehrfachkleber und verwenden Sie ein 40-fach-Luftobjektiv, um die Spitze zu inspizieren. Eine gute Elektrode verjüngt sich sanft zu einer unsichtbar kleinen Spitze, um die herum kontinuierlich parallel dunklere und hellere Interferenzmuster zu sehen sind. Kurz vor dem Experiment wird die Referenzelektrode mit Fliegenringern verfüllt, indem eine Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einem Partikelfilter verbunden ist, mit einer feinen Kunststoffspitze verwendet wird.Für Photorezeptorexperimente wird die Aufzeichnungselektrode mit 3 molaren Kaliumchlorid beladen, bis sich an ihrem großen Ende ein Tröpfchen bildet. Dadurch wird das Rauschen des Flüssigkeitsübergangs während der Aufnahme minimiert. Um mit histaminergen LMCs zu arbeiten, füllen Sie die Aufzeichnungselektroden mit 3 molaren Kaliumacetat und 0,5 millimolarem Kaliumchlorid, um die Auswirkungen auf die Chloridbatterie der Zelle zu minimieren.Beginnen Sie damit, ein frisches Fliegenfläschchen mit fünf bis 10 Tage alten Fliegen zu befüllen. Jüngere Fliegen sind zerbrechlicher, können aber von ihnen aufgezeichnet werden. Wählen Sie die erste Fliege für die Elektrophysiologie aus.Mit großen Weibchen lässt es sich am einfachsten arbeiten. Wenn Sie sich im Fangröhrchen befinden, nutzen Sie die inhärente Tendenz, nach oben in die Pipettenspitze zu klettern und die kleinere Spitze zu verschließen. Schließen Sie dann eine 100-Milliliter-Spritze mit einem flexiblen Kunststoffschlauch an die Pipettenspitze an, die vergrößert ist, um eine Drosophila durchzulassen, und verbinden Sie das andere Ende mit einer großen Pipettenspitze, die am Fliegenhalter befestigt ist.Drücken Sie dann eine kleine Menge Luft aus der Spritze, um die Fliege in den Fliegenhalter auszuwerfen. Schauen Sie durch das Stereomikroskop und verabreichen Sie vorsichtig mehr Luft, bis der Kopf der Fliege aus dem konischen Ende des Fliegenhalters herausragt. Achten Sie darauf, dass die Fliege fest von ihrem Brustkorb eingeklemmt ist.Sichern Sie dann die Fliege mit Bienenwachs. Verwenden Sie die niedrigste Temperatur des Wachserhitzers, um das Wachs sauber zu schmelzen, das transparent erscheint. Ist es zu heiß, brennt das Wachs weg.Ruhigstellen Sie den Kopf der Fliege ruhig, indem Sie etwas Bienenwachs auf den Rüssel und den Augenwinkel auftragen und dabei die Hornhaut aussparen. Befestigen Sie diese beiden Punkte am Fliegenhalter. Beenden Sie diesen Schritt schnell, um ein Verbrennen der Fliege zu vermeiden.Setzen Sie als Nächstes eine Schutzbrille auf und stellen Sie ein Mikromesser her. Klemmen Sie eine Rasierklinge aus nicht-rostfreiem Stahl mit zwei Klingenhaltern mit flachem Griff ein und knacken Sie einen kleinen Streifen ihrer scharfen Kante. Im Idealfall erzeugen Sie eine rasiermesserscharfe Kante, die einer Turmspitze ähnelt.Öffne nun vorsichtig und mit viel Liebe zum Detail mit dem Mikromesser einige Ommatidien des linken Auges der Fliege, etwa bei vier bis fünf Ommatidien von der dorsalen Kutikula knapp über dem Äquator des Auges. Dadurch wird der Durchgang für die Aufzeichnungsmikroelektrode bereitgestellt. Dies ist eine ziemliche Herausforderung, erfordert ein gut gemachtes Messer und muss mit Übung erlernt werden.Entfernen Sie dann vorsichtig das kleine Stück Hornhaut aus der Öffnung und legen Sie die darunter liegende Netzhaut frei. Bedecke nun mit den feinen Haaren des Vaseline-Applikators das Loch schnell mit einem winzigen Klecks Vaseline. Das Gelee hat den zusätzlichen Vorteil, dass es die intramurale Kapazität der Pipette reduziert.Vermeiden Sie es, das Auge zu verschmieren, da dies die Optik verwischt. Wenn Sie den Mikroelektrodenverstärker betreiben, sollten Sie immer durch Berühren der Metalloberfläche des Faradayschen Käfigs oder des Antivibrationstisches geerdet werden, um statische Aufladungen zu vermeiden. Befestigen Sie die montierte Fliege an der Stange der Fliegenvorbereitungsplattform.Drehen Sie den Fliegenhalter so, dass das linke Auge der Fliege direkt zum Untersucher zeigt. Verwenden Sie dann einen kleinen Mikromanipulator, um die stumpfe Referenzelektrode vorsichtig durch die Augenflecken der Fliege in die Kopfkapsel einzuführen. Stellen Sie sicher, dass die Fliege noch gesund aussieht und bewegen Sie ihre Antennen.Die Vorbereitung muss hervorragend sein, um eine Aufnahme zu verdienen. Treiben Sie nun die scharfe Aufzeichnungsmikroelektrode durch die mit Gelee überzogene Öffnung in das linke Auge. Beim Eintritt in das Gewebe sollte die Position der Elektrodenspitze durch ihr Reflexionsmuster erkennbar sein.Die zerbrechliche Elektrodenspitze muss perfekt geführt werden, sonst bricht sie, was eine große Herausforderung darstellt. Je nachdem, aus welchem Zelltyp aufgezeichnet wird, sollte der Kopf der Fliege etwas anders ausgerichtet sein. Schalten Sie den Mikroelektrodenverstärker ein, wenn die Elektroden an Ort und Stelle sind.Schalten Sie dann die Kaltlichtquelle aus, ziehen Sie den Netzstecker und schließen Sie sie an die zentrale Masse an, um durch Erdschleifen verursachtes elektrisches Rauschen zu minimieren. Stellen Sie anschließend die Schwanenhals-Lichtleiter so ein, dass das Carden-Armsystem frei um die Außenscheibe bewegt werden kann. Schalten Sie dann die Raumbeleuchtung aus, um die Fliegenvorbereitung in relative Dunkelheit zu stellen.Messen Sie nun den Widerstand der Aufzeichnungselektrode im Auge. Er muss zwischen 100 und 260 Megaohm liegen. Manchmal ist die Spitze blockiert und kann mit den kapazitiven Brumm- und Stromimpulsfunktionen des Verstärkers gelöscht werden.Wenn das nicht hilft, verwenden Sie eine neue Elektrode. Stellen Sie als Nächstes den Verstärker auf Stromzange oder -brücke ein und setzen Sie die Spannung zwischen den Elektroden auf Null. Nachdem die Fliege einige Minuten lang dunkeladaptiert wurde, treiben Sie die Spitze der Aufnahmeelektrode in Schritten von 0,1 bis einem Mikrometer mit einem Piezo-Stepper oder durch sanftes Drehen des Feinauflösungsknopfes in das Auge.Stimulieren Sie das Auge bei jedem Schritt mit einem Lichtblitz von ein bis 10 Millisekunden. Jedes leichte Aufblitzen verursacht einen kurzen Einbruch der Spannung oder des ERG. Wenn die Elektrodenspitze in die Lamina eintritt und sich auf den LMCs schließt, kehrt sich das ERG um.Fahren Sie dann mit den Messungen fort. Aufgrund der Nicht-Invasivität kann die Signalleistung einzelner Zellen in ihrem naturnahen Zustand untersucht werden. Die Spannungsreaktion eines R1-R6-Photorezeptors auf schwaches und helles Licht wurde bei 20 Grad Celsius gemessen.Als nächstes wurde ein R1-R6-Photorezeptor mit einem LMC bei 25 Grad Celsius verglichen. Jede Fliege wurde an einer anderen Fliege gemessen, da intrazelluläre Aufzeichnungen durch zwei scharfe Mikroelektroden in derselben Fliege zu schwierig sind, um durchführbar zu sein. Die Wiederholbarkeit der Antworten wird deutlich, wenn die Daten überlagert werden.Signal-Rausch-Verhältnisse im Frequenzbereich wurden nach vier Jahren erhalten, indem die Signal- und Rauschdatenblöcke in das Leistungsspektrum umgewandelt und dann das mittlere Signalleistungsspektrum durch das entsprechende mittlere Rauschleistungsspektrum dividiert wurde. Das Ergebnis kann bei den besten Präparaten äußerst empfindlich auf Signale reagieren. Die Technik kann für viele Arten verwendet werden, um zu erfassen.Coenocia-Fliegen erhielten die gleiche naturalistische, repetitive Lichtstimulation bei 19 Grad Celsius. Die Daten wurden prä- und postsynaptisch von derselben Fliege entnommen, indem die Aufzeichnungselektrode vorgeschoben wurde. Die schnellere Dynamik der Aufnahme steht im Einklang mit der räuberischen Natur dieser Spezies.Einmal gemastert, ermöglicht diese Technik bei richtiger Ausführung immer lange, qualitativ hochwertige Aufnahmen. Wenn man diese Prozedur versucht, ist es wichtig zu erkennen, ich meine, es ist wie das Erlernen des Klavierspielens. Je mehr Sie üben, desto bessere Ergebnisse werden Sie erzielen.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. pharmakologische Interventionen, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Rolle von Neuromodulatoren bei der Gestaltung der Reaktionen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurobiophysik, um zu erforschen, wie Lichtinformationen, -einfang und -übertragung sowie die ätzenden biochemischen Reaktionen in der Phototransduktionsmaschinerie und in den folgenden biologischen Wissenschaften optimiert werden können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Drosophila auf intrazelluläre Experimente vorbereitet und wie man Neuroreaktionen von seinen Photorezeptoren und Interneuronen weckt.

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