Name: Mucin Agarose-Gel-Elektrophorese: Western Blotting für Hochmolekulare Glykoproteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Lernen Sie die Agarose-Gel-Elektrophorese zur Analyse hochmolekularer Mucine aus schleimreichen Proben. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung und Untersuchung des Polymerisationszustands von Glykoproteinen.

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Die Autoren möchten Dr. John Sheehan und Dr. Lubna Abdullah für ihre Anleitung und ihr Mentoring danken, die für die Fertigstellung dieser Arbeit von zentraler Bedeutung waren. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der National Institutes of Health (P01HL108808, UH2HL123645) und der Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0) unterstützt. Kathryn Ramsey wird durch ein NHMRC Early Career Research Fellowship unterstützt.

1. Bereiten Sie Puffer für Mucin Gel Western Blotting <ol><li> Bereiten Sie 1 Liter 50x TAE (Tris-Acetat-EDTA) Puffer. <ol><li> In 700 ml destilliertem Wasser (dH 2 O) in 242 g Tris - Base (0,4 M), 57,1 g Eisessig (wiegen Flüssigkeit) (0,2 M) und 14,61 g (EDTA) (50 mM). </li><li> Der pH - Wert auf 8,0 und das Volumen machen bis zu 1 Liter mit dH 2 O. </li></ol></li><li> Herstellung von 10 ml der 10fach-Beladungspuffer. <ol><li> Bereiten Sie 5 ml 1x TAE-Puffer. Dazu werden 5 ml Glycerin (50%), 25 mg Bromphenolblau (0,25%) und 100 mg Natriumdodecylsulfat (SDS) (1%). </li></ol></li><li> Bereiten Sie 2 Liter 20x Natrium Kochsalzcitrat (SSC) Puffer. <ol><li> In 1,5 l dH 2 O, fügen 350,6 g NaCl (3 M) und 176,4 g Trinatriumcitrat (Na 3 C 6 H 5 O 7) (0,3 M). Der pH - Wert auf 7,0 und das Volumen auf 2 Liter mit dH 2 O bilden </li></ol></li><li> Bereiten Sie 1 Liter 1x TAE-0,1% SDS-Puffer. <ol><li> 20 ml 50x TAE bis 980 ml ​​dH 2 O. 1 g SDS zu einer 0,1% igen SDS-TAE-Lösung zu machen. </li></ol></li></ol> 2. TAE-SDS-Agarose-Gel Vorbereitung <ol><li> (. Dh 150 ml) Gießen ausreichendes Volumen 1x TAE-0,1% SDS - Puffer in einem microwavable Erlenmeyerkolben , um eine 5-7 mm dicke Gel. Hinzufügen, 0,8% (1,2 g) Agarose-Pulver. </li><li> Mikrowelle Kolben in 30 Sekunden-Intervallen mit intermittierender wirbelnden bis Agarose vollständig gelöst ist (normalerweise 1 - 3 Minuten). Verwenden Sie heiße Hand Pads während dieses Prozesses. Seien Sie vorsichtig, plötzliches Überkochen während wirbeln. </li><li> Lassen Sie die Agarose-Lösung abkühlen 5 - 10 min. Hinweis: Die Agarose-Lösung bereit sein wird, gegossen werden, wenn Boden des Kolbens für 5 sec auf der Handfläche belassen werden. </li><li> Bereiten Elektrophorese Gussschale (10 x 15 cm), indem Sie die Ränder mit Dichtband und Platzierung gut in Position kämmen. </li><li> Gießen Sie langsam Agarose-Lösung in ter Gussschale die Bildung von Blasen zu vermeiden. Entfernen Sie Blasen, die eine Pipettenspitze. Warten Sie auf das Gel zu kühlen und vollständig zu verfestigen. Einmal verfestigt, nehmen Sie den Kamm langsam durch Absaugen kollabiert die Vertiefungen zu vermeiden, und das Band von den Rändern der Schale zu entfernen. </li><li> Legen Agarose-Gel in das Gel Box und füllen Sie die Elektrophorese-Einheit mit 1x TAE-0,1% SDS-Puffer, bis das Gel vollständig bedeckt ist. </li></ol> 3. Probe geladen und Elektrophorese-Trenn Hinweis: In unserem Labor haben wir häufig Proben verwenden, um von Maus und Menschen, einschließlich bronchoalveolären Lavage (BALF, beide Spezies), Zell-Waschungen aus humanen bronchialen Epithelzellen (HBE) und menschlichem Speichel und Sputum-Proben. Proben können durch Zugabe von Proteinase-Inhibitor-Cocktail in 6 M Harnstoff bei der Abholung oder gelagert für kurze Zeiträume (6 h) denaturiert werden. <ol><li> Vorbereiten Proben für die Beladung durch Zugabe von 10% der Lade Farbstoff zu jeder Probe (dh., 30 ul Probe und 3ul Farbstoff). Homogenisieren Proben von oben und unten Pipettieren. Spin Kurz Röhrchen bei 5.000 Umdrehungen pro Minute nach unten Tröpfchen zu sammeln. </li><li> Sorgfältig laden gleichen Volumen von Proben in die Vertiefungen. <ol><li> Vornässen Spitzen und / oder Verdrängungspipetten verwenden Laden von hochviskosen Proben zu erleichtern. Langsam absaugen 80-90% der Proben-Farbstofflösung (dh 27 bis 30 &amp; mgr; l) Pipettieren Blasen zu vermeiden. </li><li> am Boden der Wells laden langsam und schrittweise nach oben die Pipettenspitze zu bewegen. Bei Proben, die an der Pipettenspitze befestigt bleiben, in einem 45 ° Winkel verzichtet und gerade über dem Brunnen verlängern oder sanft auf die Seite des gut verwenden, um den sehnig Schleim brechen. Sie nicht die Brunnen überlasten. </li></ol></li><li> Verbinden Sie die Elektroden aus dem Gel Box auf der Elektrophorese-Stromerzeuger. Sicherstellen , dass die Elektroden korrekt angeschlossen sind (dh., Angeschlossen rote Kabel am positiven Ausgang des Generators) zu erlauben , negativ geladene Muzine in Richtung der positiven laufen<html> Elektrode. </li><li> Laufen um das Gel bei 80 Volt für 90 min für eine einzelne Kamm Gel oder 60-75 min nach einem Doppelkamm Gel Überlappung zwischen den beiden Reihen zu verhindern. </li><li> Schalten Generatorleistung aus und trennen die Elektroden von der Stromquelle. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Gel aus dem Gel-Box mit einer Hand auf beiden Seiten der Gelträger das Gel bleibt an Ort und Stelle zu gewährleisten. </li></ol> 4. Reduzieren Agarose-Gel für die effiziente Übertragung Mucin <ol><li> Legen Sie das Gel flach in einem Glasbehälter. Spülen Sie das Gel mit dH 2 O Spuren von TAE-SDS - Puffer zu entfernen. </li><li> Vorbereitung 1 Liter 4x SSC - Puffer durch Zugabe von 200 ml 20x SSC in 800 ml dH 2 O. Machen 200 ml von 10 mM Dithiothreitol (DTT) 4x SSC Lösung durch Zugabe von 309 mg von frischem DTT in 200 ml 4x SSC-Puffer. </li><li> Weichen Sie das Gel mit DVB-T-4x SSC-Puffer und Deckel. sachte für 20 min (10 Umdrehungen pro Minute). Spülen Sie Gel mit DVB-T-freien Puffer 4x SSC. </li></ol>&quot;&gt; 5. Vakuum-Kladde Montage und Sample Transfer auf eine Nitrocellulosemembran <ol><li> Bereiten Sie Vakuum Löscher für die Übertragung. <ol><li> Bei Abmessungen Nitrocellulosemembran etwas breiter als das Gel (dh., 10 x 15 cm) Schneiden Sie vorsichtig. </li><li> Nasse poröse Matte mit dH 2 O und legen Sie es glatt Seite nach oben in die Kladde. </li><li> Wet Nitrocellulosemembran mit DTT freien SSC-Puffer 4x und legen Sie sie in der Mitte der porösen Matte. </li><li> Decken die poröse Matte mit der Gummidichtung, so dass die Öffnung der Dichtung präzise mit der Nitrocellulose-Membran ausgerichtet ist. Wenn poröse Matte noch sichtbar ist, stellen Sie vorsichtig die Membran kein Spalt bleibt zwischen Dichtung und Membran zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Legen Sie das Agarose-Gel auf der Oberseite der Membran. Gewährleisten Gel bildet eine dichte Abdichtung mit der Dichtung und die Vertiefungen des Gels auf der Membran für die Übertragung angeordnet sind. <ol><li> Vermeiden die Bildung von Blasen zwischen der Membran und dem Gel. Zur Minimierung derBildung von Blasen, spritzen einige Tropfen 4x SSC auf die Membran puffern und das Gel von oben nach unten keine Blasen gebildet zu spülen gleiten. Vermeiden Sie das Gel auf die Membran bewegt, wie Proteine ​​sofort auslöschen beginnt. </li></ol></li><li> Sorgfältig abdecken, das Gel mit Puffer 4x SSC. </li><li> Beginnen Mucin Übertragung durch Absaugen. <ol><li> Drehen Sie Vakuum blotter ein und setzen Sie Druck bei 40 - 50 mbar. Fügen Sie ein paar Tropfen 4x SSC-Puffer auf dem Gel alle 5 - 10 min, das Gel vor dem Austrocknen zu verhindern. Führen Sie Transfer für 90 min. Optional: Nach der Fertigstellung der Brunnen mit einem Bleistift zur Orientierung markieren. </li></ol></li><li> Entsorgen Sie das Gel und Abrufen von Nitrocellulosemembran auf dem Rand der Membran Kunststoff-Pinzette. </li></ol> 6. Membran Blocking und Nachweis <ol><li> Spülen Membran sofort mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Nicht die Membran austrocknen lassen. </li><li> Tauchen Sie die Membran in 50 ml 3% Milch-PBS Blockierungspuffer und auf ein rocker bei Raumtemperatur für 1 Std. die Blockierungspuffer Nach der Inkubation verwerfen. </li><li> Tauchen Membran in 1% Milch-PBS primären Antikörperlösung. Inkubieren der Membran in der primären Antikörperlösung über Nacht auf einem Schüttler bei 4 ° C. Nach der Inkubation verwerfen die primäre Antikörperlösung. Verdünne die primären Antikörper gegen ein 1: 2000 Verhältnis der Antikörperlösung Puffer zu blockieren. Anmerkung: Für Proben von Mäusen stammen, verwenden wir UNC 222 Kaninchen-anti-MUC5B und Ziege-anti-Green Fluorescent Protein (GFP). Bei Proben von Menschen stammen, verwenden wir H300 anti-MUC5B und 45M1 anti-MUC5AC primären Antikörper. </li><li> Wasch Membran 3 mal für 10 min auf einer Wippe mit PBS. </li><li> Tauchen Membran in 1% Milch-PBS sekundäre Antikörperlösung. Verdünne die Sekundärantikörper zu einer 1: 7.500 - Verhältnis von Antikörperlösung Puffer zu blockieren und Inkubation für 1 h auf einem Schüttler bei Raumtemperatur (beispielsweise 700 - Anti-Kaninchen und Anti-Ziege - 680.). Vor Licht durch in einem nicht transparenten Co Inkubationntainer. Entsorgen Sie die sekundären Antikörper-Lösung nach 1 Stunde. </li><li> Waschen Sie die Membran 3 mal mit PBS für 5 min. Spülen Membran mit dH 2 O Salz zu entfernen. </li><li> Lesen Sie die Membran auf einem Infrarot-Fluoreszenzsystem nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol>

<ol><li>Henderson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+airway+secretions+exhibit+mucin+hyperconcentration+and+increased+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure.</a> J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).</li>
<li>Preciado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC5B+Is+the+predominant+mucin+glycoprotein+in+chronic+otitis+media+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid.</a> Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).</li>
<li>Wang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+in+cervicovaginal+mucus+traps+HSV+and+prevents+vaginal+herpes+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).</li>
<li>Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucins+in+the+mucosal+barrier+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mucins in the mucosal barrier to infection.</a> Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).</li>
<li>Thornton, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucus+glycoproteins+from+%27normal%27+human+tracheobronchial+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Mucus glycoproteins from 'normal' human tracheobronchial secretion.</a> Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).</li>
<li>Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpacking+a+gel-forming+mucin%3A+a+view+of+MUC5B+organization+after+granular+release%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).</li>
<li>Kesimer, M., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+analysis+of+mucin+core+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric analysis of mucin core proteins.</a> Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).</li>
<li>van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+enzyme+approach+for+the+characterization+of+glycan+modifications+on+the+C-terminus+of+the+intestinal+MUC2mucin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).</li>
<li>Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+glycoproteins+on+nitrocellulose+membranes+and+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels.</a> Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).</li>
<li>Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+glycoproteins+on+nitrocellulose+membranes+and+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels.</a> Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).</li>
<li>Sheehan, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+characterization+of+the+MUC5AC+mucin%3A+a+highly+oligomeric+glycoprotein+whether+isolated+from+cell+culture+or+in+vivo+from+respiratory+mucous+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions.</a> Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).</li>
<li>Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+glycoforms+of+the+MUC5B+mucin+in+human+respiratory+mucus.+Evidence+for+a+cysteine-rich+sequence+repeated+within+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule.</a> J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).</li>
<li>Sheehan, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+molecular+intermediates+in+the+assembly+pathway+of+the+MUC5AC+mucin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin.</a> J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).</li>
<li>Ehre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressing+mouse+model+demonstrates+the+protective+role+of+Muc5ac+in+the+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).</li>
<li>Livraghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+and+lung+pathology+due+to+mucosal+surface+dehydration+in+%7Bbeta%7D-epithelial+Na%2B+channel-overexpressing+mice%3A+role+of+TNF-%7Balpha%7D+and+IL-4R%7Balpha%7D+signaling%2C+influence+of+neonatal+development%2C+and+limited+efficacy+of+glucocorticoid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment.</a> J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).</li>
<li>Martino, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ER+stress+transducer+IRE1beta+is+required+for+airway+epithelial+mucin+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production.</a> Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).</li>
<li>Nguyen, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+beta-blockers+attenuates+inflammation+and+mucin+content+in+a+murine+asthma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).</li>
<li>Papakonstantinou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPD+exacerbations+are+associated+with+pro-inflammatory+degradation+of+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid.</a> Chest. , (2015).</li>
<li>Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+mucin+secretion+from+human+bronchial+epithelial+cell+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures.</a> Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben keinen Konflikt offen zu legen.

Das Protokoll von Western - Blot in diesem Video kombiniert in der Molekularbiologie üblichen Techniken beschrieben Mucin große Makromoleküle zu trennen und zu übertragen, wie beispielsweise DNA, mit regelmäßigen Techniken zur Proteindetektion, dh., Immun - Blotting. Dieselbe Technik kann angewandt werden , die Biologie komplexer Glykosaminoglykanen zu studieren, wie beispielsweise den Abbau von hochmolekularen Hyaluronsäure 18. Obwohl diese Technik in einem breiten Bereich von Assays erfolgreich Aga...

Mucine werden normalerweise durch Schleimhautoberflächen erzeugt , die Hohlräume freigelegt mit der äußeren Umgebung Leitung (z. B., Atmungs-, Verdauungs-, Fortpflanzungstrakt, Augenoberfläche) sowie der inneren Organe (zB Pankreas, Gallenblase, Brustdrüsen). Das Vorhandensein dieser Glykoproteine ​​hält Oberflächenhydratation und bildet eine physikalische Barriere gegen Krankheitserreger. Obwohl Mucin Produktion ist wichtig, Gesundheit, Mucin Hyperkonzentration und / oder anomale Schleim Eigenschaften der Schleimhaut zu Obstruktion, bakterielle Besiedlung und chronische Entzündungen führen kann, die irreversible Gewebeschäden verursachen können. Eine ähnliche Kaskade von Ereignissen werden in mehreren Krankheiten beobachtet, z. B. zystische Fibrose 1, chronische Otitis media 2 und zervikovaginalen Infektion 3. Daher ist es wichtig, die Rolle von Mucinen in Gesundheit und Krankheit zu verstehen und Routineprotokollen zur Proteinidentifizierung zu etablieren. Miteinander ausgehenHaben, 19 Mucine Gene für große Polypeptidketten kodieren identifiziert und von 1,200 bis hin (z. B. MUC1) bis 22.000 (zB MUC16) Aminosäuren. Die Mucin-Genfamilie kann in zwei Untertypen unterteilt werden: die Membran-assoziierten Mucine, beteiligt an Zellsignalisierung und Oberflächen Abschirmung und die gelbildenden Mucine, verantwortlich für die viskoelastischen Eigenschaften von Schleim Gelen. Membran-assoziierte Mucine sind meist monomeren und heften sich an den Zelloberflächen über eine hydrophobe Transmembrandomäne. Im Gegensatz dazu gelbildenden Mucine besitzen mehrere von-Willebrand-Faktor (vWF) -ähnliche und Cystein-reichen Domänen, die für die Bildung von dynamischen polymeren Netzwerke wesentlich sind. Große Glykane sind an Serin und Threonin-Resten im gesamten apomucin verteilt. Diese dichten O-verknüpften Oligosaccharide kann bis zu 80% des Molekulargewichts 4 beitragen. Intra- und intermolekulare Disulfidbrücken verbindet Mucin Monomere gewährleisten die Integrität des Mucin Gel network. Als Folge der schweren Glykosylierung und Multimerisierung sind Muzine zu den größten Moleküle in der Tierwelt und nicht durch Standard-Gelelektrophorese unter Verwendung herkömmlicher SDS-PAGE Polyacrylamid-Gel und Standard-Proteinleitern analysiert werden kann. Diese Methoden lösen / getrennten Proteine ​​mit Molekulargewichten unter 250 kDa, während Mucin Monomere können bis zu 2 MDa im Fall von MUC16 erreichen. Jedoch können hochmolekulare Proteinleitern verwendet werden , um kleine Mucin Monomeren zu untersuchen (dh., MUC1). Eine Vielzahl von Techniken kann Mucin Größe, Konformation und Interaktion zu untersuchen angewendet werden. Traditionell wird durch Mucin - Isolierung über isopycnic Dichtegradientenzentrifugation in denaturierenden Puffer, gefolgt von Größenausschlusschromatographie und Immunnachweis (z. B. Schlitz - Blotting) biochemische Charakterisierung von Mucinen erreicht 5. Dynamische und / oder Mehrwinkellichtstreuung Informationen über den oligomeren Zustand von Mucin-reichen Proben zur Verfügung stellen &lt;sup&gt; 1. Zusätzlich geschwindigkeits Zonenzentrifugation verbunden mit Immunnachweis und Transmissionselektronenmikroskopie werden üblicherweise die makromolekulare Konformation von Mucinen 6 zu bestimmen. Die Massenspektrometrie ist auch proteolytischen Spaltung und analysieren Oligosaccharid - Zusammensetzung 1,7,8 verwendet Muzine zu quantifizieren, zu erfassen. Solche Techniken sind teuer, zeitaufwendig und oft große Mengen erfordern und / oder hohe Konzentrationen der Probe. Die Methodik hier beschrieben, dh., Mucin - Trennung durch Elektrophorese, ist reproduzierbar, kostengünstig und können in Hochdurchsatz - Studien verwendet werden , um relative Mucin Quantifizierung bereitzustellen und Polymeranordnung untersuchen. Allerdings erfordert dieser Test mit hoher Affinität und hoher Spezifität Mucin - Antikörper , die nicht für seltene mucins verfügbar sein können (z. B. MUC19) oder bestimmte Arten (z. B. Schwein, Frettchen). Agarose Western-Blot geeignet ist, eine Vielzahl von Mucin-reichen Proben mit Konzentrationen aufzulösengen im Bereich von 50 &amp; mgr; g / ml (z. B. Zell Wäschen) bis 5 mg / ml (z. B. Sputum). Dieser Test wurde in den 1990er Jahren eingeführt und wurde nur in wenigen Speziallabors 9,10 durchgeführt. Zunächst half diese Technik Atemwegssekreten 11,12 Subpopulationen von Mucin Monomeren in menschlichen identifizieren und bestätigte das Oligomerisierungsverfahren in Becherzellen, die im endoplasmatischen Retikulum gefolgt von Dimer Multimerisierung im Golgi - Apparat 13 von Dimer - Bildung besteht. In jüngerer Zeit von der Erzeugung von polyklonalen Antikörpern gegen Mäuse mucins erleichtert Studien an kleinen Tiermodellen (z. B. Mucin - defizienten, βENaC, OVA-herausgefordert Mausmodelle) und eröffnet ein neues Forschungsgebiet für präklinische Studien Verbindungen Testen pharmakologische auf die Beseitigung von Schleim ausgerichtet die Lunge 14-17. Als Ergebnis eines zunehmenden Interesses in biology Mucin und die Erzeugung neuer, spezifischere Mucin-Antikörper beschreiben wir herein die Methodik zu trennen Mucine durch Agarose-Gelelektrophorese, Vakuum Transfer auf Nitrocellulose und Zweifarben-Infrarot-Fluoreszenzdetektion.

<table><tbody><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T6060-1kg</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Sigma</td><td>ARK2183-1L</td><td>1 L</td></tr><tr><td></td><td>EDTA Sigma</td><td>EDS-100g</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Bromphenol Blue</td><td>Sigma</td><td>114391-5g</td><td>5 g</td></tr><tr><td>SDS (Natriumdodecylsulfat)</td><td>Sigma</td><td>L6026-50g</td><td>50 g</td></tr><tr><td>20x SSC (Natriumkochsalzcitrat) Puffer</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>1 L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat (Na3C6H5O7)</td><td>Sigma</td><td>W302600-1kg</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>10 mM DTT (Dithiothreitol)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Milchpulver</td><td>Saco</td><td></td><td>Instant fettfreie Trockenmilch</td></tr><tr><td>Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (D-PBS)</td><td>Gibco lifetechnologies</td><td>14200-025</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Anti-GFP Ziege Primärantikörper (Mausproben)</td><td>Rockland Antikörper und Assays</td><td>600-101-215</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>UNC 222 Anti-Muc5b Kaninchen Primärantikörper (Mausproben)</td><td>UNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H300 Anti-MUC5B Primärantikörper (Humanproben)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20119</td><td>200 &#956; g</td></tr><tr><td>45M1 Anti-MUC5AC Primäre Antikörper (Humanproben)</td><td>Abcam</td><td>ab3649</td><td>100 &#956; g</td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen 800CW IR Farbstoff</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32213</td><td>0,5 mg</td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus 680LT IR Farbstoff</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68022</td><td>0,5 mg</td></tr><tr><td>Elektrophorese Gelbox und Gießschale</td><td>Eule Trennsysteme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stromversorgungsbox</td><td>Biorad</td><td>Modell 200/20</td><td></td></tr><tr><td>Membran Löschpapier</td><td>Amersham&nbsp;</td><td>10600016&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Papier und Nitrozellulosemembran&nbsp;</td><td>GE&nbsp;</td><td>10 439 196</td><td></td></tr><tr><td>Boekel/Appligene Vakuum-Löschblatt 230 V</td><td>Expotech USA</td><td>230600-2</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Infrarot-Fluoreszenzsystem</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mucin agarose-gel-elektrophorese: western blotting für hochmolekulare glykoproteine

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucine, die stark glykosylierte Proteine ​​Schleimhautoberflächen auskleiden, sind als wichtiger Bestandteil der angeborenen Abwehr entwickelte sich durch das Epithel gegen eindringende Krankheitserreger zu schützen. Die Hauptrolle dieser Makromoleküle ist Einfangen der Teilchen und Abstand zu erleichtern, während die Schmierung der Schleimhaut zu fördern. Während der Proteinsynthese zu unterziehen Mucine intensive O-Glykosylierung und Multimerisierung, die dramatisch die Masse und Größe dieser Moleküle erhöhen. Diese post-translationalen Modifikationen sind entscheidend für die viskoelastischen Eigenschaften des Schleims. Als Folge der komplexen biochemischen und biophysikalischen Natur dieser Moleküle stellt die Arbeit mit Mucinen vielen Herausforderungen, die nicht durch herkömmliche Proteinanalyseverfahren überwunden werden können. Zum Beispiel ihre hohem Molekulargewicht verhindert elektrophoretische Wanderung durch regelmäßige Polyacrylamidgelen und ihre klebrigen Natur verursacht Adhäsion an Versuchsrohr. Doch die Untersuchung der Rolle von Mucinen in den Bereichen Gesundheit(Z. B. die Aufrechterhaltung der Schleimhaut Integrität) und Krankheiten (z. B. Hyperkonzentration, mucostasis, Krebs) hat vor kurzem gewonnen Interesse und Mucine werden als therapeutisches Ziel untersucht. Ein besseres Verständnis der Produktion und Funktion von Makromolekülen Mucin können neue pharmazeutische Ansätze, beispielsweise Inhibitoren der Muzin - Granulat Exozytose und / oder schleimlösende Mittel führen. Daher konsistente und zuverlässige Protokolle kritisch Mucin Biologie sind für wissenschaftlichen Fortschritt zu untersuchen. Hier beschreiben wir herkömmlichen Verfahren Mucin Makromolekülen durch Elektrophorese unter Verwendung eines Agarosegels getrennt, übertragen Protein in Nitrocellulosemembran und Erkennungssignal mit Mucin-spezifische Antikörper sowie Infrarot-Fluoreszenz Gel reader. Diese Techniken sind allgemein anwendbar Mucin Quantifizierung Multimerisierung zu bestimmen und die Wirkungen von pharmakologischen Verbindungen auf Mucinen zu testen.

Wir zeigen repräsentative Ergebnisse von Muzinexpression folgende Agarose - Gelelektrophorese in BALF aus den Lungen von Mäusen (Abbildung 1). Folgende IL-13 Behandlung des Tg-MUC5AC Maus-Modell In diesem Beispiel verwendeten wir das Agarosegel upregulation zu zeigen, Produktion Mucin. Der Western - Blot zeigt eine visuelle Darstellung der Muzinexpression, die für eine quantitative Analyse von Multimer oder Monomerbande Signalintensität (Abbildung 2) ver...

Mucine sind hochmolekulare Glykokonjugate mit einer Größe von 0,2 bis 200 Megadalton (MDa). Aufgrund ihrer Größe dringen Muzine nicht in herkömmliche Polyacrylamid-Gele ein und benötigen größere Poren zur Abscheidung. Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Mucin-Agarose-Gelelektrophorese zur Verfügung, um die relative Quantifizierung zu bewerten und die Polymerassemblierung zu untersuchen.

Mucin Agarose-Gel-Elektrophorese: Western Blotting für Hochmolekulare Glykoproteine


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Das übergeordnete Ziel dieser Western-Blot-Technik für glykoproteine mit hohem Molekulargewicht besteht darin, Muzine, die in mukusreichen Proben enthalten sind, elektrophoretisch zu trennen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Muzinbiologie zu beantworten, beispielsweise die Untersuchung des polymeren Zustands und der relativen Konzentrationen spezifischer Muzine, die aus verschiedenen Schleimhautoberflächen gewonnen wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie einfach zu etablieren ist, relativ kostengünstig und nur minimale Laborausrüstung erfordert.Den Ablauf wird Sophia Samir, Fachkraft für Forschung aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie das Experiment mit der Vorbereitung des Gels. Geben Sie 150 Milliliter 1x TAE 0,1 % SDS-Puffer in einen mikrowellengeeigneten Erlenmeyerkolben, um ein sechs Millimeter dickes Gel herzustellen, und fügen Sie 1,2 Gramm Agarosepulver hinzu.Erhitzen Sie den Kolben im Mikrowellenofen in Intervallen von 30 Sekunden unter intermittierendem Schwenken, bis das Agarose vollständig gelöst ist. Lassen Sie die Agaroselösung bis zu 10 Minuten abkühlen. Stellen Sie anschließend eine 10 mal 15 Zentimeter große Elektrophoresegel-Schale in einen Giegel. Gießen Sie die Agarose-Lösung langsam ein und setzen Sie die Kämme an die richtige Stelle. Entfernen Sie eventuell entstandene Blasen mit einer Pipettenspitze und lassen Sie das Gel anschließend abkühlen und erstarren. Sobald das Gel vollständig erstarrt ist, nehmen Sie den Kamm vorsichtig heraus, um ein Zusammenbrechen der Vertiefungen zu vermeiden, und nehmen Sie die Schale vom Giegel.Legen Sie das Gel in die Gelform und füllen Sie das Elektrophoresegerät, bis das Gel vollständig bedeckt ist. Geben Sie 10 % Lade-Farbstoff zu jeder Probe hinzu. Homogenisieren Sie die Proben durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren.Danach die Röhrchen kurz bei 5000 U/min abspinnen, um Tropfen zu sammeln. Anschließend Kolbendruckpipetten verwenden, um das Einbringen der hochviskosen Proben zu erleichtern. Langsam 80 bis 90 Prozent der Probe ansaugen, um das Anpipettieren von Blasen zu vermeiden.Laden Sie langsam von der Unterseite des Wells auf und bewegen Sie die Pipettenspitze schrittweise nach oben. Bei Proben, die an der Pipettenspitze haften bleiben, dosieren Sie in einem Winkel von 45 Grad ab und strecken Sie die Spitze direkt über dem Well nach oben oder lösen Sie den fadenziehenden Schleim vorsichtig an der Wand des Wells. Das genaue Befüllen viskoelastischer Proben kann schwierig sein, da Schleim von Natur aus an den Aufgabespitzen haftet.Außerdem kann die Auftriebskraft, die das Puffermedium auf den Schleim ausübt, das gesamte oder einen Teil des beladenen Volumens aus den Vertiefungen verdrängen. Führen Sie den Elektrophoresevorgang bei 80 Volt für 60 bis 75 Minuten für ein Doppelkamm-Gel durch, um eine Überlappung zwischen den beiden Reihen zu vermeiden. Nachdem das Gel eine ausreichende Strecke gelaufen ist, schalten Sie den Generator aus und trennen Sie die Elektroden von der Stromquelle.Entfernen Sie das Gel vorsichtig aus der Elektrophoresekammer, wobei Sie mit jeder Hand eine Seite des Gießrahmens festhalten, um sicherzustellen, dass das Gel an Ort und Stelle bleibt. Legen Sie das Gel vorsichtig flach in einen Glasbehälter. Spülen Sie anschließend das Gel mit destilliertem Wasser ab, um Rückstände von TAE-SDS-Puffer zu entfernen.Die Gel mit zuvor hergestelltem DTT-haltigem 4x SSC-Puffer durchtränken und das Gel abdecken. Anschließend das Gel vorsichtig bei 10 Umdrehungen pro Minute schütteln. Nach 20 Minuten Schütteln das Gel mit DTT-freiem 4x SSC-Puffer spülen.Bereiten Sie den Vakuumblotter für den Transfer vor, indem Sie die Nitrocellulosemembran etwas breiter als das Gel sorgfältig zuschneiden. Befeuchten Sie eine poröse Unterlage mit destilliertem Wasser und legen Sie sie glatte Seite nach oben in den Blotter. Befeuchten und platzieren Sie zwei Schichten Whatman-Papier in die Mitte der porösen Unterlage.Befeuchten Sie eine Nitrocellulose-Membran mit DTT-freiem 4x SSC-Puffer und legen Sie sie auf das Whatman-Papier. Bedecken Sie die poröse Unterlage mit einer Gummidichtung, wobei die Öffnung der Dichtung genau mit der Nitrocellulose-Membran ausgerichtet sein muss. Falls die poröse Unterlage weiterhin sichtbar ist, justieren Sie die Membran vorsichtig, um sicherzustellen, dass zwischen Dichtung und Membran kein Spalt verbleibt.Befeuchten Sie die Nitrocellulosemembran mit DTT-freiem SSC-Medium. Platzieren Sie das Agarosegel vorsichtig auf der Membran. Stellen Sie sicher, dass das Gel mit der Dichtung fest abschließt und die Vertiefungen des Gels zur Übertragung auf der Membran positioniert sind.Während des Proteintransfers darauf achten, dass zwischen dem Agarosegel und der Nitrocellulosemembran eine enge Verbindung besteht. Sobald das Gel auf der Membran platziert ist, das Gel weder bewegen noch justieren und es gut benetzt halten. Um die Bildung von Blasen zu minimieren, einige Tropfen 4x SSC-Puffer auf die Membran spritzen und das Gel von oben nach unten schieben, um eventuell entstandene Blasen herauszuspülen.Decken Sie das Gel vorsichtig mit 4x SSC-Puffer ab. Beginnen Sie die Mucin-Übertragung, indem Sie den Vakuumblotter für 90 Minuten einschalten. Geben Sie alle fünf bis zehn Minuten einige Tropfen 4x SSC-Puffer auf das Gel, um zu verhindern, dass es austrocknet.Nach Abschluss die Vertiefungen mit einem Bleistift zur Orientierung markieren. Das Gel entsorgen und die Nitrocellulosemembran mit einer Plastiktangente an ihrem Rand greifen. Die Membran sofort mit 1x Phosphat-gepufferter Kochsalzl&ouml;sung oder PBS sp&uuml;len.Die Membran in 15 Milliliter 3 %iger Milch-PBS-Blockierpufferlösung eintauchen und eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubieren. Nach der Inkubation den Blockierpuffer verwerfen. Anschließend die Membran in 1 %ige Milch-PBS-Primärantikörperlösung eintauchen und über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Schüttler inkubieren.Nach der Inkubation die primäre Antikörperlösung verwerfen. Anschließend die Membran mit PBS unter Schütteln waschen. Die Membran in einen undurchsichtigen Behälter überführen, in 1 % Milch-PBS mit sekundärer Antikörperlösung vollständig benetzen und die Membran eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubieren.Nach der Inkubation die Sekundärantik&ouml;rperl&ouml;sung verwerfen. Die Membran dreimal f&uuml;nf Minuten lang mit PBS waschen. Zum Schluss die Membran mit destilliertem Wasser sp&uuml;len, um Salz zu entfernen.Dieses Western Blot zeigt die Hochregulation der Muc5ac- und Muc5b-Proteine in Bronchoalveolärlavageflüssigkeiten von mit IL-13 behandelten Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen. Eine quantitative Analyse zeigt, dass die Hochregulation um das 5,1-Fache über der von mit PBS behandelten Mäusen lag. Zur Darstellung der Reduktion von Mukinpolymeren in Monomere nach Behandlung mit steigenden Konzentrationen von DTT wurde eine Mukin-Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Antikörperspezifität zu bestätigen, bevor ein bestimmtes Mucin untersucht wird. Bei der pharmakologischen Testung ist es wichtig, die Auswirkungen chemischer Reagenzien auf die Epitoperkennung zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie viskoelastische Proben manipuliert werden und wie der polymerische Zustand von Mucinen sowie deren relative Quantifizierung bestimmt wird.

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Mucin Agarose-Gel-Elektrophorese: Western Blotting für Hochmolekulare Glykoproteine

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