Implantations- und Aufzeichnung von Wireless-Elektroretinogramm und visuell evozierten Potenziale in wachen Ratten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, bewusste ERG- und VEP-Signale nach chirurgischer Implantation von drahtlosen Telemetriesonden zu messen. Diese Technik kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie sich Neuronen ohne die Einschränkung der Vollnarkose sowohl unter gesunden Bedingungen als auch im kranken Zustand verhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die gleichzeitige Aufzeichnung der Elektrophysiologie für die Netzhaut und für den visuellen Kortex bei bewussten Tieren ermöglicht.

Um diesen Vorgang zu beginnen, bereiten Sie die Elektroden unter einem Mikroskop vor. Drehen Sie dazu eine doppelsträngige Elektrode aus Edelstahl mit zwei Feinzangen auf. Schneiden Sie einen der Edelstahlstränge etwa einen Zentimeter von der Spitze entfernt ab und lassen Sie einen einzelnen längeren, geraden Strang übrig, um die Ringelektrode zu formen.

Falten Sie dann den einzelnen Edelstahlstrang wieder in sich hinein und drehen Sie ihn zu einem glatten Ring an der Spitze der Elektrode. Formen Sie als nächstes eine aktive ERG-Elektrode, indem Sie die Basis der Schlaufe zu einem Kreis mit einem Durchmesser von zwei bis fünf Millimetern drehen. Für die zwei inaktiven ERG- und eine VEP-Elektrode wird der Schleifendurchmesser auf acht Millimeter genau eingestellt.

Bereiten Sie in diesem Beispiel ein aktives ERG und drei inaktive Elektroden vor. Haken Sie danach die kreisförmige VEP-Aktivelektrode um eine Edelstahlschraube ein, so dass die Elektrode am Schraubenkopf anliegt. Haken Sie dann die drei inaktiven Elektroden um eine zweite Edelstahlschraube ein.

Die Erdungselektrode wird direkt in die Bauchhöhle eingeführt und es ist nicht erforderlich, eine Schlaufe an der Spitze zu machen. Nachdem Sie die Operationsstelle eines anästhesierten Tieres rasiert und desinfiziert haben, machen Sie mit einem chirurgischen Skalpell einen 10-Millimeter-Schnitt am Kopf entlang der Mittellinie zwischen den Ohren. Machen Sie dann einen fünf Millimeter großen Schnitt am Bauch durch die Hautschicht entlang der Mittellinie unterhalb des Brustbeins.

Danach tunneln Sie eine Kanüle mit einem Durchmesser von fünf Millimetern subkutan vom Bauchschnitt bis zum Kopfschnitt. Führen Sie die Elektrodendrähte des Tansmitters durch die Kanüle vom Bauch zum Kopf. Lassen Sie die Referenzelektrode bei der Senderbasis.

Decken Sie dann alle Elektrodenspitzen mit aseptischer Gaze ab. Befestigen Sie als Nächstes den Kopf der Ratte auf einer stereotaktischen Plattform. Verlängern Sie den Stirnschnitt mit einer chirurgischen Schere auf 30 Millimeter.

Legen Sie dann einen Operationsbereich frei, indem Sie die Haut mit zwei Nähten zurückziehen. Kratzen Sie das Periost über dem Schädel ab, um die Bregma-, Lambda- und Mittelliniennähte freizulegen. Bohren Sie anschließend zwei Löcher durch den Schädel an den stereotaktischen Koordinaten VEP aktiv und ERG, VEP inaktiv.

Befestigen Sie die aktiven und inaktiven Elektroden mit Edelstahlschrauben bis zu einer Tiefe von etwa einem Millimeter am Schädel. Um die aktiven ERG-Elektroden zu implantieren, verwenden Sie eine Naht, um das obere Augenlid vorübergehend zurückzuziehen. Führen Sie dann eine Kanüle von 16 bis 21 Gauge subkutan hinter dem Auge durch den Fornix conjunctival superior bis zur Stirn ein.

Sie anschließend die Führungsnadel. Führen Sie anschließend die aktive Elektrode durch einen Kunststoffkatheter von der Stirn in Richtung Auge. Entfernen Sie dann den Kunststoffkatheter.

Verwenden Sie eine provisorische Naht, die durch die Elektrodenschlaufe gefädelt wird, um zu verhindern, dass sich die Elektrode wieder in den Tunnel zurückzieht. Machen Sie danach einen Punkt fünf Millimeter scharf an der oberen Bindehaut einen Millimeter hinter dem Limbus. Verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um die darunter liegende Sklera freizulegen.

Implantieren Sie dann eine Naht unmittelbar hinter dem Limbus in halber Skleraldicke und achten Sie darauf, den Augapfel nicht zu punktieren. Entfernen Sie anschließend die provisorische Naht von der ERG-Aktivelektrode. Verankern Sie die aktive ERG-Elektrode an der Naht mit halber Skleraldicke, indem Sie drei aufeinanderfolgende Knoten binden, und stellen Sie sicher, dass sich die Elektrodenspitze in der Nähe des Limbus befindet, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen.

Ziehen Sie ggf. das überschüssige Elektrodenkabel zurück, damit die aktive Elektrode nicht auf die Hornhaut trifft. Schließen Sie dann den Bindehautlappen mit ein bis zwei unterbrochenen Nähten, um die ERG-Elektrode vollständig zu bedecken. Entfernen Sie anschließend die Naht zum Zurückziehen des Augenlids.

Wiederholen Sie den Vorgang für das kontralaterale Auge. Tragen Sie nun Cyanacrylat-Gel auf den Schädel auf, um alle Edelstahlschrauben und Elektrodendrähte zu sichern. Stellen Sie sicher, dass die aktiven ERG-Elektroden nicht fest gezogen werden, bevor sie gesichert sind, um Augenbewegungen zu ermöglichen.

Schließen Sie anschließend den Schnitt mit unterbrochenen Nähten. Drehen Sie dann das Nagetier, um den Bauchbereich freizulegen. Verlängern Sie den Bauchhautschnitt mit einer chirurgischen Schere auf 40 Millimeter entlang der Linea alba.

Machen Sie danach einen 35 Millimeter großen Schnitt durch die innere Muskelwand, um die innere Bauchhöhle freizulegen. Befestigen Sie den Senderkörper mit zwei Nähten rechts an der inneren Bauchdecke des Tieres und vermeiden Sie den Kontakt mit der Leber. Falten Sie die Masseelektrode, indem Sie sie mit zwei Nähten in einer Schlaufe befestigen und legen Sie sie frei schwebend zusammen mit den anderen Elektrodenleitungen in die Bauchhöhle.

verschließen Sie das Bauchfell mit einer durchgehenden Naht. Schließen Sie dann den Hautschnitt mit unterbrochenen Nähten. Für die Aufzeichnung von dunkeladaptierten Signalen werden die Tiere 12 Stunden lang dunkeladaptiert und alle Eingriffe werden in einem dunklen Raum mit Hilfe von schwachem rotem Licht durchgeführt.

Zur Veranschaulichung werden hier Aufnahmen unter normalen Raumlichtverhältnissen durchgeführt. Tragen Sie vor der Aufzeichnung eine topische Anästhesie und erweiternde Tropfen auf die Hornhaut der Ratte auf. Führen Sie als Nächstes das bewusste Tier in einen individuell angefertigten, durchsichtigen Rückhaltebehälter.

Lege die Ratte vor die Ganzfeld-Schüssel, wobei die Augen auf die Öffnung der Schüssel ausgerichtet sind. Schalten Sie den Verweilsender ein, indem Sie einen Magneten in einem Abstand von fünf Zentimetern an ihm vorbeiführen. Überprüfen Sie, ob der Sender eingeschaltet ist, indem Sie die LED-Statusleuchte an der Empfängerbasis überprüfen.

Schließen Sie den Faradayschen Käfig, in dem sich das Empfängerpad befindet, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Sammeln Sie dann Signale über einen Bereich von Lichtenergien. Diese Abbildung zeigt, dass sich die ERG-Welle bei bewussten Ratten am siebten Tag nach der Operation bildet.

Die ERG-Antworten wurden auf den Bereich der Stimulusenergie aufgezeichnet, wobei die Reaktion auf den schwachen Blitz unten und der hellste Blitz oben gezeigt wurde. Am 28. Tag nach der Operation blieben diese Wellenformen ähnlich wie am siebten Tag. Über vier Wochen gab es keinen signifikanten Zeiteffekt für die Photorezeptoramplitude und -empfindlichkeit.

Amplitude und Empfindlichkeit der bipolaren Stäbchenzelle. Amplitude der bipolaren Zelle des Kegels. Und implizite Zeit.

In ähnlicher Weise scheinen VEP-Wellenformen sieben und 28 Tage nach der Operation vergleichbar zu sein. Mit Amplituden- und Timing-Parametern, die keinen signifikanten Zeiteffekt zeigen. Diese Ergebnisse deuten auf eine robuste Stabilität des ERG- und VEP-Signals hin.

Sobald die Technik gemeistert ist, wird die chirurgische Komponente der Technik in eineinhalb bis zwei Stunden abgeschlossen sein. Die bewusste Aufzeichnungskomponente kann, wenn sie richtig vorbereitet wird, in 45 Minuten abgeschlossen werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können auch andere Methoden wie pharmakologische oder Krankheitsmanipulation durchgeführt werden.

Dies wird zusätzliche Fragen in der Wirkstoffforschung sowie in der Chronik von Längsschnittexperimenten beantworten. Zusätzlich kann dieses Verfahren bei Bedarf auch bei anderen Tieren durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie bewusste ERG- und VEP-Telemetriesignale chirurgisch implantieren und anschließend messen können.