Hochempfindliche und schnelle Fluoreszenzdetektion mit einem tragbaren FRET Analyzer

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die allgemeine Anwendbarkeit des FRET-Analysators unter optimalen Bedingungen durch Quantifizierung des Zuckergehalts von kommerziell erhältlichen Getränken zu demonstrieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Sensorik und Überwachung von kleinen Molekülen wie Zucker zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein frisches Signal, das auf die kleinen Moleküle reagiert, effizient überwachen kann, ohne teure High-End-Fluorometer.

Das Verfahren wird von Dr. Han aus unserem Labor vorgeführt. Bereiten Sie zunächst das Maltose- oder Saccharose-spezifische cyan- und gelb fluoreszierende Biosensor-Plasmid vor. Dann impfen Sie fünf Milliliter Luria-Brühe mit einer einzigen Kolonie DE3 E.Coli und inkubieren die Kultur 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Schüttelbrutschrank.

Als nächstes wird ein Millileter der Kultur in einen Kolben gegeben, der 100 Milliliter LB enthält. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius in einem Schüttelinkubator, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern etwa 0,5 beträgt. Zentrifugieren Sie die Kultur 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Das Pellet schnell in 50 Milliliter eiskaltem destilliertem Wasser resuspendieren und erneut 20 Minuten zentrifugieren.

Resuspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern einer 10-Volumenprozent-Lösung aus Glycerin und eiskaltem destilliertem Wasser. Schwenken Sie die Mischung vorsichtig, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 100 erreicht. Kombinieren Sie das Gemisch in einer eiskalten Elektroporationsküvette mit 10 Nanogramm CMY-Plasmid.

Elektroporate die Mischung. In der Küvette resuspendieren Sie die Zellen in einem Millileter SOC-Medium und überführen Sie sie dann in ein 15-Milliliter-Rundbodenröhrchen. Erholen Sie die Zellen, indem Sie sie eine Stunde lang sanft bei 37 Grad schütteln.

Verteilen Sie die Zellen auf einer LB-Agarplatte mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin. Inkubieren Sie die Zellen 12 Stunden lang bei 37 Grad. Übertragen Sie mit einer Schlaufe eine einzelne Kolonie auf 10 Milliliter LB, die 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthalten.

Inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad und schütteln Sie sie 12 Stunden lang, um die Samenkultur zu erzeugen. Übertragen Sie fünf Milliliter der Samenkultur auf 500 Milliliter LB mit Ampicillin und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad in einem Schüttelinkubator. Sobald die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,5 erreicht, fügen Sie IPTG hinzu, um eine Endkonzentration von 0,5 Millimolar zu erreichen.

Nachdem Sie die Kultur 24 Stunden lang inkubiert haben, zentrifugieren Sie die Zellen 20 Minuten lang. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern Bindepuffer. Beschallen Sie die Zellen 10 Sekunden lang auf Eis und kühlen Sie sie dann 10 Sekunden lang ab.

Wiederholen Sie die Beschallung und das Abkühlen noch fünfmal. Zentrifugen Sie das Lysat 30 Minuten lang. Den Überstand in ein anderes Auffangröhrchen umfüllen.

Reinigen Sie den Überstand auf einer Nickel-NTA-Affinitätssäule. Füllen Sie einen 10.000-Milliwatt-Konzentrator mit 20 Millilitern der gereinigten Probe. Zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang und füllen Sie dann den Konzentrator mit 0,8 % phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf.

Wiederholen Sie diesen Vorgang auf diese Weise mit dem Rest der Probe, jeweils 20 Milliliter, bis das gesamte Protein konzentriert und entsalzt ist. Lagern Sie den gereinigten FRET-Biosensor bei 80 Grad Celsius. Bereiten Sie eine 0,2 mikromolare Lösung aus CMY-Biosensorprotein und 0,8 % PBS als Nachweislösung vor.

Schalten Sie einen tragbaren FRET-Analysator ein. Stellen Sie die Analysetemperatur auf 53 Grad Celsius ein. Stellen Sie dann das Gerät in den Kalibriermodus.

Füllen Sie eine Küvette mit 0,8 %PBS als Hintergrund. Heizen Sie die Probe im Analysator auf 53 Grad Celsius vor und stellen Sie dann den Hintergrund ein. Füllen Sie anschließend eine Küvette mit Detektionslösung.

Setzen Sie die Küvette in den Analysator ein und stellen Sie die Basislinie ein. Ersetzen Sie die Küvette durch eine Küvette, die Nachweislösung und einen Millimolar Zucker enthält. Stellen Sie die Intensität auf Sättigung ein, um die Kalibrierung abzuschließen.

Um mit der Vorbereitung einer Getränkeprobe für die Zuckergehaltsanalyse zu beginnen, zentrifugieren Sie mit einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen einen Milliliter des Getränks. Entfernen Sie den Überstand mit einer Ein-Milliliter-Spritze und filtrieren Sie den Überstand durch einen 0,2-Mikrometer-Spritzenfilter. Kombinieren Sie 0,1 Milliliter Filtrat und 0,9 Milliliter 0,8 % PBS in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Wirbeln Sie die Mischung vorsichtig ein, um eine vollständige Verdünnung zu gewährleisten. Fünf Mikroliter der verdünnten Getränkeprobe und 495 Mikroliter Nachweislösung werden in eine Küvette gegeben. Legen Sie die Küvette in den Analysator und heizen Sie die Probe auf 53 Grad Celsius vor.

Drücken Sie die Set-Taste, um den Zuckergehalt der Probe zu messen. Bei dieser Methode wird die FRET-Effizienz durch das Verhältnis der Emissionsintensität des gelb fluoreszierenden Proteins zum cyan fluoreszierenden Protein im Biosensor gemessen. Die optimale Messtemperatur für diese CMY-Biosensoren liegt zwischen 50 und 55 Grad Celsius, da der Unterschied im Emissionsintensitätsverhältnis zwischen einer Kontrolllösung und einer gesättigten Maltoselösung am größten ist.

Mit dem CMY-BII-Biosensor wurde der Maltosegehalt von drei Getränken bei 53 Grad bewertet. Eine Dosis-Wirkungs-Kurve wird erstellt, indem dieses Verhältnis bei verschiedenen Maltose-Konzentrationen bei einer gegebenen Temperatur erhalten wird. Das Emissionsverhältnis wird anhand der bei der Kalibrierung erhaltenen Werte auf die Maltosekonzentration bezogen.

Die gemessenen Maltosegehalte werden mit den von den Getränkeherstellern gemeldeten Gesamtzuckergehalten angegeben. Getränk A enthielt Maltosequellen wie Reis und Gerste. Dementsprechend macht die beobachtete Menge an Maltose etwa die Hälfte des gesamten gemeldeten Zuckergehalts aus.

Getränk C, ein Sportgetränk, hatte einen sehr geringen Maltosegehalt. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Gerät und die FRET-Sensoren zwischen 50 und 55 Grad Celsius zu betreiben. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein so kleines Molekül mit einem speziell angefertigten tragbaren FRET-Analysator quantifizieren kann.