Name: Erkennen Cortex Fragmente während der bakteriellen Sporenauskeimung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Erfahren Sie eine kolorimetrische Methode zur Quantifizierung von Cortex-Fragmenten während der bakteriellen Sporenauskeimung bei Clostridium difficile. Dieses Protokoll ermöglicht Forschern die Untersuchung metabolischer Prozesse.

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Das Projekt beschrieben wird durch Verleihungsnummer 5R01AI116895 aus dem Nationalen Institut für Allergien und Infektionskrankheiten unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position des Nationalen Instituts für Allergien und Infektionskrankheiten oder die National Institutes of Health vertreten.

1. Erstellen von Proben <ol><li> Wärme aktivieren C. difficile Sporen bei 65 ° C für 30 min und auf Eis lagern. Hinweis: C. difficile - Sporen hergestellt und gereinigt werden , wie zuvor beschrieben , 7,9,10. </li><li> Bereiten Sie die Keimung Lösung bei X + 1 ml, wobei X die Anzahl der Abtastwerte ist, die während des Assays entnommen werden. Anmerkung: Die Keimlösung ist spezifisch für die Spezies von Bakterien untersucht-Sporen werden. Für C. Testen difficile Sporenkeimung, verwendeten wir eine Lösung von 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 100 mM Glycin und 10 mM Taurocholsäure in deionisiertem Wasser. </li><li> Vor der Durchführung des Tests, ziehen eine 1,0 ml Probe der Keimungslösung ohne Sporen als Rohling für Cortex-Fragment Erkennung dienen. </li><li> Hinzufügen Sporen zu einer OD 600 von ~ 3,0 auf die Keimung Lösung und vortex schnell. Hinweis: Für unsere Keimung Studien in B. subtilis, wir haben das gleiche OD 600 Sporen als für C. difficile. Hinweis: Diese Menge an Sporen funktionierte gut für die Überwachung der Hirnrinde Fragment während C. difficile Spore Keimung. Die Menge von Sporen in diesem Assay verwendet wird, sollte experimentell für jedes Bakterium oder Belastung bestimmt werden. </li><li> Entfernen, um eine 1,2 ml Probe unmittelbar nach der Sporen Zugabe und Zentrifuge bei Raumtemperatur für 1 min bei 14.000 × g. Dies ist der Zeitpunkt Null. </li><li> Übertragen 1,0 ml des Überstands aus der zentrifugierten Probe in ein frisches Röhrchen zur anschließenden cortex Fragmentanalyse. Hinweis: Sollte DPA muss überwacht werden, eine separate 100 ul - Probe zum Nachweis von DPA in der Lösung zu entfernen unter Verwendung eines Assays auf Basis von Terbium - Fluoreszenz 9,18,19. </li><li> Fixieren Sie die gesammelte Probe bei -80 ° C. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.4 und 1.5 in regelmäßigen Abständen, bis alle Zeitpunkte abgeschlossen. Hinweis: Da der Zeitaufwand für die Zentrifugation und Probenentnahmen, Zeitpunkte weniger thein 2 min waren abgesehen nicht möglich während unseres Verfahrens, so dass unsere Abtastintervallen waren einmal alle 2 min für 14 min. </li><li> Als Positivkontrolle für Zucker Nachweis und die Quantifizierung Verringerung umfassen die folgenden Mengen an N Acetylglucosamin (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 und 5.000. Bereiten Sie diese Proben in der gleichen Zeit wie Cortex Proben und führen zusammen mit den Cortex-Proben, so dass die Standard-Kurve an die Daten relevant sind, erzeugt durch Sporen keimen. </li><li> Nachdem alle Zeitpunkt Proben gesammelt werden, lyophilisieren die Proben. Anmerkung: Wir gefriergetrocknet, unsere Proben in 2 ml mit Schraubverschluss Röhrchen. </li></ol> 2. Messung Cortex Fragmente <ol><li> lyophilisierte Proben in 120 ul 3 N HCl supplementiert mit 1% Phenol und 0,5% β-Mercaptoethanol resuspendieren. </li><li> Übertragen Sie die resuspendierten Proben auf 2 ml mit Schraubverschluss Röhrchen. Hinweis: Für die Reproduzierbarkeit, sicherzustellen, dass alle die gefriergetrocknete Probe suspendiert und übertragen wird. </li> &lt;li&gt; Inkubieren der Proben in einem Umlaufwasserbad bei 95 ° C für 4 Stunden. </li><li> Nach der Inkubation, legen Sie die Proben auf Eis, bis sie kühl sind. </li><li> Neutralisieren der Proben mit 120 ul 3 M NaOH. </li><li> Hinzufügen, 80 ul einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 80 ul einer 5% Essigsäureanhydrid-Lösung zu jeder Probe und vortexen. </li><li> Inkubieren der Proben bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Übertragen Sie die Proben zurück zu dem 95 ° C warmen Wasserbad für genau 3 min. Hinweis: Dieser Schritt ist zeitkritisch und längere Zeiten nachgeschaltete Signalentwicklung beeinflussen können. </li><li> Entfernen Proben aus dem Wasserbad und kühlen auf Eis. </li><li> In 400 ul 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O in jedes Röhrchen und Wirbel. </li><li> Inkubieren der Proben in einem Umlaufwasserbad bei 95 ° C für genau 7 min. Hinweis: Dieser Schritt ist zeitkritisch und längere Zeiten nachgeschaltete Signalentwicklung beeinflussen können. </li><li> Entfernendie Proben und auf Eis für 5 min. </li></ol> 3. Farbreagenz <ol><li> Während Proben auf Eis (Schritt 2.12) sind, bereiten Sie das Farbreagenz. Man löst 0,320 g p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; Ehrlich-Reagens) in 1,9 ml Eisessig. Hinweis: Das Reagenz ist Zeit, Temperatur und lichtempfindlich und sollte nicht im Voraus gemacht werden. </li><li> Nachdem der DMAB vollständig auflöst, 100 ul 10 N HCl und Wirbel. </li><li> 5 ml Eisessig und Wirbel. </li></ol> 4. kolorimetrische Reaktion <ol><li> Transfer 100 ul jeder gekühlten Kortex Probe in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> In 700 ul der frisch zubereiteten Farblösung zu jeder Probe. </li><li> Unmittelbar übertragen Sie die Proben auf einem 37 ° C Wasserbad und für genau 20 min inkubiert. </li><li> Übertragen Sie 200 ul jeder Probe auf eine klare 96-Well-Platte. </li><li> Quantifizierung der Proben bei 585 nm auf einer PlatteLeser. Die Proben sollten bei einer gelben Farbe und eine positive Reaktion auf lila verschiebt starten. Je mehr Hirnrinde vorhanden ist, desto tiefer die violette Farbe. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Nach Stimulation unterzogen Sporen den Prozess der Keimung verlieren ihre Beständigkeitseigenschaften ohne die Notwendigkeit einer makromolekularen Synthese. Wenn Sporenauskeimung ausgelöst wird, 2 die Spore Kern freigibt DPA im Austausch für Wasser. Aufgrund der hohen DPA - Gehalt der ruhenden Spore, die sporen Kern unter intensiver osmotischen Druck und dem Fach Peptidoglycan, Hirnrinde, hilft durch Einwirken vermutlich als Barriere für Expansions 2 den Kern aufquellen verhindern. <p class="j...

Endospores metabolisch ruhenden Formen von Bakterien, die Bakterien erlauben, in ungünstigen Umgebungen zu bestehen. In vielen sporenbildenden Bakterien, wird die Sporenbildung von Nährstoffmangel induziert aber dieser Prozess kann 1 durch Änderungen der pH - Wert, der Exposition gegenüber Sauerstoff oder anderen Spannungen gesteuert werden. Während in ihrer metabolisch ruhenden Sporenform, wider Bakterien UV - Strahlung, Austrocknung, höhere Temperaturen und Einfrieren 2. Der größte Teil des Wissens über die Sporulation Prozess stammt aus Studien im Modellorganismus Bacillus subtilis. Die Sporulation Prozess beginnt mit der DNA - Replikation und die Bildung eines axialen Glühfaden 3,4. Eine asymmetrische Septum teilt sich dann die Zelle in zwei ungleich große Fächer. Die größere Kammer, die Mutterzelle, verschlingt die kleinere Kammer, die forespore. Sowohl die Mutterzelle und forespore Genexpression koordinieren, um die Sporen und die Mutterzelle zu reifen schließlich lysiert, die Freigabe der dormant Sporen in die Umgebung 1. Die Sporen Struktur und Zusammensetzung ist in vielen Bakterienarten konserviert. Die Spore Kern hat einen geringeren Wassergehalt als die vegetative Zelle und ist reich mit Dipicolinsäure (DPA) 1,2. Während die Sporenbildung wird DPA in die Spore Kern im Austausch für Wasser gepumpt. Den Kern umgibt , ist eine innere Membran sporen wo in den meisten sporenbildenden Bakterien, die Rezeptoren , die die kleinen Moleküle erkennen , die Keimung (Keimungsmittel) stimulieren 2 befindet. Das Hotel liegt etwas außerhalb der inneren Membran der Spore ist eine Schicht aus Zellwandpeptidoglycan. Eine spezialisierte Peptidoglycan Schicht (Cortex) umgibt die Peptidoglycan-Zellwand und viele der gleichen Komponenten wie Zellwandpeptidoglycan [alternierende N-Acetylglucosamin (NAG) und N-Acetylmuraminsäure (NAM)] zusammengesetzt ist. Jedoch etwa 50% der NAM - Reste in der Hirnrinde haben muramic-δ-lactam 5,6 umgewandelt </sup&gt;. Während der Sporenkeimung, diese muramic-δ-Lactam-Reste werden durch die Sporenrinde lytische Enzyme (SCLEs) erkannt, so dass die Rinde ermöglicht abgebaut werden (ein Prozess wesentlich Keimung abzuschließen), aber nicht die Zellwand. Die Rinde umgibt , ist eine äußere Membran und mehrere Schichten von Hüllproteinen 2. den Prozess der Keimung Steuerung ist von entscheidender Bedeutung für die sporenbildende Bakterien. Die Keimung wird eingeleitet , wenn Keimungsinduktor Rezeptoren interagieren mit ihren jeweiligen Keimungsmittel 2. In vielen sporenbildende Bakterien sind diese Keimungsmittel Aminosäuren, Zucker, Nukleotide, Ionen oder Kombinationen davon . 2 C. difficile Sporenkeimung durch Kombinationen bestimmter Gallensäuren, [zB Taurocholsäure (TA)] und Aminosäuren (beispielsweise Glycin) 7-10 eingeleitet. Obwohl es Unterschiede zwischen der C. difficile Keimung Weg und die untersuchten Wege in andere sporenbildendeBakterien, wie B. subtilis, allen gemeinsam ist die absolute Notwendigkeit der Spore Kortex abzubauen eine vegetative Zelle zu ermöglichen , von der gekeimten Spore 2,8 zu wachsen. Cortex Abbau kann durch die SCLEs CwlJ / SLEB erreicht werden oder SLEC (wie in B. subtilis gefunden) (wie in vielen Clostridia gefunden). Cortex Hydrolyse verringert die Beschränkung der Zellwand und der Spore. Dies ermöglicht eine volle Kern Rehydratisierung notwendiger Schritt in 2 viele der Proteine ​​, die für den Zellstoffwechsel zu reaktivieren. Wenn Sporen keimen, die ruhende Sporen ändert sich von einem phasen hellen Zustand in einen Phase-Dunkel-Zustand und dieser Prozess kann durch eine Veränderung der optischen Dichte (OD) bei 600 zu messen nm 11. Ein früherer Bericht legt nahe , dass ein großer Teil dieser Änderung in der OD auf die Freisetzung von DPA aus der Spore 12 zurückzuführen ist. Während unserer Studie haben wir versucht , den Zeitpunkt C zu vergleichen difficile Sporenkeimung und überwacht dieFreisetzung von DPA und Cortex - Fragmente 9. Für diese Studie war es wichtig, die Freisetzung von Cortex-Fragmente zu überwachen, wie sie begann von keimen Sporen freigesetzt werden. Die kolorimetrischen Test hier verwendet wurde , basiert auf einem Verfahren zur Bereitstellung von Zuckern mit reduzierenden Enden entwickelt Ghuysen et al erfasst wird . 13. Weil andere 14 - Protokolle zum Nachweis von reduzierenden Zuckern beschrieben haben oder diese Protokolle 15 modifiziert, kann die Literatur zu diesem Thema verwirrend sein. Hier stellen wir ausführlich die Schritt- für -Schritt - Verfahren zur kolorimetrischen Detektion von Zuckern befreit keimen C. Reduktions difficile - Sporen. Obwohl diese Studie verwendet C. difficile - Sporen sind die reduzierenden Zucker während der Keimung von Sporen von anderen sporenbildenden Bakterien freigesetzt können mit diesem Protokoll 9,16,17 erkannt werden.

<table><tbody><tr><td>2,0 ml Schraubverschluss Röhrchen</td><td>USA scientific</td><td>1420-3700</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Eppendorf Pipette</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Eppendorf Pipette</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 Eppendorf Pipette</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 - 1.250 &#956; l Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>89079-486</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &#956; Alle Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetyl-D-Glucosamin</td><td>Sigma</td><td>A3286-25G</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure - 10 N</td><td>BDH-Aristar</td><td>BDH3032-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäureanhydrid</td><td>Alfa Aesar</td><td>L04295</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>BDH</td><td>BDH0280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumtetraborat-Tetrahydrat</td><td>Alfa Aesar</td><td>39435</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>BDH</td><td>BDH8019-500G</td><td></td></tr><tr><td>4-(Dimethylamino)benzaldehyd</td><td>Sigma</td><td>156477-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gesättigtes Phenol</td><td>Fisher</td><td>BP1750-400</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M3</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure, eiskalt</td><td>BDH</td><td>BDH3098-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Beheiztes, zirkulierendes Wasserbad</td><td>VWR Scientific</td><td>Modell 1136</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 96</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>96 Well klare Gewebekulturplatten</td></tr><tr><td>Kulturröhrchen</td><td>VWR</td><td>89000-506</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilisator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wärmeblöcke</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Maschine</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

erkennen cortex fragmente während der bakteriellen sporenauskeimung

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Der Prozess der Endosporenkeimung in Clostridium difficile und anderen Clostridien unterscheidet sich zunehmend von dem sporenbildenden Modellbakterium Bacillus subtilis. Die Keimung wird durch niedermolekulare Keimlinge ausgelöst und erfolgt ohne makromolekulare Synthese. Obwohl es Unterschiede zwischen den Mechanismen der Sporenkeimung bei Bacillus- und Clostridium-Arten gibt, ist eine gemeinsame Anforderung die Hydrolyse des Peptidoglykan-ähnlichen Kortex, die es dem Sporenkern ermöglicht, anzuschwellen und zu rehydrieren. Nach der Rehydrierung kann der Stoffwechsel beginnen, was schließlich zum Auswachsen einer vegetativen Zelle führt. Der Nachweis von hydrolysierten Kortexfragmenten während der Sporenkeimung kann schwierig sein und die Modifikationen an den zuvor beschriebenen Assays können verwirrend oder schwer zu reproduzieren sein. Basierend auf unserem jüngsten Bericht über diesen Assay beschreiben wir daher ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für den kolorimetrischen Nachweis von Kortexfragmenten während der Keimung von Bakteriensporen.

Tabelle 1 zeigt typische Ergebnisse mit NAG - Standards. Daten verwendet werden , um eine Standardkurve zu erzeugen. Die Tabelle 2 zeigt typische Ergebnisse von einem Keimungsassay in Keimung Puffer , ergänzt mit 100 mM Glycin und 10 mM TA (Keimung fördernden Bedingungen) oder 100 mM Glycin allein (nicht-keimende Bedingungen). In Abwesenheit von TA, C. difficile - Sporen keimen nicht , und es gibt wenig Änderung in Gegenwart von cortex Fragmente...

Hierin beschreiben wir einen kolorimetrischen Assay zum Nachweis des Vorhandenseins von reduzierenden Zuckern während der Keimung von Bakteriensporen.

Erkennen Cortex Fragmente während der bakteriellen Sporenauskeimung

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Das übergeordnete Ziel dieses schrittweisen Protokolls besteht darin, die Menge an Cortexfragmenten oder reduzierenden Zuckern während der Keimung bakterieller Sporen zu quantifizieren. Diese Methode erläutert die erforderlichen Schritte, um das Vorhandensein von Cortexfragmenten oder reduzierenden Zuckern während der Sporenkeimung nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die meisten Laboratorien über die notwendigen Reagenzien und Geräte verfügen, um das Protokoll erfolgreich durchzuführen.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie ein Reagenzglas mit Clostridium difficile-Sporen in ein Heizblock geben und es 30 Minuten lang bei 65 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation stellen Sie das Reagenzglas auf Eis. Die Keimungslösung ist spezifisch für die Art der bakteriellen Sporen, die untersucht wird.Für die Bestimmung der C.difficile-Sporenkeimung verwenden wir eine Lösung aus 10 Millimolar Tris bei pH 7,5 mit 150 Millimolar Natriumchlorid, 100 Millimolar Glycin und 10 Millimolar Taurocholsäure in entionisiertem Wasser. Bereiten Sie ein Milliliter Keimungslösung pro Probe sowie ein zusätzliches Milliliter vor. Überführen Sie vor Beginn des Tests ein Milliliter der Keimungslösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie dieses beiseite.Dies dient als Leerwert für den Nachweis von Kortexfragmenten. Als Nächstes werden dem Keimungslösung Sporen bis zu einem OD600 von etwa 3,0 hinzugefügt und kurz vortexiert. Diese Menge an Sporen eignet sich gut, um die Freisetzung von Kortexfragmenten während der Keimung von C. difficile-Sporen zu modulieren.Unmittelbar nach dem Hinzufügen der Sporen eine 1,2-Milliliter-Probe in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen entnehmen und in die Zentrifuge geben. Anschließend eine Minute bei Raumtemperatur mit 14.000 × g zentrifugieren. Dies ist der Zeitpunkt null. Nach dem Zentrifugieren ein Milliliter des Überstandes in ein frisches 2-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen überführen und bei −80 Grad Celsius einfrieren.Wiederholen Sie den Vorgang des Entnehmens von Aliquots, des Zentrifugierens und des Einfrierens in regelmäßigen Abständen, bis die Probe für jeden Zeitpunkt gesammelt wurde. Aufgrund der für die Zentrifugation und die Probenahme erforderlichen Zeit sind Zeitpunkte von weniger als zwei Minuten während dieses Verfahrens nicht möglich, daher werden diese Proben alle zwei Minuten über einen Zeitraum von 14 Minuten hinweg entnommen. Während der Vorbereitung der Cortex-Proben sollte, falls Dipicolinsäure überwacht werden muss, eine separate 100-Mikroliter-Probe entnommen und in ein Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis gegeben werden.Bereiten Sie außerdem Proben zur Erstellung einer Standardkurve mit folgenden Mengen an N-Acetylglucosamin vor: 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 und 5.000 Nanomol in Keimungslösung. Nachdem eine Probe zu jedem Zeitpunkt entnommen wurde, nehmen Sie die Proben aus dem Gefrierschrank und lyophilisieren Sie sie gemeinsam mit der Blindprobe und den Standardkurvenproben.Danach alle Proben bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius lagern. Am Tag des Assays die lyophilisierten Proben, einschließlich der Kontrollen und der Standardkurvenproben, in 120 Mikroliter Salzsäure mit Phenol und Beta-Mercaptoethanol resuspendieren. Anschließend alle resuspendierten Proben in neue 2-Milliliter-Schraubkappengefäße überführen.Anschließend vier Stunden lang in einem umwälzenden Wasserbad bei 95 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Proben auf Eis stellen, bis sie abgekühlt sind. Dann 120 Mikroliter dreimolare Natriumhydroxid hinzufügen, um sie zu neutralisieren.Fügen Sie anschließend 80 µL einer gesättigten Natriumbicarbonat-Lösung und 80 µL einer 5 %igen Essigsäureanhydrid-Lösung zu jeder Probe hinzu und wirbeln Sie diese kräftig um. Inkubieren Sie die Proben dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation bringen Sie die Proben für genau drei Minuten zurück in das 95 °C heiße Wasserbad.Beachten Sie, dass dieser Schritt zeitkritisch ist und längere Zeiträume die nachfolgende Signalentwicklung beeinträchtigen können. Entfernen Sie die Proben aus dem Wasserbad und kühlen Sie sie auf Eis ab. Geben Sie 400 µL 6,54 % Kaliumtetraborat-Tetrahydrat zu jedem Reaktionsgefäß hinzu und wirbeln Sie gut durch.Die Proben sieben Minuten lang genau in einem umwälzenden Wasserbad bei 95 Grad Celsius inkubieren. Auch dieser Schritt ist zeitempfindlich. Die Proben entnehmen und fünf Minuten lang auf Eis stellen.Während die Proben auf Eis sind, bereiten Sie das Farbreagenz vor. Lösen Sie 0,320 Gramm DMAB in 1,9 Milliliter Essigsäureanhydrid. Beachten Sie, dass dieses Reagenz zeit-, temperatur- und lichtempfindlich ist und nicht im Voraus hergestellt werden sollte.Nachdem sich das DMAB vollständig gelöst hat, 100 Mikroliter 10-fach konzentrierte Salzsäure hinzufügen und die Probe vortexen. Anschließend fünf Milliliter Essigsäure (Eisessig) hinzufügen und erneut vortexen. Für die Farbreaktion 100 Mikroliter jeder abgekühlten Cortex- oder Kontrollprobe in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.Gebe 700&nbsp;Mikroliter der frisch zubereiteten Farblösung zu jeder Probe hinzu. Überführe die Proben unverzüglich in ein 37&nbsp;Grad Celsius warmes Wasserbad und inkubiere sie genau 20&nbsp;Minuten lang. Nach der Inkubation übertrage 200&nbsp;Mikroliter jeder Probe in eine klare 96-Loch-Platte.Die Proben sollten anfangs gelb gefärbt sein, wechseln jedoch zu lila, wenn reduzierende Zucker vorhanden sind, was auf das Vorhandensein von Cortex hinweist. Hier zeigen viele der Proben keine sichtbare violette Färbung. Die Proben mit 250, 500 und 5.000 Nanomol erscheinen jedoch optisch anders als die negative Kontrolle mit null Nanomol.Bestimmen Sie mithilfe eines Plattenlesegeräts die Absorption bei 585 Nanometern. Bei einer Messung bei einer OD von 585 Nanometern entspricht das von den Standardproben erzeugte Signal am besten einer linearen Regression. Diese Tabelle zeigt typische Ergebnisse unter Verwendung von N-Acetylglucosamin-Standards.Diese Daten wurden anschließend verwendet, um die hier gezeigte Standardkurve zu erstellen. Ein Keimungsassay wurde unter keimungsfördernden Bedingungen mit Keimungspuffer, der mit 100 Millimolar Glycin und 10 Millimolar Taurocholsäure ergänzt wurde, durchgeführt. Unter nicht-keimenden Bedingungen nur mit 100 Millimolar Glycin.Bei Abwesenheit von Taurocholsäure keimen C. difficile-Sporen nicht, und es tritt kaum eine Veränderung im Gehalt an Cortex-Fragmenten in der Lösung auf. Im Vorhandensein sowohl von Taurocholsäure als auch von Glycin hingegen keimen die C. difficile-Sporen und setzen Cortex-Fragmente in die Lösung frei. Dies zeigt sich als Anstieg der Extinktion bei 585 nm über die Zeit der inkubierten Proben.Die Menge an freigesetzten Kortexfragmenten während dieses Assays wurde anhand einer Standardkurve berechnet. Wie hier in diesem Assay zu sehen ist, wurde der größte Teil des Kortex innerhalb von 15 Minuten nach der Exposition gegenüber dem Keimreiz hydrolysiert oder freigesetzt. Dies deutet darauf hin, dass die meisten Sporen innerhalb dieses Zeitraums gekeimt haben.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Cortex-Fragmente oder reduzierende Zuckermengen in einer Keimungslösung während der Keimung bakterieller Sporen nachweisen kann. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, genau auf die Reaktionszeiten zu achten, damit der Assay korrekt verläuft.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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