Verbesserte Schweizer Walztechnik für Darmgewebepräparation zur immunhistochemischen und Immunofluoreszenz-Analysen

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, lange Schnitte des Darmgewebes von Mäusen effizient zu bearbeiten, um eine einheitliche histologische Färbung entlang seiner Länge zu ermöglichen. Um die Darmabschnitte zu erhalten, kann es zu Schwankungen in der Färbung über die gesamte Länge des Darms kommen. Ich habe versucht, die Standard-Schweizer Rolltechnik zu verwenden, fand aber, dass sie Darmgewebe ergibt, das sehr steif und nicht leicht zu öffnen ist.

Nach einigem Experimentieren habe ich eine schnelle Fixierungsmethode entwickelt, die weniger giftige Chemikalien verwendet und ein viel besseres Schweizer Rollen des Darmgewebes ermöglicht. Das modifizierte Fixiermittel kann verwendet werden, um andere dicke Gewebe schnell zu fixieren. Zur Vorbereitung das Versuchstier gemäß dem Textprotokoll einschläfern und die chirurgische Einstellung vorbereiten.

Machen Sie zunächst mit einer Präparierzange und einer Schere einen seitlichen Schnitt in die Mitte des Bauches, je nach Größe der Maus, etwa ein bis zwei Zentimeter unterhalb des Brustkorbs. Ziehen Sie dann die Haut vorsichtig auseinander und schneiden Sie sie weg, um die Bauchmuskeln freizulegen. Als nächstes greifst und ziehst du an den Muskeln hoch, ohne am Darm zu halten oder zu ziehen.

Machen Sie dann vorsichtig einen ersten Schnitt in die Bauchmuskeln und schneiden Sie sie vorsichtig durch, um den Darm freizulegen. Identifizieren Sie nun den Dickdarm und verfolgen Sie ihn bis zu seinem distalen Ende, wo er mit dem Rektum zusammentrifft. Dann wird der Dickdarm mit einer Schere so nah wie möglich an der Analöffnung durchtrennt.

Finden Sie als Nächstes heraus, wo der Magen mit dem Dünndarm zusammentrifft, und schneiden Sie mit einer Schere den Darm etwa einen Zentimeter vom Magen entfernt frei. Übertragen Sie nun die gesamte Länge des freien Dünndarms und des Dickdarms in eine saubere Petrischale, die PBS enthält. Sichern Sie dann das distale Ende des Dickdarms und entwirren Sie vorsichtig die gesamte Länge des Dickdarms, indem Sie anhaftendes Mesenterialgewebe entfernen.

Identifizieren Sie dann den Blinddarm und durchschneiden Sie den Darm, wo der Blinddarm mit dem Dickdarm zusammentrifft, und isolieren Sie so den Dickdarm. Auf ähnliche Weise entwirren Sie den Rest des Dünndarms aus dem anhaftenden mesenterialen Binde- und Fettgewebe. Durchschneiden Sie dann den Dünndarm, wo er sich mit dem Blinddarm verbindet.

Der Blinddarm kann dann entfernt und entsorgt werden. Füllen Sie nun eine 10-Milliliter-Spritze mit modifiziertem Bouin-Fixiermittel und befestigen Sie eine Sondennadel. Führen Sie die Nadel etwa einen halben Zentimeter in die vordere Öffnung eines Darmsegments ein.

Während Sie die Sondennadel fest im Segment fixieren, spülen Sie den Inhalt des Gewebes langsam mit Fixiermittel aus. Seien Sie vorsichtig, da zu viel Druck das Segment platzen lässt. Wenn der Dünndarm zu lang aussieht, um ihn zu handhaben, solltest du ihn zuerst in drei gleiche Segmente schneiden und jedes Segment separat spülen.

Durch die Fixierung wird die Farbe des Darmsegments undurchsichtig. Schneiden Sie dann mit einer Schere das Segment in Längsrichtung entlang der Mesenteriallinie und spülen Sie das Segment dann kurz in einer Schale mit PBS ab, während Sie es mit einer Pinzette offen halten. Schneiden Sie nun den Dünndarm in drei gleich große Segmente, proximal, mittel und distal, die in etwa dem Zwölffingerdarm, dem Jejunum und dem Ileum entsprechen.

Makroskopisch gesehen gibt es keine differenzierten Merkmale für jeden Abschnitt. Achten Sie darauf, eine Markierung zu machen, um das proximale vom distalen Ende auf jedem Segment zu identifizieren. Lege dann ein Segment mit der Lumenalseite nach oben auf den Deckel einer Petrischale.

Auf dem Dickdarmsegment erkennen Sie die Lumenalseite an den Leisten, die am proximalen Ende über ihre Breite verlaufen. Der mittlere und distale Bereich weisen einige Panaschierungen auf, die in Längsrichtung verlaufen. Am Dünndarm erkennen Sie die lumenale Seite an der raueren Oberfläche, die die Zotten markiert.

Die mikroskopische Untersuchung zeigt, dass die Zotten in den proximalen Regionen jedes Segments am längsten sind, während die Dickdarmkrypten in den proximalen Regionen am kürzesten und im mittleren Abschnitt am höchsten sind. Fahren Sie mit dem Schweizer Rollen des Dickdarms fort. Ziehe den Dickdarm flach offen und die Lumenalseite nach oben, ziehe ihn mit einer Pinzette von seinem proximalen Ende zum Rand der Petrischale.

Halten Sie die Lumenalseite nach oben, halten Sie das proximale Ende mit der Pinzette fest und wickeln Sie den Rand des proximalen Endes um einen Zahnstocher und drücken Sie den umwickelten Rand fest gegen den Zahnstocher. Rollen Sie dann den Dickdarm vorsichtig und langsam um den Zahnstocher herum, sodass eine Schweizer Rolle entsteht. Sobald die gesamte Dickdarmlänge aufgerollt ist, schiebe die Rolle mit einer weiteren Pinzette vorsichtig in eine Gewebeverarbeitungskassette.

Dann die Kassette in 10 Prozent gepuffertes Formalin überführen und über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Um ein Dünndarmsegment zu rollen, öffnen Sie es mit der Lumenalseite nach oben und ziehen Sie es mit einer Pinzette von seinem proximalen Ende zum Rand einer Schale. Dann die gleiche Technik wie beim Doppelpunkt verwenden, um die Schweizer Rolle herzustellen und in Formalin zu fixieren.

Mit den beschriebenen Methoden wurden bei der HND-Färbung des Dickdarms einer C57 Black 6 Maus alle Teile des Dickdarms für eine umfassende histologische Beurteilung freigelegt. Als nächstes wurde das Präparat für Mäuse verwendet, die EGFP exprimierten, das vom LGR5-Promotor angetrieben wurde, der nur in der Peripherie von Darmkrypten aktiv ist. Dieses EGFP-Transgen hat nur eine Penetranz von etwa 5 bis 10 Prozent, aber interessante Regionen könnten leicht gefunden werden.

Unter Verwendung der gleichen Mäuse mit EGFP LGR5-Expression wurden KLF5 und KI67 gefärbt. Erste Kontrollmäuse mit normaler LGR5-Expression wurden untersucht. EGFP-positive Zellen sind mit blauen Pfeilen und EGFP-negative Zellen mit weißen Pfeilen gekennzeichnet.

Dann wurden die gleichen Transgene in einer KLF5-Knockout-Maus exprimiert. Die Co-Färbung von KLF5 und KI67 fehlt in EGFP-positiven Stammzellen, bleibt aber in EGFP-negativen Krypten vorhanden. Offensichtlich ist die Qualität des Präparats für die Multi-Fluoro-Kraftfärbung sehr gut.

Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie in etwa 15 Minuten pro Maus durchgeführt werden, wenn Sie sowohl den Dünndarm als auch den Dickdarm sammeln. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem Fixiermittel von Bouin für die Augen äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer Vorsichtsmaßnahmen wie ein angemessener Augenschutz getroffen werden.

Vielen Dank fürs Zuschauen und guten Blick bei Ihren Experimenten.